2017研究生选修课第五节幻灯片

1、 非编码非编码RNA研究进展研究进展 长非编码长非编码RNA n 长非编码RNA长度在200bp以上。 n 启动子相关长链RNA（promoter associated long RNAs ，PARs）； n 转录超保守区域（transcribed ultraconserved regions ，T-UCR）； n 长链非编码RNA（long non-coding RNAs ， lncRNAs）； n 假基因（pseudogenes）； n 反义RNA（antisense RNA,asRNAs）。 小RNA（Small RNA） Small RNA包含miRNA(microRNA)、ncRNA

2、(non- coding RNA)、siRNA(small interfering RNA)、 snoRNA(small nucleolar RNA)、piRNA(piwi- interacting RNA)、rasiRNA (Repeat associated small interfering RNA)等 。 高通量测序技术在Small RNA研究中的应用包括： 靶基因功能研究，生命活动调节，发育进化研究， 生物Marker, 致病机理研究，药物开发等 。 Small non-coding RNA（小非编码RNA) n 小非编码小非编码RNA的的RNA长度在长度在20-35bp； n 微小

3、微小RNA（microRNAs,miRNAs）；）； n 源于核糖体源于核糖体RNA片段（片段（tRNA-derived fragment， tRF)； n PIWI蛋白作用蛋白作用RNA（PIWI-interacting RNAs ， piRNAs）；）； n 核仁小分子核仁小分子RNA（C/D snoRNA-derived RNA,sdRNA）；）； n 小干扰小干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs）。）。 n miRNAs与与siRNAs 与与ARGONAUTE(AGO)/ PIWI蛋白家族中的蛋白家族中的AGO亚族结合。亚族结合。 n 小小RNA在基因

4、表达、表观遗传、疾病发生发展进程中发挥着在基因表达、表观遗传、疾病发生发展进程中发挥着 重要功能。高丰度、高稳定性和高特异性预示其在临床分子重要功能。高丰度、高稳定性和高特异性预示其在临床分子 标志物标志物(biomarker)研究中具有高潜在价值。研究中具有高潜在价值。 n Small RNA转录组测序是鉴定和定量解析转录组测序是鉴定和定量解析small RNA的新方法的新方法 和有力工具。和有力工具。 n Roche GS FLX Titanium 、Illumina Solexa GA IIx和和AB SOLID 4均可以对均可以对Small RNA进行大规模测序进行大规模测序(Larg

5、e-scale sequencing)分析，分析， Illumina Solexa GA IIx 和和ABI Solid的读长的读长 正好配合了正好配合了small RNA的短序列且通量大，可以得到更高覆的短序列且通量大，可以得到更高覆 盖率，盖率， Illumina Solexa GA IIx在在small RNA测序中广泛应用。测序中广泛应用。 n 通过对通过对Small RNA大规模测序大规模测序(Large-scale sequencing)分析，分析， 可以从中获得物种全基因组水平的可以从中获得物种全基因组水平的Small RNA图谱，实现包图谱，实现包 括新括新Small RNA分

6、子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定、分子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定、 样品间差异表达分析、样品间差异表达分析、Small RNA聚类和表达谱分析等科学聚类和表达谱分析等科学 应用。应用。 图释：图释：A ：piRNA和和miRNA在在PAGE凝胶上的片段分布区域十分接近；凝胶上的片段分布区域十分接近； B：同时对这两片段区域的：同时对这两片段区域的RNA进行测序。进行测序。 Small RNA测序有什么样的样品要求？测序有什么样的样品要求？ (1) 样品纯度要求： OD值应在1.8至2.2之间；电泳检测28S:18S 至少大于1.5。 (2) 样品浓度： total RNA浓度不低于75

7、0 ng/g；提取总RNA时 请不要使用过柱法提取总RNA，样品总量不低于40 g? (Small RNA: total RNA大于0.3%)。或提供浓度大于2 ng/g，总 量大于180 ng的Small RNA样品。 (3) Small RNA样品请置于-20保存；请提供Small RNA样品具 体浓度、体积、制备时间、溶剂名称及物种来源。请同时附上 QC数据，包括电泳胶图、分光光度或Nanodrop仪器检测数据。 如需进行多次样品制备，需要提供多次样品制备所需样品。 (4) 样品运输：样品请置于1.5 ml管中，管上注明样品名称、浓 度以及制备时间，管口使用Parafilm封口。建议使用

8、干冰运输， 并且尽量选用较快的邮递方式，以降低运输过程中样品降解的 可能性。 Small RNA分离方法？分离方法？ n 现行的RNA纯化方法包括有机溶剂抽提+乙醇沉淀，或者是 采用更加方便快捷的硅胶膜离心柱的方法来纯化RNA。 n 由于硅胶膜离心柱通常只富集较大分子的RNA(200 nt以上)， Small RNA往往被淘汰掉，不适用于Small RNA分离纯化。 n 有机溶剂抽提能够较好的保留Small RNA，但是后继的沉淀 步骤比较费时费力。 n 目前还有另外一些Small RNA分离专用的试剂盒。如 MirVana miRNA Isolation Kit是采用玻璃纤维滤膜离心柱 (g

9、lass fiber filter，GFF)，既能够富集10 mer以上的RNA分子， 又兼备离心柱快速离心纯化的特点。 n 对于Small RNA测序，采用PAGE胶电泳对小RNA进行分离。 可以选择感兴趣的Small RNA长度进行研究。 Small RNA的长度为18-30nt。推荐的测序长度为35bp，之后对 序列信息进行修剪，去除接头序列仅留下Small RNA序列。 由于Solexa的读长足够满足Small RNA测序的读长要求，且数据 读取量大，性价比高，因此Solexa在Small RNA测序方面得到广 泛的应用。采用Solexa进行Small RNA测序其文库构建方法如下：

10、(1) PAGE胶纯化特定大小的小RNA分子； (2) 5接头连接和纯化； (3) 3接头连接纯化； (4) RT-PCR扩增； (5) Small RNA文库的纯化； (6) 文库的检测。Small RNA文库需要通过电泳检测和Agilent Technoligies 2100 分析仪检测以分析测序文库中片段的大小、 纯度和浓度。 Small RNA测序文库的构建方法及质量控制？测序文库的构建方法及质量控制？ 高通量测序研究高通量测序研究 Small RNA 优势？优势？ (1) 可以直接从核苷酸水平上研究Small RNA分子，不存 在传统芯片杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景 噪音问

11、题，利于区分相同家族以及序列极为相似的不同 Small RNA分子； (2) 可以对任意物种进行高通量分析，无需任何预先的序 列信息以及二级结构信息； (3) 灵敏度高，测序通量大，为Small RNA分子的发现和 研究提供了极大数据深度与覆盖率，能够检测丰度极低 的稀有转录； (4) 测序产生的原始数据可以与多种分析软件兼容，可以 注释Small RNA的基因组信息，并分析其表达水平，能够 随时使用公用Small RNA数据库注释已知的Small RNA， 还可以进一步分析未匹配的数据，发现新的Small RNA种 类及异构体，寻找更深入的研究信息。 Small RNA测序的影响因素？测序的

12、影响因素？ (1) 样本的质量：进行Small RNA测序过程中，需要对 Small RNA进行分离，分离Small RNA的质量和纯度直 接影响测序结果。由于RNA容易降解，因此RNA的抽提、 纯化等操作一定要严格按照实验要求进行，以保证样品 的质量。 (2) 构建文库的质量：文库构建需要PAGE胶分离纯化 Small RNA，然后连接接头进行纯化后才能进行RT-PCR， 在此过程中，要小心操作保证Small RNA无降解，同时 纯化过程要保证接头去除干净，残余的接头会对后续的 测序产生影响。 (3) 测序文库的上样量控制：这个因素也会很大程度影 响簇生成的密度，由于上样量非常小，只有1-8

13、 pg，所 以能否准确定量微量样品也是影响测序通量的重要因素。 piRNA Piwi-interacting RNA (piRNA) piRNA的发现 n piRNA的发现为非编码小分子的发现为非编码小分子RNA的研究开辟了一的研究开辟了一 个新领域，被个新领域，被Science评为评为2006年十大科技进展之一。年十大科技进展之一。 n 2006年，四个独立的研究小组几乎同时在果蝇、小年，四个独立的研究小组几乎同时在果蝇、小 鼠、大鼠和人等物种生殖系细胞中发现了一类特异鼠、大鼠和人等物种生殖系细胞中发现了一类特异 地与地与PIWI家族蛋白质相互作用的新型小分子家族蛋白质相互作用的新型小分子R

14、NA。 n Aravin等发现了该种小等发现了该种小RNA，他们在，他们在3个月大的个月大的 C57BL/6J雄性小鼠从小鼠全睾丸组织的全细胞裂解雄性小鼠从小鼠全睾丸组织的全细胞裂解 液中利用免疫共沉淀技术纯化并获得液中利用免疫共沉淀技术纯化并获得MILI核糖核蛋核糖核蛋 白复合体。白复合体。 n 该复合体中含有该复合体中含有26-28nt RNA进行凝胶纯化，克隆进行凝胶纯化，克隆 和测序。他们根据和测序。他们根据Piwi蛋白家族的成员蛋白家族的成员MILI与这些与这些 小小RNA的相互作用，命名为的相互作用，命名为Piwi interacting RNAs， 即即piRNAs。 Aravi

15、nA，GaidatzisD，PfefferS，et alA novel class of small RNAs bind to MILI proteinin mouse testesNature，2006，442（7099）：）： 203207. GirardA，SachidanandamR，HannonGJ，etalAgermline specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteinsNature，2006，442 （7099）：199202 n Argonaute蛋白的一种亚家族蛋白的一种亚家族Piwi蛋白家族，为无蛋白家族

16、，为无 脊椎动物的精子和干细胞的发育所必需。脊椎动物的精子和干细胞的发育所必需。 n 两种两种Piwi蛋白家族成员：蛋白家族成员：MILI 和和MIWI是小鼠精子形是小鼠精子形 成所必需的。成所必需的。 n Girard等在睾丸总等在睾丸总RNA分离过程中也检测到了这种小分离过程中也检测到了这种小 RNA，它与，它与MIWI蛋白（一种鼠科的蛋白（一种鼠科的Piwi蛋白）结合。蛋白）结合。 n 这些小分子这些小分子RNA在减数分裂起始期积累。在减数分裂起始期积累。 n 所确证的这些所确证的这些1,000多条独特小分子多条独特小分子RNA序列均具有强序列均具有强 的的5尿嘧啶偏爱性。尿嘧啶偏爱性。

17、 n 这些小分子这些小分子RNA的遗传图谱显示了数量有限的基因簇，的遗传图谱显示了数量有限的基因簇， 表明这些小分子表明这些小分子RNA由较长的初级转录产物加工而成由较长的初级转录产物加工而成。 n 这些小分子这些小分子RNA的长度为的长度为2631个核苷酸。个核苷酸。 n 明显与明显与2123个核苷酸的个核苷酸的microRNAs和短和短siRNAs不不 同。因此我们称其为同。因此我们称其为“Piwi相互作用相互作用RNA”或者或者 piRNAs。 n 他们用小鼠他们用小鼠17号染色体，大鼠号染色体，大鼠20号染色体和人的号染色体和人的6 号染色体进行分析，发有类似的号染色体进行分析，发有类

18、似的piRNA，大多数基，大多数基 因簇出现在同线位置上。因簇出现在同线位置上。 n 直系同源（直系同源（Orthologous）的人类染色体区域也能）的人类染色体区域也能 产生具有产生具有piRNAs特性的小分子特性的小分子RNA，但序列不同。，但序列不同。 n 该类新型小分子该类新型小分子RNA的证实为确定哺乳动物中精的证实为确定哺乳动物中精 子形成过程中的子形成过程中的Piwi蛋白的作用提供了起点。蛋白的作用提供了起点。 LauNC，SetoAG，KimJ，etalCharacterization of the piRNA complex from rattestesScience，20

19、06，313（5785）：）：363367 GrivnaST，BeyretE，WangZ，etalA novel class of small RNAs in mouse spermatogenic cellsGenes&Dev，2006，20 （13）：17091714 此外，相继有3篇文章也分别报道了在小鼠的生精细胞、生 殖系细胞以及睾丸中发现了piRNA。 其中日本的实验室根据来源将其命名为其中日本的实验室根据来源将其命名为germline small RNA （gsRNA），由于命名原则的不同，故在名称上存在一定的），由于命名原则的不同，故在名称上存在一定的 差异。差异。 Yuka W

20、. Iwasaki,Mikiko C. Siomi,and Haruhiko Siomi,PIWI-Interacting RNA: Its Biogenesis and Functions，Annual Review of Biochemistry，2015，Vol. 84: 405- 433 piRNA的起源 n piRNA 来源于基因组中的piRNA 簇(piRNA cluster) 或转座子区域，由长的单链转录本切割 产生。成熟的piRNA 24-32 nt。 n piRNA 在动物界广泛表达，目前尚未在植物中 检测到。 n 除线虫外，从海绵动物(sponges) 到高等哺乳动 物中保

21、守存在两条piRNA 生成途径： n 初级生成途径（primary pathway）：初级生成 途径主要发生在体细胞中，主要由单链piRNA 簇、双链piRNA簇、基因来源的piRNA和转座子 来源的生成途径。 n 单链的piRNA前体加工成piRNA中间体后于Piwi 蛋白结合发生细胞核或者细胞质沉默事件。 n 次级生成途径（次级生成途径（secondary pathway）：次级生成途）：次级生成途 径主要发生在生殖细胞中，径主要发生在生殖细胞中，PIWI 家族在果蝇中有家族在果蝇中有3 个成员个成员Piwi、Aub和和Ago3，其中，其中Piwi 和和Aub 结结 合初级合初级piRNA

22、。 n 由初级加工途径生成的由初级加工途径生成的Aub-piRNA 大多来源于转座大多来源于转座 子的反义链，可以通过序列互补配对识别正义链的子的反义链，可以通过序列互补配对识别正义链的 转录本，然后由转录本，然后由Aub 切割形成次级切割形成次级piRNA 的的5 端，端， 并装载到并装载到Ago3 上，再通过与初级加工途径类似的上，再通过与初级加工途径类似的3 端修剪、甲基化修饰等过程得到正义链来源的次级端修剪、甲基化修饰等过程得到正义链来源的次级 piRNA。 n Ago3- 次级次级piRNA 复合物再以同样的机制剪切产生复合物再以同样的机制剪切产生 反义链的反义链的Aub- 次级次级

23、piRNA，即被称作乒乓循环，即被称作乒乓循环 (ping-pang cycle) 的的piRNA 次级加工途径。次级加工途径。 n 小鼠睾丸中同样存在由小鼠睾丸中同样存在由Mili 和和Miwi2介导的乒乓循环。介导的乒乓循环。 n piRNA是最近从哺乳动物睾丸组织中发现的一类能是最近从哺乳动物睾丸组织中发现的一类能 与与PIWI 蛋白质相互作用的新型小蛋白质相互作用的新型小RNA； n 长度比一般的小长度比一般的小RNA略长，分布在略长，分布在2631 nt之间，之间， 大部分集中在大部分集中在2930 nt、5端具有尿嘧啶端具有尿嘧啶(U)偏向偏向 性性(约约86%)； n piRNA

24、是单链小分子是单链小分子RNA； n piRNA 与与Argo 蛋白家族中的蛋白家族中的Piwi 亚家族蛋白相互亚家族蛋白相互 结合，在细胞质和细胞核的功能十分活跃；结合，在细胞质和细胞核的功能十分活跃； n piRNA 的表达具有组织特异性；无明显特殊性的的表达具有组织特异性；无明显特殊性的 二级结构特异基序和特征。二级结构特异基序和特征。 piRNA的结构特征的结构特征 n piRNA 在染色体上的分布极不均匀，在小鼠中主要分布在在染色体上的分布极不均匀，在小鼠中主要分布在 17、5、4、2 染色体上，基本上不分布在性染色体上；染色体上，基本上不分布在性染色体上； n piRNA 主要存在

25、于基因间隔区，而很少存在于基因区和重主要存在于基因间隔区，而很少存在于基因区和重 复序列区；复序列区； n 它们一般集中成簇分布在它们一般集中成簇分布在1100 kb 相对较短的基因组位点，相对较短的基因组位点， 一个这样的位点一般包含一个这样的位点一般包含104500 个小分子个小分子RNA； n 每一个成簇的每一个成簇的piRNA 几乎都具有同一取向，说明同一簇几乎都具有同一取向，说明同一簇 piRNA 可能来源于同一个初始转录体；可能来源于同一个初始转录体； n 有很少一部分成簇的有很少一部分成簇的piRNA 其取向会突然发生改变，这些其取向会突然发生改变，这些 具有双向特点的成簇具有双

26、向特点的成簇piRNA 则可能从同一个中心启动子转则可能从同一个中心启动子转 录而来。录而来。 Betel D, Sheridan R, Marks D S, et al.Computational analysis of mouse piRNA sequence and biogenesis. PLoS Comput Biol, 2007, 3(11): e222. piRNA生物学功能生物学功能 A.piRNA调控果蝇早期胚胎发育 n 2001年，Aravin 等发现，果蝇Y 染色体上与 Stellate同源的假基因Su(Ste) 编码一类小RNA， 其长度大于siRNA，与PIWI 家族

27、蛋白Aub 相互 作用，即现在熟知的piRNA。 n Su(Ste)基因缺失或aub突变即检测不到Su(Ste) 来源的piRNA，同时导致Stellate蛋白积累、果 蝇雄性不育。 n 后续的研究发现，Aub-Su(Ste)piRNA通过在转 录后水平降解成熟的mRNA，实现对Stellate基 因表达的负调控。 B. piRNA参与家蚕性别决定参与家蚕性别决定 n 家蚕piRNA的最新研究发现，来自性染色体的 FempiRNA通过直接切割靶mRNA参与性别决定。 n 家蚕采用ZW性别决定系统，即雄性携带两条Z染 色体，而雌性携带1条Z染色体和1条W染色体。 n 决定性别的W染色体几乎全部为

28、转座子序列，至 今未鉴定出蛋白质编码基因。 n W染色体的转录本可以作为piRNA前体，加工成 29nt的Fem piRNA，在雌性家蚕中特异性表达。 n 在家蚕胚胎中转染Fem piRNA的反义链RNA或通 过siRNA下调家蚕PIWI蛋白Siwi表达，均导致雌 性家蚕出现雄性化特征。 C. piRNA介导mRNA衰减 PIWI/piRNA调控基因表达研究的新进展调控基因表达研究的新进展DOI: 10.13376/j.cbls/2015046 010 年，Rouget等报道发现果蝇piRNA参与早 期胚胎中母源mRNA 的降解。 n 胚胎发育早期，随着早期胚胎转录机器的启动， 母源mRNA逐

29、渐被胚胎mRNA 取代，被称作母 源-合子过渡(maternal-to-zygonic transition)。 n 过渡过程中，母源mRNA 的降解通过CCR4- NOT脱腺苷酸复合物介导。 D.piRNA调控基因表达的机制调控基因表达的机制 n 线线虫虫piRNA 由单个的转录小单元编码，其序列可覆盖由单个的转录小单元编码，其序列可覆盖 几乎所有的蛋白质编码基因。几乎所有的蛋白质编码基因。 n 线虫线虫piRNA 执行生殖细胞的全基因组转录本监测任务，执行生殖细胞的全基因组转录本监测任务， 一方面通过可遗传的一方面通过可遗传的RNA 诱导的表观遗传沉默途径诱导的表观遗传沉默途径 (RNA-

30、induced epigenetic silencing pathway, RNAe) 沉默外源的沉默外源的“非我非我”(non-self) 基因；一方面保护内源基因；一方面保护内源 基因基因mRNA的稳定性，并激活其表达。的稳定性，并激活其表达。 n 21U-RNA 加载到线虫加载到线虫PIWI 蛋白蛋白PRG-1 上，通过序列上，通过序列 不完全互补配对识别靶不完全互补配对识别靶mRNA，招募，招募RNA 依赖的依赖的RNA 聚合酶聚合酶(RdRP)合成与合成与mRNA 完全互补配对的完全互补配对的22G-RNA。 22G-RNA 可以与两种可以与两种Argonaute 蛋白结合，与蛋白结

31、合，与WAGO 蛋白结合则招募组蛋白甲基转移酶启动蛋白结合则招募组蛋白甲基转移酶启动RNAe，抑制外，抑制外 源源mRNA 表达；与表达；与CSR-1 结合则保护内源靶结合则保护内源靶mRNA 不不 受受RNAe沉默，并激活其表达。沉默，并激活其表达。21U-RNA对基因表达双对基因表达双 向调控的确切机制还有待于进一步的研究。向调控的确切机制还有待于进一步的研究。 E.piRNA调控转座调控转座 n 转座元件是一类存在于多细胞生物基因组中的不稳 定元素，它们可以通过频繁跳跃将自身插入到基因 组的其它位点，从而实现对基因结构和表达的改变， 对物种进化具有重要意义。 n 如果转座元件在基因组中毫

32、无约束地随意移动，则 会破坏基因组的稳定性和完整性，危害个体的生存。 n 因生殖细胞担负着传代的重任，其基因组的稳定性 和完整性尤为重要。 n 因此，在选择压力下，动物生殖系细胞可能就进化 获得了PIWI/piRNA这样一条独特小RNA通路， 用于控制转座子、逆转座子等自私性基因元件的活 性，维持生殖细胞基因组稳定性及完整性。 piRNA生物学功能核心组件PIWI蛋白 n Argonaute蛋白家族可分为AGO和PIWI两个亚家族 成员，它们在物种间高度保守，并在小分子非编 码RNA调控途径中发挥核心作用。 n AGO蛋白质成员特异性地与小分子干扰RNA(small interfering R

33、NA, siRNA) 和microRNA(miRNA)结合， 在多种组织器官中发挥重要功能。 n PIWI蛋白质特异性地在动物生殖系细胞中表达， 特异性地结合piRNA，在动物生殖细胞发育和配 子生成过程中发挥多种重要功能。 n Argonaute家族蛋白质含有保守的PAZ (Piwi Argonaut and Zwille) 结构域和PIWI结构域。 n 结构及生化研究表明，AGO/PIWI蛋白质通过PAZ结构域 与小分子RNA的3末端结合，而PIWI结构域及MID结构 域(the middle domain)结合RNA分子的5末端。 n PIWI结构域含有RNase H的催化结构域，一部分

34、 Argonaute 成员具有核酸内切酶活性，可在对应于向导小 RNA分子第10位与11位碱基之间切割靶RNA链piwi是进 化上非常保守的一类基因，最早在果蝇中被发现，对果 蝇生殖干细胞的自我更新和维持是必需的。 n piwi基因缺失也导致线虫、斑马鱼及小鼠等模式生物生殖 细胞发育受阻。 n 这些研究表明，PIWI蛋白主要在动物生殖细胞中表达， 其功能与生殖事件相关。 在小鼠中，在小鼠中，PIWI蛋白家族包括三个成员：蛋白家族包括三个成员：MIWI2、MILI和和MIWI，它们，它们 在小鼠雄性生殖细胞的发育分化过程中呈现高度时空特异性表达。在小鼠雄性生殖细胞的发育分化过程中呈现高度时空特异

35、性表达。 piRNA在肿瘤中的研究迎来井喷 piRNA在体细胞中表达具有组织特异性 piRNA在肿瘤中异常表达在肿瘤中异常表达 Piwi相互作用RNA（piRNA）是一类新发现的非编码小 RNA，又称第三类小RNA。它们具有基因表达调控的功能， 但与肿瘤发生、发展的关系非常仍然不太清晰。宁波大学郭 俊明在胃癌中 （1）发现了在胃癌组织中异常表达的piRNA。经piRNA芯 片检测胃癌组织和癌旁组织中piRNA的表达，发现一些差异 表达的piRNA，其中piR-651和piR-823的表达差异具有统计 学意义。 （2）揭示了胃癌组织与癌旁组织piRNA表达谱的差异。发 现胃癌组织中piR-823

36、的表达水平明显低于癌旁组织中的表 达水平，而piR-651的表达则相反。发现piR-651和piR-823分 别高表达于和低表达于胃癌组织中，并于胃癌患者的临床病 理因素相关。 （3）胃癌细胞株与正常胃上皮细胞中piR-823表达差异的研 究。发现胃癌细胞中piR-823的表达明显低于正常胃上皮细 胞中的表达。 （4）多种肿瘤组织中piR-823表达差异的研究。发现，结肠 癌和肺癌组织中，piR-823的表达高于相应癌旁组织。 （5）piR-823类似物抑制胃癌细胞的生长。把piR-823类似 物导入到胃癌细胞中，MTT结果显示MGC-803和SGC-7901 的生长均以剂量依赖方式受到抑制。

37、 （6）piR-651抑制剂通过影响细胞周期抑制胃癌细胞的生长， 机制研究说明其阻止胃癌细胞于G2/M期。 （7）动物实验说明piR-823具有抑制肿瘤细胞生长的作用。 （8）外周血piRNA检测用于胃癌诊断的价值研究。胃癌患 者外周血piR-651和piR-823的水平明显不同于正常人外周血 中的水平；腺癌患者外周血piR-651的水平明显高于印戒细 胞癌的水平；piR-823 的水平与TNM分期和远处转移有关。 piR-651、piR-823单独使用和联合使用的ROC曲线下面积分 别为0.890、0.810和0.892；它们的阳性检测率均高于CEA的 检测率。 目的：利用目的：利用piRN

38、A测序筛选新型乳腺癌测序筛选新型乳腺癌 预后生物标记物预后生物标记物 前言 Piwi-interacting RNAs (piRNAs)是一类 26 到 32 nt 的非编码小RNA，在维持生殖细胞系上发挥重要作 用，目前还认为其在体细胞中对基因表达起到转录 后调控的作用。 Piwi蛋白是piRNA生物合成和作用途径的中心，对 基因的表达起表观调控作用。 piRNAs/PIWIs已被报道可作为多种癌症的潜在生 物标记物，但其在乳腺癌中的作用尚未得到全面的 研究。 n 研究者分别对来自104个病人的石蜡包埋乳腺肿瘤 组织和11个冻存正常乳腺组织进行小RNA测序。 n 结果正常组织获得10M re

39、ads数，肿瘤组织获得 165M reads数，piRNA序列总数4,207,022条，被 注释到676个piRNA上。 n 发现25个差异表达的piRNA，包括17个上调和8个 下调piNRA。 图图1. 差异表达差异表达piRNAs的聚类热图的聚类热图 n 然后，进行病例对照(Casecontrol)和纯病例(Caseonly)统 计分析，鉴定出8个piRNA可作为新的预后标记。 n 同时利用基因表达综合数据库GEO对PIWI基因进行预后标 记评价，发现PIWIL3 和PIWIL4也跟预后相关。 图2. 利用差异 piNRA构建的危 险评分与生存的 关系 利用利用PIWI基因构建的基因构建

40、的 危险评分与生存的相危险评分与生存的相 关性关性 最后，利用最后，利用mRNA表达数据库对这些预后差异显表达数据库对这些预后差异显 著的著的piRNA进行靶标分析，发现进行靶标分析，发现306个靶标基因个靶标基因 与与piRNA的表达呈现负相关。对鉴定的这些靶标的表达呈现负相关。对鉴定的这些靶标 基因富集分析发现主要富集到血管生成、转录、基因富集分析发现主要富集到血管生成、转录、 细胞信号传导等功能上。细胞信号传导等功能上。 总的来说，该研究捕获了总的来说，该研究捕获了piRNA异常表达途径的异常表达途径的 整个级联事件整个级联事件,并发现了乳腺癌预后的新型生物标并发现了乳腺癌预后的新型生物

41、标 记物。记物。 是真核生物转录后加工过程中是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体剪接体 （spilceosome）的主要成分，参与）的主要成分，参与mRNA前体的加前体的加 工过程。工过程。 snRNA（小核（小核RNA） 2016年1月8日，清华大学生命学院施一公教授研究组 在科学（Science）就剪接体的结构与机理研究再 发长文（Research Article），题为U4/U6.U5 三小核 核糖核蛋白复合物3.8埃的结构：对剪接体组装及催 化的理解（The 3.8 A Structure of the U4/U6.U5 tri- snRNP: Insights into Splic

42、eosome Assembly and Catalysis） 报道了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）剪接体 组装过程中的一个关键复合物U4/U6.U5 tri-snRNP高 达3.8埃分辨率的冷冻电镜结构，并在此基础上分析 了剪接体的组装机制，为进一步理解剪接体的激活及 前体信使RNA（pre-mRNA）剪接反应的催化机制提 供了重要分子基础。 n 该结构与2015年8月施一公研究组报道的分辨率为3.6埃 的裂殖酵母（Schizosaccharomycs pombe）剪接体结构的 对比揭示了剪接体在pre-mRNA剪接反应过程中作为核酶 （ribozyme）的催化本

43、质，是RNA剪接研究领域的又一 重大进展。 n U4/U6.U5 tri-snRNP是剪接体组装过程中最大也是最保守 的预组装复合物，它由U5小核核糖核蛋白（snRNP）， U4、U6 snRNA和其他蛋白因子组成。 n 在该复合物中，U6 snRNA呈现失活构象。U4/U6.U5 tri- snRNP与A复合物结合形成B复合物，再经过一系列成分、 构象重组后，U1、U4 snRNP解离，剪接体形成，U6 snRNA从而被激活。所以，tri-snRNP的加入是组装成具 有催化活性的剪接体这个过程中不可或缺的一步，其高 分辨率结构的解析对于揭示pre-mRNA剪接反应的分子机 理至关重要。 U4

44、/U6.U5 tri-snRNP电镜密度及三维结构示意图电镜密度及三维结构示意图 n 他们探索并优化了蛋白提纯方案，获得了性质良好 的酿酒酵母U4/U6.U5 tri-snRNP复合物的蛋白样品， 并利用单颗粒冷冻电镜技术重构出了总体分辨率为 3.8埃的三维结构，核心区域分辨率更是高达3.0- 3.5埃，从而首次将该复合物分辨率推进至近原子 分辨率，并搭建了该复合物的原子模型。 n 此高分辨率的结构中，一个出人意料的发现是 U4/U6.U5 tri-snRNP复合物中存在着与之结合的 pre-mRNA。 n 该pre-mRNA通过与U5 snRNA和U6 snRNA碱基互 补配对被识别，其5剪

45、接位点中高度保守的鸟嘌 呤核糖核苷酸（Guanine）被关键蛋白Prp8特异性 识别。这一发现为剪接体的组装和剪接反应的催化 提供了新的见解。 pre-mRNA与tri-snRNP结合 非编码非编码RNARNA与其它组学整与其它组学整 合研究合研究 （一）非编码（一）非编码RNARNA与表观与表观 遗传学调控遗传学调控 表观遗传学的特点表观遗传学的特点 n 可遗传的，即这类改变通过有丝分裂或减数可遗传的，即这类改变通过有丝分裂或减数 分裂，能在细胞或个体世代间遗传；分裂，能在细胞或个体世代间遗传； n 可逆性的基因表达调节，也有较少的学者描可逆性的基因表达调节，也有较少的学者描 述为基因活性或

46、功能的改变；述为基因活性或功能的改变； n 没有没有DNA序列的改变或不能用序列的改变或不能用DNA序列变化序列变化 来解释。来解释。 n 表观遗传修饰主要包括表观遗传修饰主要包括DNA以及一些与以及一些与DNA 密切相关的蛋白质密切相关的蛋白质(例如组蛋白例如组蛋白)的化学修饰的化学修饰. n 某些非编码的某些非编码的RNA也在表观遗传修饰中起着也在表观遗传修饰中起着 重要的作用。重要的作用。 Epigenetic Regulation of Cancer Site Specific Hypermethylation Global Hypomethylation Histone Modifi

47、cations Regulating Factors Dietary Hormonal Genetic Verma M, Srivastava S. Lancet Oncol. (2002) 3:755-63. DNA Methyltransferases Histone Methyltransferases Histone Acetylases/Deacetylases Epigenetics Regulates: Cell Cycle Control DNA Damage Apoptosis Invasion X-Chromosome Inactivation Imprinting Agi

48、ng 表观遗传修饰从多个水平调控基因表达表观遗传修饰从多个水平调控基因表达 v DNA: DNA甲基化甲基化 v蛋白质：组蛋白修饰蛋白质：组蛋白修饰 v 染色质：染色质重塑染色质：染色质重塑 v RNA：非编码：非编码RNA DNA甲基化甲基化 DNA甲基化甲基化(DNA methylation)是研究得最清楚、是研究得最清楚、 也是最重要的表观遗传修饰形式，通过将也是最重要的表观遗传修饰形式，通过将S一腺苷一腺苷 甲硫氨酸作为甲基供体，并在甲硫氨酸作为甲基供体，并在DNA甲基转移酶甲基转移酶 (DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，的催化下，CpG 二核苷酸中的胞嘧

49、啶环上二核苷酸中的胞嘧啶环上5位置的氢被活性甲基所位置的氢被活性甲基所 取代，从而转变成为取代，从而转变成为5甲基胞嘧啶甲基胞嘧啶(5- methylcytosine，5mC)。 83 哺乳动物基因组中哺乳动物基因组中5mC占胞嘧啶总量的占胞嘧啶总量的2%-7%， 约约70%的的5mC存在于存在于CpG二连核苷。二连核苷。 在结构基因的在结构基因的5端调控区域端调控区域, CpG二连核苷常常以二连核苷常常以 成簇串联形式排列，这种富含成簇串联形式排列，这种富含CpG二连核苷的区二连核苷的区 域称为域称为CpG岛岛(CpG islands)，其大小为，其大小为500- 1000bp，约，约56%

50、的编码基因含该结构。的编码基因含该结构。 基因调控元件基因调控元件(如启动子如启动子)所含所含CpG岛中的岛中的5mC会阻会阻 碍转录因子复合体与碍转录因子复合体与DNA的结合。的结合。 lDNA甲基化一般与基因沉默相关联；甲基化一般与基因沉默相关联； l非甲基化一般与基因的活化相关联非甲基化一般与基因的活化相关联； l而去甲基化往往与一个沉默基因的重新激活而去甲基化往往与一个沉默基因的重新激活 相关联相关联。 n 癌细胞的整个基因组水平处于低甲基化状态，比癌细胞的整个基因组水平处于低甲基化状态，比 正常低正常低20%20%60%60%，这种低甲基化大多发生于编码，这种低甲基化大多发生于编码

51、区和内含子区域，以及约占人类基因组区和内含子区域，以及约占人类基因组20%20%30%30% 的重复序列区的重复序列区 n 抑癌基因启动子区域抑癌基因启动子区域CpGCpG岛高度甲基化，且与岛高度甲基化，且与DNADNA 结合的组蛋白广泛去乙酰化结合的组蛋白广泛去乙酰化 85 组蛋白修饰组蛋白修饰 组蛋白修饰组蛋白修饰(histone modification)是表观遗传研究的重是表观遗传研究的重 要内容。要内容。 组蛋白的组蛋白的 N端是不稳定的、无一定组织的亚单位端是不稳定的、无一定组织的亚单位，其，其 延伸至核小体以外，会受到不同的化学修饰，这种修延伸至核小体以外，会受到不同的化学修饰，

52、这种修 饰往往与基因的表达调控密切相关。饰往往与基因的表达调控密切相关。 被组蛋白覆盖的基因如果要表达，首先要改变组蛋白被组蛋白覆盖的基因如果要表达，首先要改变组蛋白 的修饰状态，使其与的修饰状态，使其与DNA的结合由紧变松，这样靶基的结合由紧变松，这样靶基 因才能与转录复合物相互作用。因才能与转录复合物相互作用。 组蛋白是重要的染色体结构维持单元和基因表达的负组蛋白是重要的染色体结构维持单元和基因表达的负 控制因子。控制因子。 组蛋白修饰的种类组蛋白修饰的种类 染色质重塑染色质重塑 n染色质重塑（染色质重塑（chromatin remodelingchromatin remodeling）是

53、一个重）是一个重 要的表观遗传学机制。要的表观遗传学机制。 n染色质重塑是由染色质重塑复合物介导的一系列染色质重塑是由染色质重塑复合物介导的一系列 以染色质上核小体变化为基本特征的生物学过程。以染色质上核小体变化为基本特征的生物学过程。 n组蛋白尾巴的化学修饰（乙酰化、甲基化及磷酸组蛋白尾巴的化学修饰（乙酰化、甲基化及磷酸 化等）可以改变染色质结构，从而影响邻近基因化等）可以改变染色质结构，从而影响邻近基因 的活性。的活性。 88 MicroRNA miRNA是近年来生命科学领域的研究热点，是一组是近年来生命科学领域的研究热点，是一组 生物体基因组编码的内源性非编码小生物体基因组编码的内源性非

54、编码小RNA。 miRNA主要采用降解靶主要采用降解靶mRNA和抑制靶和抑制靶mRNA的翻的翻 译两种作用方式在转录后水平调控基因表达。译两种作用方式在转录后水平调控基因表达。 降解靶降解靶mRNA的方式与的方式与siRNA的作用方式相似，直接的作用方式相似，直接 作用于靶作用于靶mRNA，直接导致，直接导致mRNA表达水平下降。表达水平下降。 但绝大多数哺乳动物细胞中的但绝大多数哺乳动物细胞中的miRNAs 并不导致靶并不导致靶 mRNA的降解，而是通过与靶的降解，而是通过与靶mRNA的的3端非翻译区端非翻译区 （UTR）不完全匹配结合，抑制）不完全匹配结合，抑制mRNA翻译成蛋白翻译成蛋白

55、 质，使靶基因的蛋白质表达水平下降。质，使靶基因的蛋白质表达水平下降。 89 miRNA与肿瘤发生的关系存在两种可能的模式 Caldas, et al.（Nature Medicine 2005） ： 1、若miRNA表达上调，其对应抑癌基因表达下调时，则可能导致肿瘤发生； 2、若miRNA表达下调，其对应癌基因表达上调时，同样可能导致肿瘤发生。 许多瘤基因和肿瘤抑制基因都受到miRNAsmiRNAs分子的调控，此时的miRNAs可能起 到癌基因或是肿瘤抑制基因的作用。miRNAmiRNA癌基因的活化和miRNA抑癌基因失活导 致肿瘤抑瘤基因表达下调以及这些miRNAmiRNA基因与蛋白编码癌

56、基因、抑癌基因协同 作用导致肿瘤发生. miRNA的的 甲基化修饰甲基化修饰 92 RNA甲基化甲基化 n 近两年，科学家们首次发现了一种可逆性的近两年，科学家们首次发现了一种可逆性的 RNA 甲基化甲基化m6A。 n 定位了哺乳动物转录组中的定位了哺乳动物转录组中的 m6A，鉴定了这种动，鉴定了这种动 态修饰的读、写和擦除蛋白，解析了态修饰的读、写和擦除蛋白，解析了 m6A 在转录后调控中的一些功能。在转录后调控中的一些功能。 n RNA 甲基化（甲基化（m6A）研究在表观遗传领域开始崭）研究在表观遗传领域开始崭 露头角，成为最前沿的热点！露头角，成为最前沿的热点！ n N6-甲基腺嘌呤甲基

57、腺嘌呤 (m6A）是真核生物最常见和最丰）是真核生物最常见和最丰 富的富的 RNA 分子修饰。分子修饰。 n m6A 修饰是修饰是 METTL3 甲基转移酶复合体催化的，甲基转移酶复合体催化的， 而最近新发现的而最近新发现的 RNA 去甲基化酶去甲基化酶 FTO 和和 ALKBH5 可以通过一种可以通过一种-酮戊二酸和酮戊二酸和 Fe2+依赖型依赖型 的形式对的形式对 m6A 去甲基化。去甲基化。 n METTL3 (methyltransferase like 3)， FTO 和和 ALKBH5 被证明在很多生物过程中起重要作用，从被证明在很多生物过程中起重要作用，从 发育和代谢到生殖。发育

58、和代谢到生殖。 n m6A 存在于很多物种质中，占到了存在于很多物种质中，占到了 RNA 碱基甲基碱基甲基 化修饰的化修饰的 80%。 n m6A 主要分布在主要分布在 mRNA 中，也出现在非编码中，也出现在非编码 RNA 如如 tRNA， rRNA 和和 snRNA。 n 在转录成的在转录成的 RNA 中相对高的中相对高的 m6A 含量会影响含量会影响 RNA 的代谢过程，比如剪切，核转运，翻译能力的代谢过程，比如剪切，核转运，翻译能力 和稳定性，以及和稳定性，以及 RNA 转录转录 n 2014年年发现了发现了WTAP(wilmstumour 1-associating protein)

59、 蛋白作为蛋白作为m6A甲基转移酶复合物调控亚基，甲基转移酶复合物调控亚基， 调节调节m6A甲基转移酶催化亚基甲基转移酶催化亚基METTL3和和 METTL14在细胞体内的定位和活性。在细胞体内的定位和活性。 WTAP结合RNA并招募METTL3/METTL14复合物对RRACH特异序列进行甲 基化修饰 研究成果研究成果Mammalian WTAP Is a Regulatory Subunit of the RNA N6- Methyladenosine Methyltransferase在线发表于细胞生物学学术期刊在线发表于细胞生物学学术期刊 Cell Research。 DNA, RNA, Protein 的表观遗传