心肌细胞在高的压下的基因表现心脏纤维母细胞在缺氧下的基因表现形式

1、台北市立第一女子高級中學校內科展作品說明書簡介科 別： 生物編號 ：B06作品名稱：心肌細胞在高壓下的基因表現班 級：二年溫班指導老師：陳怡旴 老師 、陳錦澤 教授 作 者：蔡迪姍、吳嘉芸一、研究動機：高血壓所誘發的機械性展延是造成心肌肥大的基本因子。目前雖 已知機械性展延與心肌肥大之間的關聯性，但確實知分子機制則尚未 完全明朗。傳統上研究缺氧（Hypoxia）之基因表現層次大多侷限於單 一基因或少量基因，並無大量相關基因表現之研究。因此本實驗主要 應用近幾年才發展出來的微陣列基因分析技術來探討心肌細胞在展 延造成之高壓環境下其基因表現型式和相對量的分子關係。二、研究目的：利用活體外心肌細胞培

2、養系統，經機械性展延的處理後，進而抽 取和純化RNA並進行微陣列基因分析技術，以提供高壓時心肌細胞 之基因表現的不同型式和相對量的重要訊息。三、實驗器材：新生鼠數隻、CO2 In cubactor、Flexercell strain un its、Microarray四、實驗設計：將新生鼠的心肌細胞培養在可伸縮的矽膠膜培養皿上，利用 flexercell strain units施以20%的展延力，以模擬心肌細胞在高血壓時 的搏動。然後抽取total RNA，並純化得mRNA，經由反轉錄作用得 到cDNA,再經過PCR後製成cDNA probe,點在晶片上，與已知DNA 的片段進行雜漬反應。再

3、經電腦掃描分析得到數據化的結果，了解基 因表現量之增減。五、實驗方法：一、心肌細胞之細胞培養：包括初代心肌細胞之培養和繼代培養。1. 從 CQ Incubator 取出 primary cell 的培養皿（直徑 810cm）。2. 用 pipette抽掉舊 medium,以 35c.c的 PBS 清洗 23次。3. 加入 11.5ml Trypsin + EDTA 搖晃，使細胞 detach因為Trypsin可切斷細胞附著在plate的protein;而EDTA可拿走2+2+Ca、Mg等可促使細胞附著於plate上的物質。4. 放入CO2 Incubator 35分鐘，以加速作用。取出後，輕拍

4、。5. 加入5c.c的新medium,搖均勻後和細胞一起吸到tube中。6. 再加入5c.c的medium反覆吸抽使細胞完全吸至tube中。7. 搖均勻後放入離心機，1200 rpm, 6 mi n, 46Z8. 取出tube,吸掉上清液9. pipetting :加 5c.c. medium到 tube 中，用 pipette反覆抽吸約 20 下10. count cell numbera. 取一滴（50卩L）等量Trypan Blue Stain 0.4混和均勻，滴在血球計 算盤上b. 蓋上蓋玻片後，在 A、B處滴上已染色的cell solution,放在顯微 鏡下數c. 可算9大格中細胞

5、，再除以9,或算其中1大格1 大格數 * 104 * 2 * 10c.c. = total cell number11. 各取8c.c的medium分至5培養皿中再將2 c.c的細胞分至新的5 個培養皿，搖勻後，靜置一段時間。12. 放入 CO2 Incubator二、RNA分離，純化和鑑定：採用 Guanidine isothiocyana之方 法分離出total RNA,然後經由吸光值和電泳分析以確定其濃度和純度，最後純化出mRNA。RNA 的分離1、將 plate 自 CO2 In cubactor中 拿出，以 PBS 清洗 12 次。2、加入35ml的GIT，再放至shake上搖晃數分

6、鐘。GIT的作用：a.溶掉細胞膜，使RNA跑出來。b.抑制RNase防止RNase吃掉RNA。3、用刮棒從plate上刮下，吸至tube中，力口 GIT至5ml。4、加入等量（5ml）的 phenol（酚）及 1.5ml 的 chloroform 至 tubQ5、用 shaker搖勻。6、以2000rpm 4C離心20分鐘，分離出上下兩層（上面：水層 + RNA;下面：有機層），中間有一類似薄膜物（protein）。7、將上清液吸到新的tube,但不可吸到中間的protein和下層的 有機層。8在放置上清液的tube中加入半量的冷凍（-70C）無水（99.5 %）酒精，讓RNA沉澱。9、放至-

7、70C的冰箱中凍2小時。10拿出後直接以2000rpm離心20分鐘，得上清液和質塊沉澱物（RNA pellet）。11、去掉上清液,再離心（用真空離心機）使溶液乾掉。12、加入DEPC,溶解RNA。13用光電比色機測 0D （吸光度），OD26。/OD280越接近2,表示 所萃取的total RNA越純。14亦可去跑電泳，若跑不出來，則表示 RNA被RNase吃掉了， 而接下來的實驗也不用做了。Make Gel （ solution）H2OAgarose10*MOPS14.42 ml0.24 g2 mlFormadahyde3.58 mlTotal20 mlStep1. 調配10*MOPS和F

8、ormadahyde混和在一起（用量筒），放置一旁2. 用燒瓶，3次水和Agarose混和在一起3. 放入微波爐加熱1.52 min因不同劑量有所不同）4. 用水降溫至約5060C（以免塑膠融化）5. 加入10*MOPS和Formadahyde混和液，混和後快速到入模中6. 用針頭戳泡泡（小泡可以引到邊邊）7. 水平置於室溫約30 min, OKRNA的純化1、 用微量吸管吸取適量的total RNA （不超過1mg）移入無Rnase 的微量離心管中。2、加入DEPC處理過的水，再加入 Buffer OBB和Oligotex Suspension然後反覆抽吸使其均勻。3、將此微量離心管置入70

9、C水浴中使作用3分鐘（為了將RNA 之二級結構破壞）。4、取出後置於室溫中作用10分鐘。5、移入微量離心機中，以14000rpm離心兩分鐘，使Oligotex： mRNA複合物沉澱下來。6、再加入Buffer OW2與Oligotex： mRNA複合物混合均勻，然後 移入含Spin column（離心管柱）的微量離心管內，以14000rpm離心一 分鐘。7、取出Spin column置於另一新的微量離心管中，加入 Buffer OW2, 14000rpm離心一分鐘，流出液不要。8再將Spin column置於另一新微量離心管內，加入經 70C處理 的Buffer OEB與Oligotex mR

10、NA複合物混合均勻，14000rpm分鐘。9、重複8之步驟，14000rpm離心2分鐘。10、將 8和 9之純化液混合，即可獲得 mRNA。三、mRNA的反轉錄作用mRNA進行反轉錄作用形成cDNA,其反應mRNA, DTT, Ige pal, Primer， dNTP 和 200U Superscrip II reverse transcriptas，e 在 440C 下作 用 45 分鐘，在加入含 MgCl2，DTT，dGTP，KH2PO4 和 10U terminal deoxynucleotide transferase進行 tailing 反應，行成完全的單股 cDNA。四、聚合酵素

11、鏈鎖反應單股 cDNA 再以 PCR 進行複製,反應總體積含 cDNA, formamide, Primer, dNTP 和 4.5U DNA polymerase。PCR的原理能使DNA在微量試管中擴增至10八6倍以上。 首先,在要擴增的 DNA 片段兩端分別設置一個前置引子 (forward primer)和反置引子(reverse primer)使之與已變性的單股目標 DNA作緩 冷配對(annealing)後，利用DNA聚合酵素(DNA polymerase)以目標 DNA 的兩股分別作為模板,來合成新的 DNA 股。經由(1) 變性反應(denaturation)使DNA的兩股分離。

12、(2) 緩冷配對反應(annealing)使引子與目標DNA配對。(3) 延伸反應(extension)合成新的DNA股。兴 註：反應條件為 94 C,15sec和 65C,30sec和 68C,120sec共 30 個 循環。再進行680C,420sec的延伸反應。這樣循環操作每次可使 DNA 的量增加一倍,若重複操作多次,以理 想的數學式子計算,重複操作 PCR 30cycles, DNA 的分子數將會擴增 到2八30左右。擴充的大量DNA分子就可提供Microarray的實驗使用。五、微陣列基因分析技術： mRNA 經由反轉錄酶作用成 cDNA probe再以附著多種基因之晶片膜進行雜漬

13、反應，經由電腦軟體分析 獲得結果。1. 基因來源：(1) 藉由基因庫得到所需要的基因PCRGene Library cDNA(2) 直 接合成 oligonucleotide 直接在晶片上合成寡核甘酸，或依傳統的方法合成寡核甘酸後 再將基因點上，可檢測基因的突變和多型性。2. Microarray 的步驟：(1)從細胞中分離所需的 RNA 。(2) 將上方1之基因來源的DNA經由arrayer註1 )機械手臂點在 尼龍膜 Nylon 或 Nitrocellulose membrdue 醋酸纖維膜上。(3) 將抽取的RNA弄成Probe探針)，與點上的基因片段進行雜漬 反應(Hybridizat

14、ion)(註 2 )。(4) 已呈色之cDNA array經由Laser seanne掃描獲得影像 (image)。( 5) 影像再經由電腦 Data proeessing 比對分析獲得結果。兴 註1: arrayer唯一種機械手臂，探針頭與原子筆頭相似。經 由電腦的控制，每一次可以在膜上點出一段基因。#若以1 em2 面積大小的模來作分析:在arrayer的控制下，若每一個點面積占0.1mm2，而它與其另一側的 點相隔2個0.1mm(也就是說每個單位記成0.3mm)。則在這一個晶片 上，我們大約可以點 900多個樣本。註2: eDNA 標識成探針再和 eDNA array 進行雜漬反應:取已

15、複製過的eDNA與digoxigenin-11-dUTP (Roche)進行標示反應，將以標示好之探針經過單股化的作用後，加入雜漬反應液，再與CDNA assay進行雜漬反應作用。完成後取出已雜自之cDNA assay使用saline-sodium citrate /0.1%SDS清洗兩次，再利用 digoxigenin detection system(Roche)進行呈色反應。六、實驗結果:Putative Gene NameAccessi on nu mberRatio of s/cNitric oxide syn thaseH678431.70UPAR7419472.00P19 (cy

16、cli n-depe ndent kin ase in hibito2D)R7751738.00Tran scripti on factor AP-2 alphaH018181.68Ciliary n eurotrophic factor receptorR730509.00Puri ne-rich eleme nt binding prote in AH4642528.00Tran scripti onal activator SNF2aH459777.67Tran sducer of ERBB2H2985720.00Chemok ine (C-C motif) receptor2H5825

17、431.50Prefoldin 4W0450732.00Neural-cadheri n precursorT775010.20In suli n receptor precursorH039170.02PKD2R482310.04Tumor n ecrosis factor, alpha-i nduced protein 6R735320.03Excisi on repair cross-compleme nting rode nt repair deficie ncy, compleme ntati on group 5H185270.08Tumor n ecrosis factor (l

18、iga nd) superfamily, member 10H445680.04mutL homolog 1H308570.06Glutaredox inR921980.04七、討論：何以得知基因表現的差異是因為缺氧的狀態所造成，而不是因為 細胞的個體差異或其他影響因素？首先當然要盡量 減少不必要的變因，所以同一次實驗是由同一隻 老鼠身上取得心臟纖維母細胞。其次，欲確定基因表現真的為缺氧所 造成，可看兩個方面：時間效應與劑量效應一一a. 時間效應：可對處於同樣缺氧條件下的細胞，進行缺氧時間長 短的控制，如我們的實驗中，便有1小時、3小時、12小時、24小時、 48小時不等的缺氧時間。b. 劑量

19、效應：要造成缺氧條件所用的儀器一多灌入 N2的In cubactor可藉由調整灌入N2的量，造成不同的缺氧程度，如：正常 應有20%的02,在N2的In cubactor中,可能只有3%、5%、10%,即可對細胞造成不同的缺氧狀態。而上述兩方面，皆有其 正相關和負相關，即時間或劑量的增加或 減少，會造成基因表現隨之增加或減少。故若實驗結果中發現有時間 效應或劑量效應，則可確定基因表現量之改變確為缺氧狀態所造成。八、結論:分析出心肌細胞在缺氧時，其基因表現量的增減。九、參考資料及其他:1 . Reactive oxygen species modulate endothelin-l-induced c-fos gene expression incardiomyocytes . T.H. Che ng , N. L.Shih , S.YChe n , L.Wa ng , J.J.Che n2 . The transcriptional program in the r