整理蛋白质组学试验方法

1、精品文档2、 蛋白质分离的双向电泳过程21 溶液配制常用水化上样缓冲液(I)尿素8M4.805gCHAPS4%0.4gDTT65Mm0.098gBio-Lyte0.2%(w/v)50M (40%)溴酚蓝0.00110M （1 %溴酚蓝）MilliQ 水定容至 100ml(n)尿素7M4.2g硫脲2M1.52gCHAPS4%0.4gDTT65Mm0.098gBio-Lyte0.2%(w/v)50Ml(40%)溴酚蓝0.00110M （1 %溴酚蓝）MilliQ 水定容至 100ml(川)尿素5M3.0g硫脲2M1.52gSB3-102%0.2gCHAPS4%0.4gDTT65Mm0.098gBi

2、o-Lyte0.2%(w/v)50Ml(40%)溴酚蓝0.00110M （1 %溴酚蓝）MilliQ 水定容至 100ml分成 10 小管，每小管 1ml,-80c冰箱保存。胶条平衡缓冲液母液尿素6M36gSDS2%2gTris-HCl0.05M pH8.83.3ml(1.5M pH8.8 Tris-HCl)甘油20%20ml定容至 100mlMilliQ 水分装成10管，-20 C冰箱保存胶条平衡缓冲液I胶条平衡缓冲液母液 10ml DTT 0.2g 充分混匀，用时现配。10ml0.25g胶条平衡缓冲液U 胶条平衡缓冲液母液 碘乙酰胺充分混匀，用时现配。低熔点琼脂糖封胶液低熔点琼脂糖 0.5

3、Tris甘氨酸SDS溴酚蓝MilliQ 水25mM192mM0.1%0.001 0.5g0.303g1.44g1ml(10%SDS) 100卩1（1%溴酚蓝）定容至 100ml精品文档加热溶解至澄清，室温保存。30聚丙烯酰胺贮液丙烯酰胺150g甲叉双丙稀酰胺4gMilliQ 水500ml滤纸过滤后，棕色瓶4C冰箱保存1.5mol/L Tris 碱 pH8.8Tris 碱90.75g500ml, 4 C冰箱保存MilliQ 水400ml用 1mol/L HCl 调 pH 至 8.8 ，加 MilliQ 水定容至10% SDSSDS 10gMilliQ 水100ml10%S硫酸铵过硫酸铵0.1gM

4、illiQ 水1ml现用现配。10X电泳缓冲液(1 x = 25mM Tris,192mM glycine,0.1% SDS,pH8.3Tris 碱30g甘氨酸144gSDS10gMilliQ 水1L混匀后，室温保存。2. 2操作步骤2.2.1第一向等电聚焦1. 从冰箱中取水化上样缓冲液，室温溶解；在 enpendoff管中，2.0mg蛋白 干粉加入200讪水化上样缓冲液，室温下裂解 3-4h ; 10000rpm常温离心10min, 取上清液上样水化。具体的上样体积及蛋白质上样量如下表，ReadyStrip TMIPG 胶条长度上样体积分析型的上样量（银染）制备型的上样量（考马斯亮兰染色）7

5、 cm125-250 卩110-100ug200-500ug17cm300-600 卩1100-300ug1-3mg2. 从冰箱中取-20 C冷冻保存的IPG预制胶条，于室温放置10min。3. 沿着聚焦盘的边缘由左至右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样, 中间的样品一定要连贯，同时注意不要产生气泡。4. 用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层，分清胶条的正负极，轻轻地 将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上，使得胶条得正极对应于聚焦盘 得正极。确保胶条与电极紧密接触，同时不要使胶条下面的溶液产生气泡。5. 在每根胶条上覆盖矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。6. 对好正、负极

6、，盖上盖子。设置等电聚焦程序。7cm胶条水化12h（17-20 C） 主动水化S1 250V慢速 2 h除盐S2500V慢速S31000V快速S44000V线性S54000V快速S6500V快速17c m胶条水化12hS1250V慢速S2500V慢速S31000V快速S48000V线性S58000V快速S6500V快速选择所放置的胶条数。设置每根胶条的极限电流。设置等电聚焦时的温度。7. 聚焦结束的胶条如不立即进行平衡、1 h除盐1 h除盐3 h升压25000 伏 h 聚焦 任意时间保持(17-20 C)主动水化2 h除盐1 h除盐1 h除盐5 h升压60,000 伏 h 聚焦任意时间保持第二

7、向SDS- PAG电泳，可将胶条置于样品水化盘中，-20 C冰箱保存1-2天2.2.2 第二向 SDS- PAGE电泳1. 配制12%的丙稀酰胺凝胶，上部留0.5cm的空间，用MilliQ 水封面，保 持胶面平整。待凝胶凝固候， 倒去分离胶表面的 MilliQ 水，再用 MilliQ 水冲洗。2. 从-20 C冰箱中取出的胶条，先于室温放置10min,使其溶解。3. 在桌上先放置干得厚滤纸，聚焦好得胶条胶面朝上放在干得厚滤纸上。将 另一份厚滤纸用 MilliQ 水浸湿，挤去多余水分，然后置于胶条上，轻轻吸干胶 条上得矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现得纵条纹。4. 将胶条转移至溶涨盘中

8、，每个槽一根胶条，在槽中加入平衡缓冲液I。将 样品水化盘放在摇床上缓慢摇晃 10-15min。5. 第一次平衡结束后，彻底倒掉平衡缓冲液I,将胶条竖在滤纸上，吸去多余得平衡液。再加入胶条平衡缓冲液U,继续在摇床上缓慢摇晃10-15min。6. 用滤纸吸去SDS-PAGEK丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余得液体。将处理 好的第二向凝胶放在桌面上， 长玻璃板再下， 短玻璃板朝上， 凝胶的顶部对着自 己。7. 第二次平衡结束后，用滤纸吸去胶条上多余的平衡液。用镊子夹住胶条的 一端使胶面完全浸没在1X电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻 璃板上。8. 将放有胶条的SDS- PAG礙胶转移到灌胶架

9、上，短板一面对着自己，在凝 胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。9. 用镊子或平头的针头轻轻地将胶条向下推， 使之与聚丙烯酰胺胶胶面完全 接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡，同时操作时注意不要碰到胶面。10. 放置5min，低熔点琼脂糖圭寸胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。11. 电泳起始时用低电流(7cm胶条：5-10mA/gel ; 17cm胶条：10mA/gel) 或低电压(7cm胶条：50-75V/gel ; 17cm胶条75-100V/gel)，待样品在完全走出 IPG胶条，浓缩成一条线后，在加大电流(7cm胶条：10-15mA/gel ; 17cm胶条： 20-30mA/gel)

10、或电压(7cm 胶条：150-200V/gel ; 17cm胶条：300-400V/gel)，待 溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。12. 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以做记号。然后进 行染色。23 染色方法2.3.1考马斯亮蓝G-250染色固定液：45%( V/V)甲醇，1%( V/V)乙酸G-250染色液：17% (W/V 硫酸铵，34% (V/V)甲醇，0.5 % (V/V)乙酸，0.1 % ( W/V)G-250.步骤： 1. 固定液固定 20min 或过夜(无需固定液可) 。2. 倒出固定液3. 加入G-250染色液，18-24h。4. 倒出染色液5. 用水洗

11、(20min 一次，4555 C温水有助于水洗)6. 可用塑料包裹，4 C贮于密封盆里。2.3.2 胶体考染法1. 用去离子水清洗凝胶两次，每次 10min，以去除SDS2. 固定：50%乙醇/10 %冰醋酸/的水溶液，至少30min,可过夜。3. 染色：染色液为45%甲醇/10 %冰醋酸/0.25 % G-250溶液过滤所得，将凝 胶浸泡后染色至少 2h。4. 脱色：多次更换脱色液( 25%乙醇/8%冰醋酸溶液)直至背景脱净。5. 保存：用保险膜包裹，可存一个月。2.3.3 银染法步骤 试剂体积( ml) 不同类型胶所需时间 (min)1mm 1.5mm1. 固定 10 %乙酸 / 40 %

12、乙醇 / 水 2 X 2502 X 152 X 602. 敏化 75ml 乙醇 / 17g 乙酸钠 /10ml 5% Na2S2O3 /1.25ml 戊二醛 /250加水至30603. 水洗去离子水3 5X 2503X 155X 84. 银染25ml AgNO3 (2.5%) /100讪甲醛/加水至25020605. 水洗去离子水24X 2502X14X 16. 显色6.25g Na 2CO / 100 讪甲醛7 讪 NqSQ(5%)250467. 停止3.65g EDTA 加水至25010408. 水洗去离子水2 3X 2503X52X 303、 等电聚焦蛋白样品的浓度检测31 Bio-Ra

13、d RC DC Protein Assay微离心管检测方法(1) 将5卩1 DC试剂S与250讪DC试剂A混合(试剂A),每份样品或标 准溶液需要127卩1试剂A。( 2)将标准蛋白稀释为 3-5 份蛋白浓度在 0.2-1.5mg/ml 范围内的标准溶液， 在每次测未知蛋白浓度前绘制标准曲线。 (为得到最佳结果，标准蛋白应与样品 使用同样的缓冲液)(3) 从每份样品或标准蛋白中取出25卩1，分别加至清洁、干燥的微离心管 中。(4) 向每管中加入125卩1 RC试剂I,混旋后室温放置1mi n。(5) 向每管中加入125卩1 RC试剂U并混旋，之后在15, 000X g速度下离 心 3-5min

14、 。( 6)吸去上清，然后将管子倒置在干净吸水纸上，使溶液彻底被吸干。(7) 向每个微离心管中加入127讪试剂A并混旋，在室温下放置 5min 或直至沉淀彻底溶解。在进行下一步之前再次混旋。(8) 在每个管中加入1ml DC试剂B,立即混旋，室温下放置15min。(9) 在750nm下读取吸光度，吸光度测定要在1h内完成。32 Bradford法1、溶液的配制Bradford储存液100ml95%乙醇200ml88%磷酸350mg考马斯亮蓝 G-250室温下长期保持稳定Bradford工作液425mlMilliQ水15ml95%乙醇30ml88%磷酸30mlBradford储存液Whatman

15、 1号滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，用前过滤2.1mg/ml BSA 蛋白质标准溶液10mg BSA 标准蛋白10ml MilliQ 水分装成10小管，-20 C冰箱保存。2、标准曲线的测定IDBSA蛋白质MilliQ水Bradford Abs标准溶液（讪）（讪）工作液( ml)(A595)Blank 01001001001012.597.510.06562.597.510.0656259510.162659510.185237.592.510.22487.592.510.25434109010.2611109010.3020512.587.510.303412.587.510.3080615

16、8510.3218158510.3523717.582.510.351417.582.510.42368208010.4279208010.42343、未知蛋白浓度的测定步骤：（1 ）将未知蛋白溶液移至试管，补加 MilliQ水至100讪。（2）加入 1ml Bradford 工作液，充分混匀。（3）3.2min 后测 A595的 0D值。（4）根据测得的A595的OD值，及未知蛋白的稀释倍数，即可算出未知蛋白 的浓度。33 考马斯亮蓝 G-250 染色法1、溶液的配制1）染色液配制95 乙醇50ml85 磷酸100ml考马斯亮蓝 G-250100mg用MilliQ 水稀释定容至1000ml,

17、滤纸过滤，保存于棕色瓶中，4C冰箱 备用。2） 300ug/ml 标准蛋白质溶液配制BSA 标准蛋白质 30mgMilliQ 水定容至 100ml2、标准曲线的测定ID标准蛋白质MilliQ水蛋白浓度溶液（讪）（讪）ug/ml )101000030010000302509501530.2879509501530.288431009003030.49121009003030.494842008006030.78352008006030.790153007009031.07383007009031.0775640060012031.180440060012031.1831750050015031.

18、266350050015031.2712860040018031.343460040018031.3497980020024031.4482染色液 ABS( ml)(A 595)800 20024031.450510 1000 030031.48021000 030031.4837注：充分混匀，室温（20-25C）保温 15min4、未知蛋白浓度的测定步骤：对照管x 2样品管X 2待测样品（讪）0500MilliQ水（讪）1000500染色液（ml）3.03.0样品管中的蛋白可根据需要选择稀释倍数。充分混匀，室温20-25 C保温15min。测A95处的OD值 计算：蛋白浓度（ug/ml ）x

19、样品稀释倍数查A595标准曲线所得蛋白浓度（ug/ml ）测试样品用量（ml）蛋白质样品提取、 裂解条件对蛋白质谱的影响较大， 尤其是蛋白质提取的缓 冲液性质是影响电泳图谱的关键。 本章在前一章的基础上， 重点优化蛋白质提取 缓冲液、样品 裂解液、电泳条件等技术方案。1 材料与方法11 供试材料供试黄瓜品种为山东密刺。 将种子催芽后播在装有草炭土： 蛭石为 1：2（体 积比）的营养钵中，温室中培养，待黄瓜长至两片真叶时，取第二片真叶，称取 后置于-80 C冰箱中待用。1. 2 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶浓度的比较1D样品的提取和SDS-PAG：样品液氮研磨，按1/5的比例加提取液（pH6.

20、8 的 0.0625M Tris-HCL, 0.5%SD$5%甘油，3%B -巯基乙醇和 10% TritonX-100 ） -4 C提取1h, 10000rpm -4 C下离心20 min。取上清液，加4倍体积的丙酮溶 液，-20 C沉淀过夜，10000rpm-4 C下离心20 min,去除上清，沉淀冷冻干燥。 24mg蛋白干粉加1ml蛋白样品处理液（2% SDS 5%巯基乙醇，10%甘油，0.02 % 溴酚蓝， 0.125M pH8.0 Tris-HCL ） ,沸水浴 3-5 min ，冷却后供点样用。SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶浓度分别为 7.5 %、10%、12%、15%，浓缩胶 浓度

21、为 4%。具体配制参照下表 3-1。1. 3 双向电泳中黄瓜叶片蛋白质不同提取方法比较1.3.1三氯乙酸/丙酮法（TCA/acetone法）:取1g植物叶片，液氮冷冻研磨，加 5ml含0.2%DTT和20%TCA勺冷丙酮溶液匀浆，放置于-20 C冰箱过夜。之后4C 下13000rpm离心30min,弃上清液，沉淀用含0.2%DTT的丙酮溶液清洗三次（每 次均放于-20 C冰箱沉淀1h）。最后沉淀冻干，放于-80 C冰箱待用。1.3.2 DTT/丙酮法：取1g植物叶片，液氮冷冻研磨，加 5ml含2%DTT勺水溶液匀 浆。之后4C下1000rpm离心30min,取上清液，弃沉淀。上清液加 4倍体积

22、的 冷丙酮，放置于-20 C冰箱过夜。之后4C下13000rpm离心30min,沉淀用80% 丙酮溶液清洗三次（每次均放于-20 C冰箱沉淀1h）。最后沉淀冻干，放于-80 C 冰箱待用。1.3.3酚提取法：取1g植物叶片，液氮冷冻研磨，加 3ml提取液（1%PVPP,0.7M 蔗糖,0.1M KCL,0.5M pH7.5 Tris-HCL,500mM EDTA,1Mm PMSF,2%p -巯基乙醇）, 4C下1000rpm离心30min,取上清液加等体积的Tris酚，4C下放置30min,之 后10000 rpm离心15min,取酚相上清液。此过程反复提取 2-3次。最后酚相用 5体积0.1

23、M冷乙酸铵溶液-20 C沉淀过夜。之后13000 rpm离心30min,沉淀用 0.1M冷乙酸铵溶液清洗三次，再用冷丙酮洗一次，最后沉淀冻干，放于-80 C冰 箱待用。134 三氯乙酸/丙酮法/酚（TCA/acetone/phenol ）提取法：取1g植物叶片， 液氮冷冻研磨,加4ml冷丙酮,4 C下13000rpm离心3min,再用冷丙酮洗两次 并离心。沉淀转入研钵中，室温干燥20min。干粉末重新研得更细，并转到新管 中，得到得组织粉末用10%冷 TCA/丙酮溶液清洗3-4次，直到上清液无颜色为止。 最后用80%冷丙酮洗两次，每次沉淀彻底重新旋弃，并离心。取0.050.1g干粉末在2.0m

24、l管里重新悬浮于 0.8mlTris 酚和0.8mlSDS溶 液（含30%蔗糖,2%SDS,0.1M Tris-HCL Ph8.0, 5% B -巯基乙醇）中。该混合物彻 底涡旋30S, 4 C下13000rpm离心30min,酚相移到新管中，用5体积0.1M冷 乙酸铵溶液-20 C沉淀过夜。之后13000 rpm离心30min,沉淀用0.1M冷乙酸铵 溶液清洗两次，再用80%冷丙酮洗两次，最后沉淀冻干，放于-80 C冰箱待用。表3-1SDS-PAGE分离胶和浓缩胶的配置Table 3-1 Formulations for SDS-PAGE Separating and Stacking Ge

25、lsSeparating Gel(0.375M Tris,pH8.8)Stacking Gel(1.25M Tris,pH6.8)Monomer Concentration(%T,2.67% C)7.5%10%12.5%15%4.0%Acrylamide/bis(30%T,2.67%C Stock)25.0ml33ml41.625ml50.0ml1.3mlDistilled water48.5ml40ml31.875ml23.5ml6.1ml1.5M Tris-HCl,pH8.825.0ml25ml25.0ml25.0ml-0.5M Tris-HCl,pH6.8-2.5ml10%(W/V)SD

26、S1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml100110% ammonium persulfate(fresh)500讪5001500 1500 150 1TEMED50 til50 150 150 110 1TOTAL MONOMER100ml100ml100ml100ml10ml第一向IEF采取IEF方法（II） 0第二向SDS-PAG电泳分离胶浓度为15%, 电泳条件为20V/gel 20min,80V/gel 2h 。G-250胶体考染法染色。1. 4不同裂解缓冲液的比较Buffer 13g5M Urea2M thiourea1.52g100mM DTT146.4mg0.4% CHAPS

27、40mg0.25% SB3-1025mgCarrier ampholyte25讪（40%）Bromophenol blue20讪(1%)0.25% Tween 2025讪10% Isopropanol1.0ml12.5% Saturated isobutanol1.25ml5% Glycerol0.5ml加 MilliQ 水至10mlBuffer 28M Urea4.8g2M thiourea1.52g100mM DTT146.4mg0.4% CHAPS40mg0.25% SB3-1025mgCarrier ampholyte25讪(40%)Bromophenol blue20讪(1%)0.2

28、5% Tween 2025讪10% Isopropanol1.0ml5% Glycerol0.5ml加 MilliQ 水至10mlBuffer 35M Urea3g2M thiourea1.52g20mM DTT30.8mg2mM TBP100讪2% CHAPS0.2g2% SB3-100.2g0.5% Carrier ampholyte125讪(40%)Bromophenol blue20讪(1%)0.25% Tween 2025讪10% Isopropanol1.0ml5% Glycerol0.5ml加 MilliQ 水至10mlBuffer 49.5M Urea5.7g2M thiourea1% DTT2mM TBP4% CHAPS0.2% Carrier ampholyte Bromophenol blue 0.25% Tween 20 10% Glycerol 10mM PMSF 加 MilliQ 水至Buffer 57M Urea2M thiourea20mM DTT2mM TBP4% CHAPS1% ASB-