女性上生殖道微生物群特征及其对生殖与辅助生殖的影响

1、2020年女性上生殖道微生物群特征及其对生殖与辅助生殖的影响人体微生物群是指存在于人体内部和表面的微生物的总体。据估计， 人体内部和表面的细菌数量与构成人体的总细胞数具有相同的数量级1 -2 随着人类基因组计划(Human Genome Project , HGP ) 的完成，第二个人类基因组计划这一概念又被提出，2007年美国国 立卫生研究院(NIH )发起了人类微生物组计划(Human Microbiome Project , HMP )，对正常健康志愿者身体不同部位的微生物组进行 特征分析，其中就包括女性阴道3 。过去10年中，针对人体不同 器官微生物群的硏究成为热点，人们对于微生物群在

2、人类健康中作用 的认知也不断加深，微生物群失调或失衡与疾病的发生有关。越来越 多的证据表明，女性生殖道微生物群改变可能影响生殖健康。既往较 多硏究集中在阴道微生物群对生殖的影响4-5 ,而对定植于宫腔、 输卵管、卵巢等部位的微生物组成的女性上生殖道微生物群硏究较少。 近年来随着技术的进步，尤其是基于测序的细菌检测方法的应用,有 关上生殖道微生物群的文献逐渐增加。本文对上生殖道微生物群的硏 究现状进行综述，阐述上生殖道微生物群常用研究方法、上生殖道微 生物群的特征及其对生殖和辅助生殖的影响。1上生殖道微生物群研究方法基于目前已发表的文献，用于微生物群硏究的主要技术有2种，即培 养法和非培养法，亦

3、即基于培养的技术和基于测序的技术。1.1 基于培养的技术 早期对于生殖道微生物群的硏究多数采用 基于培养的技术。将标本接种在不同培养基上，生长一段时间后根据 革兰染色特征、细胞形态、细菌代谢产物及生化反应试验等对细菌进 行鉴别。但硏究发现,由于培养条件不满足或一部分菌种对另一部分 的抑制，大多数微生物生态系统中只有一小部分细菌能在实验室中繁 殖，而培养成功是后续研究分析的先决条件，因此基于培养的技术会 大大降低所研究微生物群的多样性6-7 。虽然基于培养的技术在 微生物群硏究方面仍不失为一种基础而有效的手段，但对于其所得数 据的阐述和分析需考虑到这种局限性。1.2 基于测序的技术 第一个细菌基

4、因组测序在1995年完成 8,此后细菌脱氧核糖核酸（DNA ）数据库迅速发展,如今的技术可以对一个样本中的数百万种细菌DNA序列进行分析。细菌DNA 测序技术克服了培养法的不足,传统上难以培养或不可能培养的细菌 因此得以检测，为微生物群的硏究带来突破，其中16S rRNA基因测 序是近年应用最广泛的技术。16S rRNA是原核生物核糖体30S小亚基的组成部分，其对应的DNA 序列即为16S rRNA基因，长度约1540 bp ,为原核生物所特有，存 在于所有细菌和古细菌的基因组中。16S rRNA基因测序技术的理论 基础在于其包含10个保守区和9个高变区（V1 V9 ）,两者呈交替 排列，保守

5、区为进化较慢的区域，可用于设计通用引物，而高变区为 进化较快区域，其变异程度与细菌的系统发育密切相关，通过对一个 或多个高变区扩增测序，可以在属甚至种的水平对细菌进行鉴定9 o微生物组硏究的主要流程包括样品收集和储存、DNA提取和 纯化、目标片段聚合酶链式反应（PCR ）扩增和测序、数据清理以及 分析等10 。与阴道微生物群取样相比，上生殖道取样过程更复杂， 且通常为有创操作。子宫内膜微生物群取样途径主要有3种，即经子 宫颈取样、腹腔镜或开腹手术中通过子宫微小切口或经子宫底穿刺针 吸取样门以及从子宫切除标本中对子宫内膜直接取样12 ，其 中经子宫颈取样适用人群最广泛，但需尽量避免来自阴道或子宫

6、颈的 污染。常用的方法有：人工授精（IUI）导管吸取子宫内膜液13 、 子宫内膜拭子14 、通过特殊的子宫内膜取样器取样（如Tao Brush , 在取样刷进入或退出宫腔的过程中，有保护鞘覆盖以避免宫颈或阴道 污染）15 或直接利用胚胎移植后导管顶端部分16 。有研究比 较了腹腔镜或开腹手术中通过子宫微小切口所得子宫内膜样本和经子 宫颈所取子宫内膜样本，发现两者的细菌分布具有很高的相似性,由 此认为对于非手术患者，经子宫颈取样分析子宫内膜微生物群是可以 接受的11 。输卵管微生物群取样方法主要有腹腔镜或开腹手术中 取样门及输卵管切除术后取样12 ,也有针对盆腔炎性疾病的 研究在输卵管切除术中抽

7、吸输卵管积水或积脓进行微生物群的分析17 。卵巢微生物群取样方法主要有附件切除术后取样12 和取 卵术中抽取卵泡液等18 。收集样本后，在进一步处理前，可将样 本置于-80艾冻存。目前，DNA提取主要采用试剂盒，除了取样过程 中需小心操作避免阴道宫颈分泌物、血液及其他污染外，作为低生物 量样本，上生殖道微生物群样本在DNA提取过程中也会受到来自试 剂盒、周围环境的细菌DNA的污染,因此建议在上生殖道微生物群 研究中应设置阴性和空白对照组19 o 16S rRNA基因高变区(V1 V9 )具有不同程度的序列多样性，在对细菌进行区分时并非每个高变 区都具有相同的特异性，因此PCR扩增片段的选择对研

8、究结果有很大 影响，目前在人类微生物群研究中较多使用的是V172、V3 V5和 V4高变区20-22 。在完成基因扩增及产物纯化后，构建测序文库， 进行基因测序，目前测序技术多采用高通量测序,即下一代测序(NGS ),常用的测序平台有 Roche 454、Illumina Miseq 和 IonTorrent PGMO测序完成后进行生物信息统计分析，常用软件有 mothur、Quantitative In sights Into Microbial Ecology ( QIIME ) 和 Ribosomal Database Project classifier ( RDP classifie

9、r)等，通 常按照97%相似性阈值将所得序列聚类为不同操作分类单元(OTU )23 z将OTU代表序列与已有的16S rRNA数据库比对(如 Greengenes , Ribosomal Database Project 等)，得到每个样本所 含的物种信息，继而对各样本及不同组间样本的微生物多样性等进行 分析。除16S rRNA基因测序外，宏基因组测序也是目前应用较多的 方法。宏基因组测序是对样本中的全部微生物的总DNA进行测序。 16S rRNA测序主要硏究群落的物种组成及多样性等，而宏基因组测 序在此基础上还可对基因功能、参与的代谢途径、微生物之间以及与 宿主相互关系等进行分析。2上生殖道

10、微生物特征长期以来，人们普遍认为在健康状态下包括宫腔、输卵管、卵巢等在 内的女性上生殖道为无菌环境，细菌的存在只与病理状态相关，如阴 道细菌上行导致感染和炎症等。随舂分子生物学及测序技术的应用， 趣来越多的硏究已证明健康女性的上生殖道中普遍有细菌定植。2.1 子宫内膜微生物群的特征 在现有的大部分研究中，乳杆菌 是子宫内膜微生物群的优势菌属。Mitchell等24 对58例行子宫 切除术女性宫腔微生物群进行研究，用实时荧光定量PCR （ qPCR ） 和广谱16S rRNA基因序列检测12种特定菌种，结果显示其中95% （55例）有至少1种细菌存在或16S PCR阳性，最常见的菌种为惰 性乳杆

11、菌、昔雷沃菌和卷曲乳杆菌，而子宫内膜炎症标志物在所有样 本间无差异。该研究首次通过分子生物学方法证实了宫腔内细菌定植。 Franasiak等16将33例行单胚胎移植患者纳入硏究，在胚胎移植 后留取移植导管顶端5 mm部分作为样本进行16S rRNA测序，共检 测出278个不同菌属,持续妊娠组（18例）和未持续妊娠组（1 5例） 微生物群的最主要菌属均为黄杆菌和乳杆菌。Tao等25 同样利用 胚胎移植导管顶端样本测序对70例体外受精（IVF ）患者胚胎移植时 子宫内膜微生物群进行研究，结果发现在70个样本中均可检测到乳 杆菌属，其中有33例乳杆菌丰度占90%以上，50例乳杆菌丰度占 70%以上。

12、此外，在较多样本中检测到的菌属还包括棒杆菌（40/70 ）、 葡萄球菌（38/70 ）、链球菌（38/70 ）和双歧杆菌（15/70 ）。Moreno 等26 从健康育龄女性中获得子宫内膜液样本，通过16S rRNA测 序鉴定出166个OTU ,其中最具代表性的为乳杆菌属（71.7%），其 次为加德纳菌属（12.6% ）、双歧杆菌属（3.7% ）、链球菌属（3.2% ） 和晋雷沃菌属（0.866% ）,子宫内膜微生物群与阴道微生物群的构成 不完全相同，证明子宫内膜微生物群存在且不是单纯的阴道微生物群 移行的结果。2.2 输卵管微生物群的特征 由于取样困难，目前对于输卵管微 生物群的硏究相较子宫

13、内膜微生物群的硏究少，且更难将健康个体纳 入硏究。以往对于输卵管内微生物的描述主要局限于对性传播疾病病 原体（如沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和支原体等）或细菌性阴道病相关 病原体的培养，随着基因测序技术的发展，已有研究证明在非炎症状 态下输卵管也有细菌定植,并尝试对输卵管微生物群进行描述。Walther-Antonio等27 对31例行全子宫双附件切除术患者的阴 道、子宫颈、子宫内膜、输卵管、卵巢等微生物群进行硏究，其中包 括17例子宫内膜癌患者、4例子宫内膜增殖症患者和10例因妇科良 性疾病而行手术的患者，结果显示：在输卵管微生物群中，志贺氏菌 属和拟杆菌属是最主要的分类群，葡萄球菌、乳杆菌、巴恩

14、斯氏菌和 假单胞菌较常见于良性疾病组。Miles等12 通过对10例行全子 宫双附件切除术女性的阴道、子宫颈、子宫、输卵管和卵巢进行取样 研究，发现子宫肌层、子宫内膜和输卵管的微生物群构成与阴道有显 著差异；而且与阴道和子宫颈相比,卵巢、子宫内膜、子宫肌层和输 卵管的微生物群在其各自的组成上更多样。Chen等11 对95例育 龄女性的生殖道微生物群进行硏究,结果显示从阴道、宫颈到上生殖 道,乳杆菌在微生物群中所占比例逐渐下降，在输卵管开口处乳杆菌 属相对丰度的中位数降至1.69% ;分析显示双侧输卵管微生物群基本 相同，输卵管的标志性OTU包括假单胞菌属、丹毒丝菌属和费克蓝 姆菌属，腹腔液中的

15、标志性OTU有假单胞菌、摩根菌、鞘氨醇杆菌 和漫游球菌,与阴道微生物群以乳杆菌为主不同,子宫颈管和子宫内 膜中未发现标志性分类群，说明子宫颈管和子宫内膜可能是阴道与上 生殖道微生物群的过渡区；qPCR检测各解剖部位的生物量显示上生 殖道微生物群的生物量比阴道内(1010-1011 )(氐4个数量级oPelzer 等28为硏究输卵管微生物群对生殖健康的影响，对16例行输卵 管切除术患者的输卵管微生物群进行分析,结果表明输卵管中细菌丰 度较身体的其他部位低，并非所有样本中均有乳杆菌存在,且乳杆菌 不是最优势菌属，主要的分类群包括葡萄球菌属、肠球菌属和乳杆菌 属，其他丰度较高和典型的分类群还有假单胞

16、菌、伯克霍尔德菌、丙 酸杆菌和普雷沃菌；将样本根据不同标准进行分组进一步分析显示， 输卵管壶腹部和峡部微生物群组成不同，左侧和右侧输卵管的群落分 布也有显著差异，体现了微生物群的部位特异性差异；此外，绝经后 女性输卵管较绝经前女性输卵管细菌多样性低，且有无曼月乐宫内节 育器输卵管微生物群组成也存在明显差异，说明激素变化可能对定植 的输卵管微生物群有影响。2.3 卵巢微生物群的特征 到目前为止对卵巢微生物群的研究尤 为稀少，其中较大一部分研究集中在妇科肿瘤领域.Walther-Antdnio 等27 对31例行全子宫双附件切除术的患者行卵巢活检，在良性 疾病组卵巢微生物群优势菌属为寡养单胞菌属、

17、黄单胞菌属和乳杆菌 属，而拟杆菌属在子宫内膜癌组卵巢样本中占优势。Banerjee等29 对卵巢癌微生物群进行研究，选取99例卵巢癌样本,并在其中20例 中收集同侧或对侧卵巢非癌组织作为配对对照组,选择另外20例行 预防性卵巢切除术患者正常卵巢组织作为未配对对照组，结果显示变 形菌门（52% ）和厚壁菌门（22% ）是卵巢癌组织中的优势菌门,其 他比例较低的分类群还包括拟杆菌门、衣原体门、螺旋体门和柔膜菌 门等，变形菌门和厚壁菌门也是配对对照组中的优势菌门,而未配对 对照组的正常卵巢组织中最常见的细菌包括变形菌门、放线菌门、拟 杆菌门和厚壁菌门；在属水平上，3组没有共同的特征细菌，有较多 菌属

18、是卵巢癌组织中特有的。除卵巢组织外，也有硏究对卵泡液中的微生物群进行描述。2007 2008年，Pelzer等18 在经阴道取卵操作过程中从71例IVF助孕 患者中成对收集卵泡液和阴道分泌物，对样本进行培养，卵泡液中的 微生物未在对应的阴道分泌物中检测到则被归类为定植，如同时在 阴道分泌物中检测到则被归类为污染，结果显示在71例样本中均培 养出细菌，其中37例为卵泡液定植，34例为卵泡液污染，定植于卵 泡液的细菌包括惰性乳杆菌、放线菌属、全黄棒杆菌、梭杆菌属、不 解糖嗜陈菌、消化链球菌属、丙酸杆菌属、晋雷沃菌属和葡萄球菌属 等；且无论定植或污染，左侧卵巢卵泡液中的细菌种类数均较右侧卵 巢多，可

19、能与两侧卵巢独立的血管系统导致血液供应不同有关。Pelzer 等30 的另一项关于卵泡液微生物群的硏究发现,乳杆菌属和丙酸 杆菌属在卵泡液中最常见，卵泡液中含量较高的雌激素和孕激素可以 促进一些细菌的生长，如乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属和大肠杆 菌。2.4 上生殖道微生物群的整体特征 健康女性上生殖道无菌的传 统观念已被推翻，利用细菌培养或高通量测序技术的研究均已证明女 性上生殖道中存在由各种细菌组成的微生物群，且上生殖道微生物群 与阴道微生物群组成不完全相同14,26 ,从阴道、子宫颈管到宫 腔、输卵管及腹腔，随着解剖位置的逐渐上移，乳杆菌在相应微生物 群中所占比例逐渐下降；作为低生物量环

20、境，上生殖道细菌数量远低 于阴道，但细菌多样性较阴道微生物群高11。虽然差异不容忽视, 但在同一个体内，很多细菌分类群为上、下生殖道所共有12 ,31 , 且不同解剖部位的微生物群之间存在相关性和连续性，共同形成了女 性生殖道微生物群的连续统一体11 , 27 。有研究证实，子宫内膜、 输卵管和卵巢微生物群均可能受到激素波动的影响 28, 30, 32 , 但也有文献表明，子宫内膜微生物群不随月经周期的变化而改变 26 。上生殖道微生物群是否受到激素调控还需进一步的研究证实。3上生殖道微生物群对生殖与辅助生殖的影响3.i 子宫内膜微生物群对生殖与辅助生殖的影响 子宫内膜在生 殖过程中发挥重要作

21、用。过去的硏究证明，子宫内膜容受性可能受到 基因、蛋白、细胞因子等多因素调节；同时越来越多的证据表明，子 宫内膜微生物群对生殖与辅助生殖过程具有影响。Verstraelen等15 对19例反复着床失败(RIF )或反复妊娠丢失 的女性进行硏究，在获取的子宫内膜样本中共检测到183个不同的细 菌种系型，其中15种在所有样本中均存在且丰度超过1% ,在约90% (15/19)的样本微生物群中，拟杆菌属(木聚糖拟杆菌、多形拟杆 菌、脆弱拟杆菌)和Pelonomas属数量占1/3以上。Kitaya等33 研究了 RIF患者的子宫内膜微生物群，RIF组与对照组(第1次IVF 助孕的不孕症患者)的子宫内膜

22、微生物群在群落组成上表现出显著差 异，伯克霍尔德菌在对照组所有病例中检测均为阴性，而在RIF组有 1/4病例检测为阳性。部分研究显示，乳杆菌在胚胎着床及早期胚胎 发育过程中可能具有积极影响。Moreno等26 根据细菌组成将子 宫内膜微生物群分为乳杆菌为主的微生物群(LD , 90%乳杆菌属) 和非乳杆菌为主的微生物群(NLD , 10%其他细 菌)，研究发现IVF患者中NLD的胚胎着床率(60.7% vs. 23.1% , P=0.02 )、妊娠率(70.76% vs. 33.3% ,P=0.03 )、持续妊娠率(58.8% vs. 13.3% , P=0.02 )和活产率(58.8% vs

23、. 6.7% , P=0.002 )均较 LD显著降低，流产率升高但差异无统计学意义(16.7% vs. 60% , Q0.07 ),尤其是当NLD组中加德纳菌属和链球菌属比例较高时， 这一负面影响更为明显。Kyono等13 沿用Moreno的子宫内膜 微生物群分类方法，对102例不孕症患者(79例IVF患者和23例非 IVF患者)和7例健康志愿者子宫内膜液微生物群进行研究，结果显 示IVF患者子宫内膜乳杆菌比例较非IVF患者和健康志愿者低百分 比中位数(63.9041.43 ) % vs. ( 96.2034.61 ) % vs. ( 99.50 1 5.85 ) % , P二0.02 ，且

24、IVF组中LD的比例也显著低于非IVF组和 健康志愿者组(38.0% vs 73.9% vs. 85.7% , Q0.001 ) ; 109 例患 者中18例在硏究期间获得临床妊娠，临床妊娠患者的子宫内膜乳杆 菌百分比中位数为(96.4533.61 ) %。但也有硏究认为乳杆菌优势 并非胚胎着床的必要条件。Hashimoto等34硏究子宫内膜微生 物群对IVF患者胚胎舂床的影响,根据子宫内膜微生物群组成将子宫 内膜分为微生态平衡组(乳杆菌+双歧杆菌80%井口微生态失衡组(乳 杆菌+双歧杆菌 80% ,其他细菌20% ),两组患者单次移植的妊娠 率(52.9% vs. 54.8% )和流产率(1

25、1.1 % vs. 5.9% )具有可比性;在子宫内膜微生态失衡的患者中，胚胎移植后获得临床妊娠者和未妊 娠者子宫内膜细菌谱具有可比性，且存在内膜乳杆菌比例为0而获得 持续性妊娠者。还有学者对影响生殖健康的常见疾病中的子宫内膜微 生物群进行了硏究。Fang等14 硏究子宫内膜息肉患者的子宫内 膜微生物群，纳入20例患有子宫内膜息肉的患者10例同时患有子 宫内膜息肉和子宫内膜炎(EP/CE组)，10例仅患有子宫内膜息肉(EP 组)和10例健康女性(健康对照组)，结果显示EP/CE组患者子 宫内膜微生物群细菌多样性高于EP组及健康对照组；在属的水平， 子宫内膜息肉组(20例)内膜微生物群中丰度最高

26、的依次为乳杆菌、 肠杆菌、假单胞菌、加德纳菌和脱硫螺菌，而健康女性组（10例）内 膜微生物群中丰度最高的菌属为肠杆菌、假单胞菌、乳杆菌、脱硫螺 菌、雷尔氏菌和加德纳菌；与健康女性相比，子宫内膜息肉患者子宫 内膜中乳杆菌、双歧杆菌、加德纳菌、链球菌、交替单胞菌和普雷沃 菌比例较高，而假单胞菌、肠杆菌和鞘氨醇单胞菌比例较低。Khan 等32 用分子生物学方法检测子宫内膜异位症患者宫腔内微生物群， 病例组为32例患有子宫内膜异位症的患者，对照组为其他妇科良性 疾病患者，获取所有硏究对象的子宫内膜拭子，通过对16S rRNA基 因进行PCR扩增测序在子宫内膜中检测到58种不同的细菌；与对照 组相比，病

27、例组子宫内膜中乳杆菌科比例下降，而链球菌科、莫拉菌 科比例显著上升；在病例组中，接受4 6个月促性腺激素释放激素 类似物（GnRHa ）治疗者（16例）与未经治疗者（16例）相比，内 膜中乳杆菌显著下降，链球菌、葡萄球菌和肠杆菌比例显著上升；硏 究者认为子宫内膜异位症患者宫腔内更易出现细菌定植和亚临床感 染,GnRHa治疗导致的低雌激素状态会进一步影响子宫内膜微生物群 的构成。子宫内膜微生物群影响生殖与辅助生殖的具体机制目前仍不 清楚，有硏究推测子宫内膜微生物群可能影响子宫免疫环境，从而影 响胚胎着床、胎盘形成等过程。定植菌群通过抗原提呈细胞激活子宫 NK （ uNK ）细胞、影响T细胞亚群分

28、化，使调节性T （ Treg ）细胞数 量增加，Th-17数量减少，完成Th1/Th2模式转变，这些适应性改变 形成对半同种异体胚胎的免疫耐受环境,是胎盘形成的必要步骤；激 活的uNK细胞与胚胎的绒毛外滋养细胞相互作用也会促进滋养细胞 侵袭、内膜间质基质降解和血管形成，最终完成母体螺旋动脉重塑35 。此外，子宫内膜共生菌群可能通过以下方式保护子宫免受机 会性致病菌感染：子宫内膜共生菌与上皮细胞结合触发多种抗菌肽（AMPs ）释放，是上皮组织防御来自各种病原体蛋白水解酶的重要 机制之一36-37 ;共生菌还可诱导子宫内膜分泌黏液，稳固上皮 细胞间黏着连接和紧密连接38-39 ;子宫内膜定植菌群较

29、入侵的 致病菌对于宿主环境具有更好的适应能力,从而成功竞争生态位40。3.2 输卵管微生物群对生殖与辅助生殖的影响输卵管炎是导致不孕症和RIF等的常见疾病，有学者对慢性输卵管炎患者的输卵管微 生物群进行了分析。Wang等17 的硏究纳入57例行输卵管切除 术的育龄期女性，其中38例为盆腔炎（PID ）患者，术中收集PID组 的输卵管积液（23例）或积脓（1 5例）作为样本，一半样本的微生 物群具有单一优势菌（比例 90% ）,包括不动杆菌属（门/19 ）、 埃希菌属（2/19 ）、纤毛菌属（2/19 ）、链球菌属（2/19 ）、拟杆菌（1/19）属和支原体（1/19 ）;另外19个样本细菌组成更多样，其 中较为常见菌属有不动杆菌（16/19 ）、假单胞菌（16/19 ）、希瓦氏 菌（14/19）.气单胞菌（10/19 ）、黄杆菌（7/19 ）、食酸菌（8/19 ）、 草螺菌（5/19 ）o测序结果显示输卵管积液样本的微生物组成更丰富， 输卵管积脓样本中单一优势菌更常见。目前有关输卵管微生物群的研究文献较少,需要进行大样本高质量的 研究证实其与不孕症及RIF等不良IVF结局的相关性。3.3 卵巢微生物群对生殖与辅助生殖的影响 Pelzer等41 假 设卵泡液中的微生物会导致不良IVF结局,在经阴道取卵过程中留取 卵泡液进行培养，研究结果显示卵泡液中