毒理学实验基础PPT课件

1、毒理学实验基础 第四章第四章 毒理学实验基础毒理学实验基础 一、毒理学实验的原则一、毒理学实验的原则 二、毒理学实验的目的二、毒理学实验的目的 三、实验动物的选择和处置三、实验动物的选择和处置 四、剂量设置和对照四、剂量设置和对照 五、结果处理五、结果处理 毒理学实验基础 一、毒理学实验的原则一、毒理学实验的原则 化学物在实验动物中产生的作用可以化学物在实验动物中产生的作用可以 外推于人：外推于人：（1 1）人是最敏感的动物；）人是最敏感的动物； （2 2）人和实验动物的生物学过程包括化）人和实验动物的生物学过程包括化 学物的代谢，与学物的代谢，与体重体重或体表面积相关。或体表面积相关。 实验

2、动物必须暴露于实验动物必须暴露于高剂量高剂量，这是发，这是发 现对人造成潜在危害的可靠方法。现对人造成潜在危害的可靠方法。 成年成年的健康动物和人可能的的健康动物和人可能的暴露途径暴露途径 是基本的选择。是基本的选择。 毒理学实验基础 毒理学实验的局限性毒理学实验的局限性 -动物实验结果外推到人的不确定性动物实验结果外推到人的不确定性 动物与人对外源化学物的反应敏感性可能不同，动物与人对外源化学物的反应敏感性可能不同， 甚至存在质的差别；甚至存在质的差别； 使用少量动物、采用较大剂量，使对群体的代表使用少量动物、采用较大剂量，使对群体的代表 性较差，可能造成高剂量与低剂量的差异；性较差，可能造

3、成高剂量与低剂量的差异； 动物数量较少，对低概率毒效应难以发现；动物数量较少，对低概率毒效应难以发现； 实验动物为纯系，成年动物，反应较单一，与接实验动物为纯系，成年动物，反应较单一，与接 触人群的复杂性不匹配，对外源化学物的易感性触人群的复杂性不匹配，对外源化学物的易感性 存在差异。存在差异。 毒理学实验基础 二、毒理学实验的目的二、毒理学实验的目的 受试物毒作用的表现和性质受试物毒作用的表现和性质（描述毒理学）（描述毒理学） 在急性或慢性实验中观察动物异常，发现在急性或慢性实验中观察动物异常，发现 有害作用有害作用 剂量剂量- -反应（效应）研究反应（效应）研究 毒性评价和安全性评价的基础

4、；得到多种毒性评价和安全性评价的基础；得到多种 毒性参数和剂量毒性参数和剂量- -反应（效应）线的斜率反应（效应）线的斜率 确定毒作用的器官确定毒作用的器官 阐明毒作用特点，为机制研究和毒性防治阐明毒作用特点，为机制研究和毒性防治 提供线索提供线索 确定损伤的可逆性确定损伤的可逆性 通过动物对外源化学物的毒性反应，向人外推，通过动物对外源化学物的毒性反应，向人外推， 以期评价化学物对人的危害和危险性以期评价化学物对人的危害和危险性 毒理学实验基础 三、动物实验的职业道德三、动物实验的职业道德 一般原则一般原则 人道主义的管理人道主义的管理 和处理和处理 使痛觉和不适感使痛觉和不适感 减到最小减

5、到最小 避免不必要的使避免不必要的使 用动物用动物 3R 原则原则 replacement替代：用无替代：用无 知觉材料的科学方法替代知觉材料的科学方法替代 有知觉脊椎动物的方法有知觉脊椎动物的方法 reduction减少：保证数减少：保证数 据信息前提下，尽量减少据信息前提下，尽量减少 动物使用数量动物使用数量 refinement优化：必须优化：必须 使用动物时，减少非人道使用动物时，减少非人道 程序的影响程序的影响 毒理学实验基础 实验动物实验动物：指经人工培育，对其携带微指经人工培育，对其携带微 生物实行控制，遗传背景明确，来源生物实行控制，遗传背景明确，来源 清楚，可用于科学研究的动

6、物。清楚，可用于科学研究的动物。 四、实验动物的选择四、实验动物的选择 毒理学实验基础 （一）物种选择（一）物种选择 基本原则：基本原则： 对外源化学物的毒性反应及代谢特点对外源化学物的毒性反应及代谢特点 与人类接近的物种（与人类接近的物种（很难满足很难满足）；）； 自然寿命不太长的物种；自然寿命不太长的物种； 易于饲养和实验操作的物种；易于饲养和实验操作的物种； 1. 经济并易于获得的物种。经济并易于获得的物种。 常规实验选择两个物种，分属：常规实验选择两个物种，分属： 啮齿类啮齿类 非啮齿类非啮齿类 毒理学实验基础 毒理学实验基础 毒理学实验基础 毒理学实验基础 毒理学实验基础 豚鼠豚鼠：

7、特点是毛短而光滑，生长快，抗病力强，特点是毛短而光滑，生长快，抗病力强， 繁殖性能好。广泛用于药物学、传染病学、免疫繁殖性能好。广泛用于药物学、传染病学、免疫 学、营养学、耳科学等各项医学及生物学的研究学、营养学、耳科学等各项医学及生物学的研究 中。中。 毒理学实验基础 C57BL/6J小鼠小鼠：黑色，对放射物质耐受性强，但黑色，对放射物质耐受性强，但 照射后肝癌发生率高。眼畸形，对结核杆菌有耐照射后肝癌发生率高。眼畸形，对结核杆菌有耐 受性嗜酒精性高，是肿瘤学、生理学、遗传学研受性嗜酒精性高，是肿瘤学、生理学、遗传学研 究常用品系。究常用品系。 毒理学实验基础 SD大鼠大鼠：白色，产仔多，生

8、长发育较白色，产仔多，生长发育较 Wistar大鼠为快，对疾病的抵抗力尤以呼大鼠为快，对疾病的抵抗力尤以呼 吸道疾病的抵抗力强。自发肿瘤发生率较吸道疾病的抵抗力强。自发肿瘤发生率较 低，对性激素感受性高。低，对性激素感受性高。 毒理学实验基础 Lewise大鼠大鼠：近交系大鼠，白化，对诱发自身免近交系大鼠，白化，对诱发自身免 疫心肌炎高度敏感，可诱发过敏性脑脊髓炎、过疫心肌炎高度敏感，可诱发过敏性脑脊髓炎、过 敏性关节炎和自身免疫复合物血管球性肾炎等立敏性关节炎和自身免疫复合物血管球性肾炎等立 刻移植多种肿瘤，高脂肪食物容易引起肥胖症。刻移植多种肿瘤，高脂肪食物容易引起肥胖症。 毒理学实验基础

9、 BALB/c小鼠小鼠：对致癌因子敏感，对放射性对致癌因子敏感，对放射性 照射极为敏感。生产性能良好，繁殖期长，照射极为敏感。生产性能良好，繁殖期长， 广泛应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核广泛应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核 医学和单克隆抗体等研究。医学和单克隆抗体等研究。 毒理学实验基础 BN大鼠大鼠：近交系大鼠，棕色，对实验过敏性脑脊近交系大鼠，棕色，对实验过敏性脑脊 髓炎有抗力。对自家免疫性复合性肾小球肾炎也髓炎有抗力。对自家免疫性复合性肾小球肾炎也 具抗力。平均具抗力。平均3131月龄大鼠心内膜疾病的发生率为月龄大鼠心内膜疾病的发生率为 7%7%，先天性高血压为，先天性高血压为30%3

10、0%。 毒理学实验基础 长爪沙鼠长爪沙鼠：被毛棕灰色，对许多需氧及厌 氧菌敏感，对多种病毒、寄生虫等敏感， 也常用于脑神经病、内分泌学、代谢病、 肿瘤学等方面的研究。 毒理学实验基础 品系：品系：指用计划交配的方法获得的起源于共同指用计划交配的方法获得的起源于共同 祖先的一群动物。祖先的一群动物。 同一品系的动物具有同一品系的动物具有共同的遗传来源、相似的共同的遗传来源、相似的 外貌特征、独特的生物学特性、稳定的遗传外貌特征、独特的生物学特性、稳定的遗传 性性能能 （二）品系选择（二）品系选择 毒理学实验基础 （1）近交系动物：）近交系动物：指采用连续指采用连续2020代以上兄妹代以上兄妹 交

11、配或亲子交配而培育的纯品系动物。交配或亲子交配而培育的纯品系动物。 基因纯合度基因纯合度98.6%98.6%99.8%99.8% 适用于涉及组织或肿瘤移植的实验适用于涉及组织或肿瘤移植的实验. . 津白津白、津白、津白、615615、BALB/cBALB/c、C3HC3H 小鼠小鼠 毒理学实验基础 突变系动物突变系动物：动物在生长繁殖过程中，通过动物在生长繁殖过程中，通过 自然突变或人工定向突变的方法，使其某自然突变或人工定向突变的方法，使其某 基因发生突变并丧失原有的正常功能，该基因发生突变并丧失原有的正常功能，该 突变基因可以世代相传并保持遗传基因特突变基因可以世代相传并保持遗传基因特 性

12、的品系动物。性的品系动物。 无胸腺裸鼠无胸腺裸鼠：免疫系统缺陷可接受人类多种免疫系统缺陷可接受人类多种 癌细胞移植。癌细胞移植。 免疫毒理学、化学致癌作用等研究领域免疫毒理学、化学致癌作用等研究领域 毒理学实验基础 (2)杂交群动物杂交群动物：指两个不同近交系之间有目指两个不同近交系之间有目 的地进行交配所产生的第一代动物，即杂交的地进行交配所产生的第一代动物，即杂交 第一代动物。第一代动物。 具两系双亲所有的遗传特性，杂合程度一致，具两系双亲所有的遗传特性，杂合程度一致， 个体差异小；具备杂交优势，生命力强，无个体差异小；具备杂交优势，生命力强，无 近亲衰退现象。近亲衰退现象。 不能继续繁殖

13、育种，因在子二代会发生遗传性不能继续繁殖育种，因在子二代会发生遗传性 状分离。状分离。 毒理学实验基础 (3)封闭群动物封闭群动物：指在指在5 5年以上不从外部引进年以上不从外部引进 新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所 保存繁殖的动物群保存繁殖的动物群. . 具有一定程度的遗传学差异具有一定程度的遗传学差异. . 昆明种小鼠、昆明种小鼠、NIHNIH小鼠、小鼠、LACALACA小鼠、小鼠、SDSD 大鼠、青紫蓝兔、新西兰兔等均属封闭群大鼠、青紫蓝兔、新西兰兔等均属封闭群 动物动物. . 毒理学实验基础 动物品系的遗传均一性动物品系的遗传均一性 遗传均一性排

14、序：遗传均一性排序：近交系杂交群近交系杂交群 封闭群封闭群 实验动物选择：适宜品系、固定品实验动物选择：适宜品系、固定品 系系 毒理学实验基础 无菌动物无菌动物GF：指体内外均无任何微生物和寄生虫的指体内外均无任何微生物和寄生虫的 动物。是经人工剖腹产净化培育。动物。是经人工剖腹产净化培育。 悉生动物悉生动物GN：已知菌动物，指体内带有已知微生物已知菌动物，指体内带有已知微生物 的动物。经人工有计划地将已知菌投入动物体内。的动物。经人工有计划地将已知菌投入动物体内。 （三）实验动物微生物控制的选择（三）实验动物微生物控制的选择 按照微生物控制分类，实验动物分为四级按照微生物控制分类，实验动物分

15、为四级 毒理学实验基础 无特定病原体动物无特定病原体动物SPF：指体内无特定的指体内无特定的 微生物和寄生虫存在的动物。来源于微生物和寄生虫存在的动物。来源于GF 和和GN，饲养于封闭的系统中。，饲养于封闭的系统中。 SPF已成为国际上进行毒理学试验的标已成为国际上进行毒理学试验的标 准实验动物。准实验动物。 清洁动物清洁动物CL：即最低限度无疾病动物，动即最低限度无疾病动物，动 物体内外不携带人畜共患疾病的病原体物体内外不携带人畜共患疾病的病原体 或动物传染病病原体。饲养于半屏蔽系或动物传染病病原体。饲养于半屏蔽系 统。统。 毒理学实验基础 （四）、个体选择（四）、个体选择 性别：性别：初次

16、试验雌雄同用；存在差异分开统初次试验雌雄同用；存在差异分开统 计；选敏感性别。计；选敏感性别。 年龄和体重年龄和体重：动物年龄依实验类型选择，取：动物年龄依实验类型选择，取 成年期数据。体重可作为判断年龄的指标。成年期数据。体重可作为判断年龄的指标。 生理状态：生理状态：避免激素影响，雌雄分开饲养；避免激素影响，雌雄分开饲养； 繁殖实验、致畸试验适时合笼交配。繁殖实验、致畸试验适时合笼交配。 健康状况：健康状况：用健康动物，提前观察确认。用健康动物，提前观察确认。 毒理学实验基础 （五）实验动物管理（五）实验动物管理 动物管理：动物管理：动物的接受、适应、饲养、鉴动物的接受、适应、饲养、鉴 别

17、和记录（动物来源、处理、其它资料）别和记录（动物来源、处理、其它资料）. 环境条件管理环境条件管理：气候（温度、湿度、通风、：气候（温度、湿度、通风、 光照）、其它条件（噪音、气味、垫料、光照）、其它条件（噪音、气味、垫料、 群体密度、空间限制）、饲料、饮水等群体密度、空间限制）、饲料、饮水等. 设施管理：设施管理：清洁卫生、废弃物处理、害虫清洁卫生、废弃物处理、害虫 控制、突发事件管理控制、突发事件管理. 毒理学实验基础 五、受试物样品的准备五、受试物样品的准备 了解其化学结构与理化性质：挥发性、了解其化学结构与理化性质：挥发性、 溶解性、稳定性；溶解性、稳定性； 纯度及杂质成分；纯度及杂质

18、成分； 采用同一种同一批号受试物采用同一种同一批号受试物; 毒性资料查阅（形似化学物）毒性资料查阅（形似化学物）; 制备成一定剂型：水溶液、油溶液、混制备成一定剂型：水溶液、油溶液、混 悬液悬液. 毒理学实验基础 一、体内毒理学试验设计一、体内毒理学试验设计 剂量分组剂量分组以获得剂量以获得剂量- -反应关系，确认受试物反应关系，确认受试物 与毒作用的关系与毒作用的关系：至少三个剂量组（高、中、至少三个剂量组（高、中、 低）；设对照组（阳性、阴性、未处理对照、低）；设对照组（阳性、阴性、未处理对照、 历史性对照）历史性对照） 各组动物数：实验目的和设计、统计学要求各组动物数：实验目的和设计、统

19、计学要求 试验期限：试验期限：由实验目的和所用动物种或品系决由实验目的和所用动物种或品系决 定：定：急毒为一次或急毒为一次或24h24h内多次染毒观察内多次染毒观察1414天，亚天，亚 慢性规定持续至动物寿命的慢性规定持续至动物寿命的10%10%，慢性实验、致，慢性实验、致 癌实验为持续至动物寿命的大部分。癌实验为持续至动物寿命的大部分。 六、毒理学实验设计要点六、毒理学实验设计要点 毒理学实验基础 二、体外毒理学试验设计二、体外毒理学试验设计 溶解性测试溶解性测试：在实验测试期间，受试物溶解性可：在实验测试期间，受试物溶解性可 能改变，起始和结束时评价溶解性具有意义；能改变，起始和结束时评价

20、溶解性具有意义； 最高剂量推荐最高剂量推荐：高剂量会影响渗透压引发损伤，：高剂量会影响渗透压引发损伤， 上限为：动物细胞上限为：动物细胞10mmol/L或或5mg/ml;细菌实验细菌实验 5mg/平板。毒性物应有毒效应和致死率。平板。毒性物应有毒效应和致死率。 代谢活化代谢活化：大鼠预处理后，取肝组织匀浆为代谢：大鼠预处理后，取肝组织匀浆为代谢 活化系统活化系统-S9（p124） 阳性对照阳性对照：剂量反应的直线部分：剂量反应的直线部分 重复重复：可疑结果要重复，但非简单重复：可疑结果要重复，但非简单重复 六、毒理学实验设计要点六、毒理学实验设计要点 毒理学实验基础 七、实验动物染毒和处置七、

21、实验动物染毒和处置 尽可能模拟人接触毒物的方式尽可能模拟人接触毒物的方式 不同途径的吸收速率为：静注吸入不同途径的吸收速率为：静注吸入 肌注肌注 腹腔注射腹腔注射 皮下注射皮下注射 经经 口口 皮内注射皮内注射 其他其他 毒理学实验基础 一、染毒一、染毒 经口染毒：经口染毒：（1）喂饲、（喂饲、（2）灌胃、（）灌胃、（3） 吞咽胶囊；吞咽胶囊； 经呼吸道染毒经呼吸道染毒：（：（1）静式吸入染毒、（）静式吸入染毒、（2） 动式吸入染毒动式吸入染毒 经皮肤染毒：经皮肤染毒： 注射染毒：尾静脉、肌注、皮下、腹腔注射染毒：尾静脉、肌注、皮下、腹腔 实验动物染毒和处置实验动物染毒和处置 针对一种外源化学

22、物，如何选择染毒方式针对一种外源化学物，如何选择染毒方式? 毒理学实验基础 二、生物标本采集二、生物标本采集 生物标本采集：生物标本采集：（1）血液（终末）血液（终末、非、非终末终末 采血）、采血）、（2）尿液采集、（）尿液采集、（3）胆汁采集、）胆汁采集、 （4）粪便采集）粪便采集. 麻醉：短效、中效、长效麻醉剂使用麻醉：短效、中效、长效麻醉剂使用-；麻；麻 醉过程观察醉过程观察. 安死术：安死术：p129. 病理解剖和样标本留取：病理解剖和样标本留取：(1(1）大体解剖、大体解剖、 （2）组织病理学检测）组织病理学检测. 实验动物染毒和处置实验动物染毒和处置 毒理学实验基础 八、毒理学实验的统计学基础八、毒理学实验的统计学基础 统计学要点统计学要点： 实验设计遵循原则：随机、重复、对照实验设计遵循原则：随机、重复、对照. 包括：包括： （1）剂量水平数目及间隔；剂量水平数目及间隔； （2）每个剂量点的实验）每个剂量点的实验单位数单位数，实验单位确定要，实验单位确定要 保证保证样本的独立性、代表性；样本的独立性、代表性； （3）对照设置；对照设置； （4）非实验因素条件的均一性：样本足够数量、）非实验因素条件的均一性：样本足够数量、