干细胞诱导分化为RPE细胞的方法学研究进展

1、干细胞诱导分化为 rpe 细胞的方法学研究进展#徐永胜1,3，党亚龙1，俞海燕1，吴文涛1，黄琛2,3，王薇3，张纯1,3*51015（1. 北京大学第三医院临床干细胞中心，北京 100191；2. 北京大学第三医院中心实验室，北京 100191；3. 北京大学第三医院眼科，北京 100191）摘要：视网膜退行性疾病是引起老年人群不可逆致盲的眼病之一，其特征是视网膜神经细胞的进行性死亡。rpe 细胞是构成视网膜色素上皮层的最重要细胞，具有重要的生理功能。rpe 功能或数量异常是多种视网膜退行性病变的原因，如：amd，stargard 病，best 病等。使用健康的 rpe 细胞替代疾病状态下的

2、 rpe 细胞已经成为治疗视网膜退行性疾病的方法之一。细胞生物学的进展使我们成功应用不同来源的干细胞分化为具有正常功能的 rpe 细胞并应用于不同的疾病模型，提高了受试动物的视觉质量。然而，不同来源的干细胞诱导分化为 rpe细胞的方法、时间、效率及移植策略均有所不同，本文将着重从方法学的角度阐述干细胞分化为 rpe 的最新进展。关键词：干细胞；视网膜色素上皮；诱导分化；方法学研究中图分类号：r-77320recent advances in stem cell-based rpe differentiationxu yongsheng1,3, dang yalong1, yu haiyan1,

3、 wu wentao1, huang chen2,3, wangwei3, zhang chun1,3(1. clinical stem cell center, peking university thrid hospital, beijing 100191;253035402. medical research center,ophthalmology, peking university thrid hospital, beijing 100191;3. department of ophthalmology, peking university thrid hospital, beij

4、ing 100191)abstract:are the leading causes of irreversible visual impairment of aged people in the current world.retinal pigment epithelium cell is the most important component in the outer retina. there areseveral crucial functions in rpe cell, so reducing the cell number or dysfunction leads to re

5、tinaldegeneration, such as amd and stargards disease. nowadays, cell transplantation has apromising prospect in the treatment of retinal degeneration. recently, it is demonstrated thatretinal pigment cells may be generated from the stem cells by defined factors or cell co-culturing.studies also show

6、ed cell transplantation may restore visual function in vivo. this review willfocus on recent advances in stem cell-based rpe differentiation and the obstacles that must beovercome in this area.key words: stem cell; retinal pigment epithelium cell; induced differentiation; methodologyresearch0 引言视网膜退

7、行性疾病已经成为发达国家和发展中国家老年人群不可逆的致盲性眼病之一，发病率逐年上升1-4。这类疾病的共有特征是视网膜神经细胞的进行性死亡。rpe 细胞是构成视网膜色素上皮层的最重要细胞，来源于神经外胚层，在视网膜发育的早期从视网膜前体细胞分化而来，具有重要的生理功能： 吞基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金（编号：20100001120100）作者简介：徐永胜（1979-），男，助理研究员，主要研究方向：干细胞诱导分化. xys1214-1-455055噬感光细胞外节，维持正常的视循环； 维持视网膜外屏障； 细胞内含有黑色素，维持“暗室效应”，参与视觉成像； 分泌细胞因子，维持内环境

8、稳态。rpe 功能或数量异常是多种视网膜退行性病变的原因，如：amd，stargard 病，best 病等。因此，使用健康的 rpe 细胞替代疾病状态下的 rpe 细胞已经成为治疗视网膜退行性疾病的方法之一。随着细胞生物学的进展，我们已经成功应用不同来源的干细胞分化为具有正常功能的 rpe 细胞并应用于不同的疾病模型，提高了受试动物的视觉质量。然而，不同来源的干细胞诱导分化为 rpe 细胞的方法、时间、效率及移植策略均有所不同，本文将着重从方法学的角度阐述干细胞分化为 rpe 的最新进展。1 胚胎干细胞分化为 rpe 细胞胚胎干细胞具有三个胚层的分化潜能，在不同的诱导条件下，es 可以分化为除

9、滋养层细胞以外的所有细胞类型，包括 rpe 细胞。按照不同的诱导策略，大致可分为以下 7 类。胚胎干细胞具有三个胚层的分化潜能，在不同的诱导条件下，es 可以分化为除滋养层细胞以外的所有细胞类型，包括 rpe 细胞。按照不同的诱导策略，大致可分为以下 7 类。601.1自然分化法在不添加任何诱导剂的情况下，约有 1%的人胚胎干细胞(human embryonicstem cell, hesc)可自动分化为 rpe 前体细胞（图 1），经过手工分选、扩增及培养，可以得到典型的色素化鹅卵石外观的 rpe 细胞5。免疫学染色显示其具备成熟 rpe 的标记，将这些细胞移植到模型大鼠视网膜下，发现：移植

10、的细胞具有6570一定极性，能与宿主的光感受器整合，并能吞噬脱落的光感受器外节，维持大鼠的视功能5-6。研究还发现：宿主眼内无畸胎瘤及其他的病理性变化7。该方法分化效率很低，但由于没有添加诱导剂及导入潜在的致病基因等，美国 fda 批准其为 good manufacturing practices(gmp)标准用于 i/ii 期临床试验7。图 1. es 分化为视网膜细胞示意图(osakada f, et al., 2009)fig. 1 schematic diagram of human es cells differentiation into retinal cells (osakad

11、a f, et al., 2009)-2-1.2sdia 法2000 年，kawasaki h 等8发现在无血清的条件下，小鼠 pa6 基质细胞能够诱导 mesc 分化为中脑多巴胺能的神经元，他将这种方法命名为：基质细胞诱导7580法(stromal cell derived inducing activity, sdia)。2002 年，他用 sdia 法研究灵长类动物的 esc 时，他惊讶的发现约有(8%4%)的色素化细胞，这些细胞可以在pa6 基质细胞或者明胶包被的培养皿上扩增并且表达视杯特异性标记 pax69 ,进一步鉴定为 rpe 细胞。2004 年，他对 sdia 法得到的 rpe

12、 细胞进行了蛋白标记、吞噬功能实验及 rcs 大鼠的视网膜下腔移植实验，证实：这些移植的细胞能够促进宿主光感受器细胞的生存10。该法的优点是没有添加外源性的诱导剂，但是存在 pa6 基质细胞污染的可能。另外，sdia 法未报道能诱导出光感受器样细胞，因此临床应用前景有限。1.3sfeb 及其衍生的方法2005 年 ikeda h 等11应用 mesc 无血清拟胚体(serum-free embryoid body-like,859095100105sfeb)悬浮培养，发现 dkk1(d)+leftya(l)+ fetal bovine serum (f)+activin a(a)等能够诱导 m

13、esc 分化为 rx+/pax+的视网膜前体细胞，但这些前体细胞进一步分化为成熟视网膜光感受器细胞效率极低（约 0.5%），共培养可以显著提高光感受器细胞的分化效率。随后，该团队对比了 sfeb, sfeb/dl, sfeb/dlfa 三种方法的诱导效率，发现：第 15 天 sfeb/dl 约(18.1%4.1)%的细胞 rx+/pax+，其次为 sfeb/dlfa(8.26%1.2%), sfeb(5.56%5.6%)12。由于 sfeb 条件下，第 12天 mift+的 rpe 前体细胞即不表达 rx11，因此 sfeb/dl 是诱导光感受器前体细胞效率最高的方法。获得 rx+/pax+的

14、视网膜前体细胞后，如何获得成熟的光感受器细胞成为亟待解决的问题。由于在 sfeb/dlfa 条件下，仅有约 0.5%的细胞最终表达光感受器特有标记，这提示在向光感受器细胞分化的过程中，还有其他信号通路未被激活。2008 年，基于组织培养和动物实验13-14，osakada f 等人发现notch 通 路 可 能 调 节 rx+ 细 胞 进 一 步 分 化 。 通 过 外 源 性 添 加 的n-n-(3,5-difluorophenacetyl)-l-alanyl-s-phenylglycine t-butyl ester (dapt)，可以使 22.4%2.9%的 rx+的细胞分化为 crx+

15、的光感受器前体细胞。另外，他还发现：islet1+/pax6+（神经节细胞）分化效率也显著提高，但 mift+/pax+的色素上皮细胞分化效率未受到影响。进一步研究，在 sefb/dl/dapt 下继续诱导：rx+/crx+的光感受器前体细胞分化为两种视锥细胞（红绿视蛋白阳性、蓝色视蛋白阳性）的效率为 11.5%2.0%和 10.7%1.6%，分化为视杆细胞的效率为 5.5%0.5%。为了获取较多的视杆细胞，osakada f 尝试了几种有利于视杆细胞分化的细胞因子组合，他发现 afgf(50ng/ml), bfgf(10ng/ml), taurine(1mm), retinoic acid(

16、ra,500nm)能够显著促进 rx+/crx+细胞向视杆细胞分化(17.2%+1.8%)，并表达标记蛋-3-白 rhodopsin。2009 年，osakada f 等15进一步总结 sfeb/dlfa 法，制定了mesc/hesc 分步诱导为视网膜细胞的标准流程（图 2）。不足的是，sfeb 法及其改良方法诱导产生的光感受器前体细胞整合到宿主视网膜的能力较低16，主要原因：1. sfeb 法诱导产生的视网膜前体细胞比例低；1102. 虽然 sfeb 法模拟了视网膜发育的过程，但所得细胞发育较为成熟，自身的整合能力较差17。图 2. es 分化为 rpe 细胞示意图(osakada f, e

17、t al., 2009)fig. 2 schematic diagram of human and mouse es cells differentiation into rpe cells (osakada f, et al., 2009)1151.4小分子诱导法尽管 sfeb/dlfa 法在诱导 esc 向视网膜细胞方面取得了一定成绩，但需应用动物细胞来源或者 e.coli 来源的重组蛋白，这显然可能造成污染或者种属间的免疫排斥反应。因此，化学小分子诱导成为一种较为理想的办法。小分子诱导具120125有以下优点：第一、属于非生物制品，不同的批次和厂家之间差异较小，具有稳定的生物活性；第二、

18、价格相对低廉，有助于普及应用。osakada f 等18发现在sfeb 条件下，外源性添加 wnt 抑制剂 cki-7 和 nodal 抑制剂 sb-431542 能够获得(26.0%4.0%)的 rpe 克隆和(18.1%1.9%)的 rpe 细胞，这与 sfeb/dl 诱导结果没有统计学差异，这些细胞具备成熟 rpe 的形态、蛋白标记和吞噬能力。osakada f 等18还发现：小分子诱导光感受器细胞的比率及基因表达水平上与经典的 sfeb/dl/ra/ taurine 法无显著差异。因此，小分子诱导法是一种很有潜力的视网膜细胞诱导方法。1.5视网膜决定(retinal determina

19、tion, rd)法与 sefb/dl 法原理类似，rd 法的依据是：1. 骨形成蛋白(bone morphogenetic130proteins, bmp)信号通路和 wnt 信号通路能够抑制前脑神经元的发育，阻断 bmp,wnt 能够促使 esc 发育为前脑前体细胞19-24；2.胰岛素样生长因子(insulin-likegrowth factors-1 , igf-1)能促进成视网膜诱导。lamba d 等25应用 noggin(bmp-4-通路抑制剂)、dkk1(wnt/-catenin 通路抑制剂)和 igf-1 在 sfeb 条件下培养 3天，然后贴壁继续上述诱导。135与 sef

20、b/dl 法相比，rd 法具有显著的优点：1. 3 周后，rd 法可以得到高达(82% 23%) pax+的视网膜前体细胞，其中 86%的细胞也表达 chx10。2. rd 法的显著特点更在于它能够缩短“视网膜发育”的时间: rd 法 es 分化 3 周与胎儿视网膜 91 天的基因表达特征类似。3. 经过 rd 法诱导所得的视网膜前体细胞移植到 crx-模型鼠的视网膜下可以改善宿主的视功能26。1401.6神经球团(spherical neural masses, snms)分选法2008 年，cho ms 等人发现27：eb 形成后经过神经前体细胞选择及扩增，可以得到 snms（图 3）。s

21、nms 具有以下特点：1.经历长时间的传代（至少 120天）不丧失分化为多巴胺能神经元的特定；2. 短时间内（14 天）就能分化为较高比例（约 86%）的多巴胺能神经元；3. 不需要滋养层细胞的存在。在纯化的145150snms 的时候，cho ms 等人发现28：大约有 5%左右的开放神经管来源的囊泡不是多巴胺能神经元的前体，这些囊泡的表达视网膜前体的标记 pax6。这些囊泡样贴壁培养后，仍能保持 pax6+，且大部分细胞呈现色素化、单层多角形的 rpe细胞外观，免疫荧光染色提示：mift+/pax+/rpe65+/chx10+/bestrophin+/cralbp+。snms 法具有以下优

22、点：1. 没有外源性添加诱导剂，避免了污染和免疫反应的可能；2. snms 来源 rpe 细胞更接近人体内 rpe 产生过程；3. snms 缩短了从 esc转化为 rpe 的时间。图 3. es 分化为 rpe 细胞 snms 方法示意图(cho my, et al., 2012)fig. 3 schematic diagram of human es cells differentiation into rpe cells by snms methods(osakada f, et al., 2009)1551.73d 神经上皮培养2011 年，eiraku m 等29应用 sfeb 法在

23、 matrigel 构建的 3d 培养体系内成功模拟了视网膜发育的过程（图 4）。随后，zhu y 等30人利用 matrigel 构架的 3d-5-体系联合神经诱导，第 5 天得到了具有极性结构的神经上皮。这些神经上皮细胞在 actvin a 存在的情况下 30 天之内分化为 rpe 细胞并能有效整合在模型动物的160165170rpe 层。该研究强调了 actvin a 在 rpe 生成中的重要作用，缩短了诱导分化 rpe所需的时间。图 4. es 分化为 rpe 细胞 3d 方法示意图(eiraku m, et al., 2011)fig. 3 schematic diagram of

24、es cells differentiation into rpe cells by 3d methods(osakada f, et al., 2009)2 诱导多能干细胞分化为 rpe 细胞2006 年，yamanaka 等人31报道小鼠成纤维细胞可以诱导成为 es 样的细胞，命名为：诱导多能干细胞。ips 具有 esc 类似的形态和功能，在不同的诱导条件下能够分化为三个胚层的细胞。ips 还具备独特的优点：1. 来源广泛；2. 理论上无免疫原性：由于 ips 来源于自身的成熟体细胞，利用 ips 分化而来的细胞进行细胞移植时可以避免种属或者个体间的排斥反应；3. 无伦理学争议；4. ip

25、s 还可以构建疾病模型及测试药物。-6-与 esc 类似，ips 具备分化为 rpe 及光感受器细胞的能力。ips 来源的 rpe表达成熟 rpe 的蛋白标记，具备吞噬能力，ips 来源的 rpe 已经成功的移植到模型动物并发挥功能32-37。175180185190195200尽管用于诱导 esc 的各种方法大多适合 ips 的诱导，但不同的 ips 细胞系间仍存在较大差异。hirami y 报道12，在完全相同的诱导条件（sfeb/dl）下，201b7细胞系和 253g1 细胞系可以诱导分化为 rpe 细胞，而 201b6 细胞系则不能。在蛋白表达上，在向 rpe 分化的第 6 天 mes

26、c 即可发现 rx+/pax+细胞，但部分 ips细胞系则需要 15 天。这可能与 ips 本身基因组特性有关，但也可能与培养环境及分化程度有关。ips 虽然有各种优点，但缺点同样不可忽视。第一、ips 来源于患者，所以可能携带致病基因。只有当致病基因被修复后，ips 诱导所得的细胞才能安全的移植入受体38。第二、ips 潜在的致瘤风险。hirami y 12发现，在 ips 分化的第 15天，仍有 0.60%0.04%的细胞 nanog+。3 间充质干细胞分化为 rpe 细胞尽管 rpe 细胞来源于神经外胚层，但间充质干细胞(mesenchymal stem cells,mscs)具备跨胚层

27、分化的能力。据报道39：应用光感受器外节和 rpe 细胞条件培养基能够诱导 mscs 分化为具备形态和吞噬功能的 rpe 细胞。另外，在特定条件下 mscs 还可在受损的视网膜内进一步分化，部分转化为rpe 样细胞。gong l等40对碘酸钠诱导的 rpe 损伤大鼠视网膜下注射 bm-msc，5 周后发现：bm-msc 可以转化为 rpe, 光感受器及胶质细胞。tomita m 等41发现：mscs 能够迁徙至机械损伤大鼠的视网膜内（主要是内核层），转化为表达 gfap, calbindin, rhodopsin, vimentin 的视网膜神经细胞。castanheira p 等42对激光损

28、伤模型大鼠的玻璃体腔内注射 mscs：经过 8 周，大多数 mscs 已经迁徙至神经节细胞层、内核层和外核层，这些细胞表达光感受器细胞、双极细胞、无长突细胞、穆勒胶质细胞的标记。4 视网膜干细胞(retinal stem cells, rscs) 分化为 rpe 细胞鱼类和两栖类动物的 rscs 存在睫状体边缘带（ciliary marginal zone，cmz），当视网膜受损时，cmz 能够不断产生新的神经元。成熟的哺乳类动物的视网膜缺乏再生能力，但tropepe v43等发现成熟小鼠的 cmz 细胞具备增殖及分化为视网膜神经元（视杆细胞、双极细胞）及神经胶质细胞的能力，他认为这类细胞是r

29、scs。aruta c 等44在分离 rscs 的基础上，添加亚油酸、亚硒酸、胰岛素、转铁蛋白、甲状腺素等诱导因子成功将 rscs 诱导分化为具有极性和吞噬功能的rpe 样细胞。然而，哺乳类 rscs 存在与否备受争议。cicero sa等45认为来源于-7-205210215220cmz 的 rscs 实际上是睫状体上皮细胞。他从分子、细胞及形态学特征上证实这些细胞与分化的睫状体上皮细胞无明显差异。他还认为已分化的细胞也可以形成克隆球、自我更新、表达前体细胞的标记等。gualdoni s等46发现所谓的 rscs在光感受器细胞分化培养基内并不能活化 nrl（光感受器细胞分化的关键基因）。另外

30、，mller 细胞曾被视为视网膜干细胞。bernardos rl 等47报道，斑马鱼的 mller 细胞能够低水平的表达 pax6（视网膜前体细胞的标记）和 crx(光感受器细胞的标记)。song wt 等48发现：atoh7（notch 通路抑制剂）能够促使 mller细胞转化为视网膜神经节细胞。mller 细胞由神经视网膜前体细胞发育而来，而且分化的最晚（神经视网膜发育顺序依次是：视网膜神经节细胞、视锥细胞、无长突细胞、水平细胞、视杆细胞、双极细胞和 mller 细胞），而 rpe 前体细胞与神经视网膜前体细胞分层发育发生在胚胎早期。因此，mller 发育为 rpe 细胞的难度很大。5 小

31、结尽管干细胞分化为 rpe 细胞已经成为现实，但以下几个问题仍需要进一步研究： 分化效率：现有诱导模式下，rpe 分化效率都偏低，一般在 20%以内。如何提高 rpe 诱导效率是一个亟待克服的难题； 分化时间：人源的 rpe 从诱导到成熟大约需要 120 天左右。如何缩短诱导时间是 rpe 诱导的另一个重要课题； rpe 纯化：现有诱导方法得到的细胞均为混合细胞，如何除去未分化细胞和收获成熟的 rpe 细胞关系到活体移植的安全性，因此也是一个需要特别注意的问题。225参考文献 (references)1 friedman ds, ocolmain bj, muoz b, et al. eye

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