第一章-沉淀与共沉淀(3课时)

1、2021/3/261 定量分析过程定量分析过程 取样取样溶样溶样消除干扰消除干扰 测定测定 计算计算 掩蔽掩蔽 原理原理 数据处理数据处理 分离分离 方法方法 结果结果 分离的意义分离的意义:消除干扰、富集微量待测组分消除干扰、富集微量待测组分 2021/3/262 . . 对分离的要求对分离的要求: : 1 1）干扰组分应减小至不再干扰被测组分的测定）干扰组分应减小至不再干扰被测组分的测定; ; 2 2）被测组分在分离过程中的损失要小到可以不计。）被测组分在分离过程中的损失要小到可以不计。 被测组分被测组分A A的回收率（的回收率（R RA A）: : A A 100% A R 分分离离后后

2、的的测测定定值值 样样品品中中的的总总量量 A为主要组分为主要组分:RA99.9% A在在1%: RA99% A为微量组分为微量组分:RA95%或更低或更低 2021/3/263 气液分离气液分离:挥发和蒸馏挥发和蒸馏 液液分离液液分离 螯合物萃取螯合物萃取 离子缔合物萃取离子缔合物萃取 三元络合物萃取三元络合物萃取 支撑型液膜支撑型液膜 乳状液型液膜乳状液型液膜 生物膜生物膜 萃取分离萃取分离 液膜分离液膜分离 其他分离方法其他分离方法:萃淋树脂、螯合树脂、萃淋树脂、螯合树脂、泡沫泡沫浮选浮选 分离分析法分离分析法:气相色谱法气相色谱法,液相色谱法液相色谱法、电泳分析法电泳分析法 分分 离

3、离 方 方 法 法 固液分离固液分离 沉淀分离沉淀分离 离子交换分离离子交换分离 氢氧化物：氢氧化物：NaOH、NH3 硫化物：硫化物：H2S 有机沉淀剂：有机沉淀剂：H2C2O4 阳离子交换树脂阳离子交换树脂 阴离子交换树脂阴离子交换树脂 固相萃取固相萃取 气固分离气固分离-超临界流体萃取超临界流体萃取 2021/3/264 第一章 沉淀与共沉淀分离法 2021/3/265 沉淀沉淀 n从液相中产生一个可分离的固相的过程,或指从 过饱和溶液中析出的难溶物质。 n沉淀作用表示一个新的凝结相的形成过程,或由 于加入沉淀剂使某些离子成为难溶化合物而沉积 的过程。 n产生沉淀的化学反应称为沉淀反应。

4、 2021/3/266 n溶度积常数:物质的沉淀和溶解是一个平衡过程, 通常用溶度积常数KSP来判断难溶盐是沉淀还是溶 解。溶度积常数是指在一定温度下,在难溶电解 质的饱和溶液中,组成沉淀的各离子浓度的乘积 为一常数。各种难溶盐有不同的溶解度,通过测 定难溶盐在纯水中的溶解度,便可以算出溶度积。 它决定了从溶液中可分离出组分的限度,这在分析 化学上经常应用 2021/3/267 n沉淀的结构类型:可分为晶形沉淀和非晶形沉淀两大类。 非晶形沉淀又称为无定形沉淀或胶状沉淀 n如硫酸钡是典型的晶形沉淀,Fe2O3nH2O是典型的非晶 形沉淀 n它们之间虽无绝对界限,但仍有明显差异。晶形沉淀颗 粒大,

5、直径约在0.11微米之间,内部排列较规则,结构 紧密,易于沉降和过滤;非晶形沉淀颗粒很小,其直径通 常小于0.02微米,没有明显的晶格,排列杂乱,结构疏松, 体积庞大,易吸附杂质,难以过滤,也难以洗干净。 2021/3/268 n沉淀的形成过程很复杂,至今尚不完全了解沉淀形成的 机理。实验证明,沉淀和颗粒的类型、大小,既取决于物 质的本性,又取决于沉淀的条件。 n沉淀条件:在实际工作中,必须根据不同的沉淀类型选择 不同的沉淀条件,以获得合乎要求的沉淀。对于晶形 沉淀,主要是创造条件以生成较大的晶粒,避免形成能穿 透滤纸的微小结晶。对于无定形沉淀,主要是加速沉 淀微粒凝聚、防止形成胶体溶液,力争

6、获得含水少、结 构较紧密的沉淀 2021/3/269 什么是共沉淀? 当沉淀从溶液中析出时,溶液中的某些原本可溶的组分 被沉淀载带而混杂于沉淀中,这种现象称为共沉淀现象。 共沉淀现象是玷污沉淀的主要因素。在重量分析中,总 是设法减少共沉淀。但是共沉淀分离法却是富集痕量组 分的有效方法之一。这是利用溶液中主沉淀物（称为载 体或搜集剂）析出时将共存的某些微量组分载带下来而 得到分离的方法。例如,在痕量Ra存在下,将硫酸钡沉淀 时,几乎可载带下来所有的Ra2+ 2021/3/2610 共沉淀的产生 n表面吸附。由于沉淀表面的离子电荷未达到平衡,它们的残余电 荷吸引了溶液中带相反电荷的离子。这种吸附是

7、有选择性的:首先 吸附晶格离子;其次,凡与晶格离子生成的盐类溶解度越小的离子,就 越容易被吸附;离子的价数愈高,浓度愈大,则愈容易被吸附。升高溶 液温度,减小沉淀的表面积,可减小吸附。 n包藏。在沉淀过程中,如沉淀剂较浓,又加入过快,则沉淀颗粒表面 吸附的杂质离子来不及被主沉淀的晶格离子取代,就被后来沉积上 来的离子所覆盖,以至杂质离子陷入沉淀的内部,称为包藏,又叫吸留。 由包藏引起的共沉淀也遵循表面吸附规律。 n生成混晶。如果晶形沉淀晶格中的阴、阳离子被具有相同电荷的、 离子半径相近的其他离子所取代,就形成混晶。 2021/3/2611 共沉淀分离法的历史及优势 n一种古老的分离方法 n为放

8、射化学发展作出了巨大贡献 n后来出现了许多更优秀的分离方法,如 萃取,离子交换法等 n但是由于方法简便,实验条件易于满足, 共沉淀分离法在微量元素或放射性核 素分析中仍应用广泛。 镭的发现 2021/3/2612 居里夫妇发现镭时就 采取了共沉淀分离法 中的分级结晶技术。 镭的发现 返回 2021/3/2613 n良好的选择性 n定量性,能定量沉淀微痕量物质 n不干扰测定（或者至少易被除去或掩蔽） n便于与母液分离,易洗涤和过滤 n共沉淀效率高 应具有以下特点: 共沉淀分离法中所使用的常量沉淀物质叫做载 体（也称共沉淀剂） 2021/3/2614 n混晶共沉淀 n吸附共沉淀（包藏,吸留） n形

9、成单质晶核的共沉淀 n形成化合物的共沉淀 共沉淀分离法按使用载体的不同可分为无机共沉 淀和有机共沉淀两大类,另外还有盐析法 无机共沉淀: 按其作用机理,可分为以下几类: NEXT 2021/3/2615 有机共沉淀（简介） n有机共沉淀剂可用强酸强氧化剂破坏,或用灼烧挥发, 易消除干扰 n选择性高 n载体分子量大,富集效率高 有机共沉淀剂的显著优点 NEXT 2021/3/2616 （一）利用大分子胶体凝聚作用 常用丹宁（C76H52O46）,辛可宁（C19H22N2O）,动 物胶等 （二）以离子络合物形成共沉淀 常用阴离子有:卤离子,SCN-, 阳离子:甲基紫,罗丹明 例如,可在酸化的海水中

10、加入甲基紫和 NH4SCN,可定量沉淀低至0.2微克的铀。 有些载体的共沉淀效果类似 于萃取且不与共存离子反应, 叫做惰性共沉淀剂（固体萃 取剂）。其沉淀效果好 固体萃取 返回 2021/3/2617 生物大分子的沉淀分离生物大分子的沉淀分离 n中性盐沉淀（盐析法）中性盐沉淀（盐析法）:各种蛋白质和酶的分离纯化各种蛋白质和酶的分离纯化 n有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀:蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分 子的分离纯化子的分离纯化 n选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）:除去某些除去某些 不耐热的和在一定不耐热的和在一定pH值下

11、易变性的杂蛋白值下易变性的杂蛋白 n等电点沉淀等电点沉淀:氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀, 但此法单独应用较少但此法单独应用较少,多与其他方法结合使用多与其他方法结合使用 n有机聚合物沉淀有机聚合物沉淀: 是发展较快的一种新方法是发展较快的一种新方法, 主要使用主要使用 PEG聚乙二醇（聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂）作为沉淀剂 2021/3/2618 中性盐沉淀（盐析法）中性盐沉淀（盐析法） n在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐 析”。除了蛋白质和酶以外,多肽、多糖和核酸等都可以用盐 析法进行沉淀分离,204

12、0饱和度的硫酸铵可以使许多病 毒沉淀,43饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀,而tRNA保 留在上清 n盐析法应用最广的还是在蛋白质领域,已有八十多年的历史,其 突出的优点是: n成本低,不需要特别昂贵的设备。操作简单、安全。对 许多生物活性物质具有稳定作用。 2021/3/2619 中性盐沉淀蛋白质的基本原理中性盐沉淀蛋白质的基本原理 n蛋白质和酶均易溶于水,因为该分子的COOH、NH2和 OH都是亲水基团,这些基团与极性水分子相互作用形成水 化层,包围于蛋白质分子周围形成1nm100nm颗粒的亲水 胶体,削弱了蛋白质分子之间的作用力,蛋白质分子表面极 性基团越多,水化层越厚,蛋白质分

13、子与溶剂分子之间的亲 和力越大,因而溶解度也越大。 n亲水胶体在水中的稳定因素有两个:即电荷和水膜。 n因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性,所以 加入大量中性盐后,夺走了水分子,破坏了水膜,暴露出疏 水区域,同时又中和了电荷,破坏了亲水胶体,蛋白质分子 即形成沉淀。 2021/3/2620 中性盐的选择中性盐的选择 n常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4,因为它与其他常 用盐类相比有十分突出的优点: n溶解度大:尤其是在低温时仍有相当高的溶解度,这是其他 盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳 定,因而盐析操作也要求在低温下（04）进行。在0 时,（NH4）2SO4

14、仍有70.6的溶解度,远远高于其它盐类 n分离效果好:有的提取液加入适量硫酸铵盐析,一步就可以 除去75的杂蛋白,纯度提高了四倍。 n不易引起变性,有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋 白质用23mol/L的（NH4）2SO4 保存可达数年之久 n价格便宜,废液不污染环境 2021/3/2621 盐析的操作方法盐析的操作方法 n最常用的是固体硫酸铵加入法。欲从较大体积的 粗提取液中沉淀蛋白质时,往往使用固体硫酸铵,加 入之前要先将其研成细粉不能有块,要在搅拌下缓 慢均匀少量多次地加入,尤其到接近计划饱和度时, 加盐的速度更要慢一些,尽量避免局部硫酸铵浓度 过大而造成不应有的蛋白质沉淀。 20

15、21/3/2622 n各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由文献中查 出。硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分 数表示,称为百分饱和度。 2021/3/2623 盐析的影响因素 n 蛋白质的浓度:通常高浓度的蛋白质用稍低 的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来,但若蛋白 质浓度过高,则易产生各种蛋白质的共沉淀作 用,除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的 蛋白质,要使用更大的硫酸铵饱和度,共沉淀作 用小,分离纯化效果较好,但回收率会降低。 2021/3/2624 n pH值对盐析的影响:蛋白质所带净电荷越 多,它的溶解度就越大。改变pH值可改变蛋白质 的带电性质,因而就改变了蛋白质的溶解度。远 离等电点处

16、溶解度大,在等电点处溶解度小,因 此用中性盐沉淀蛋白质时,pH值常选在该蛋白质 的等电点附近。 2021/3/2625 n 温度的影响:对于蛋白质、酶和多肽等生物 大分子,在高离子强度溶液中,温度升高,它们的溶 解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白 质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。 n在一般情况下,对蛋白质盐析的温度要求不严格, 可在室温下进行。 n但对于某些对温度敏感的酶,要求在04下操 作,以避免活力丧失。 2021/3/2626 有机溶剂沉淀法 n其沉淀作用的原理主要是降低水溶液的介电常数,溶剂 的极性越大,介电常数越大,因而向溶液中加入有机溶 剂能降低溶液的介电常数,减小

17、溶剂的极性,从而削弱 了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力,增加了蛋白 质分子间的相互作用,导致蛋白质溶解度降低而沉淀。 n溶液介电常数的减少就意味着溶质分子异性电荷库仑 引力的增加,使带电溶质分子更易互相吸引而凝集,从 而发生沉淀。 n另一方面,由于使用的有机溶剂与水互溶,它们在溶解 于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分 子,破坏了蛋白质分子的水膜,因而发生沉淀作用。 2021/3/2627 有机溶剂沉淀法的优点 n优点: n分辨能力比盐析法高,即一种蛋白质或其它溶质 只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀 n沉淀不用脱盐,过滤比较容易 n缺点: n对某些具有生物活性的大分子容易引

18、起变性失 活,操作需在低温下进行 2021/3/2628 有机溶剂的选择和浓度的计算有机溶剂的选择和浓度的计算 n用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与 水互溶 n沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮 n沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀 剂是乙醇 2021/3/2629 n进行沉淀操作时,欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度, 需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算: V = V0 (S2 S1) (100S2) 式中: V = 需加入100浓度有机溶剂的体积 V0 = 原溶液体积 S1 = 原溶液中有机溶剂的浓度 S2 = 所要求达到的有机溶剂的浓度 n 100是指加入的有机溶剂浓

19、度为100,如所加入的有 机溶剂的浓度为95,上式的(100S2) 项应改为 (95 S2) 2021/3/2630 n上式的计算由于未考虑混溶后体积的变化和 溶剂的挥发情况,实际上存在一定的误差。 n有时为了获得沉淀而不着重于进行分离,可用 溶液体积的倍数:如加入一倍、二倍、三倍原 溶液体积的有机溶剂,来进行有机溶剂沉淀 2021/3/2631 有机溶剂沉淀的影响因素 n 温度:多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液 中,溶解度随温度降低而下降。值得注意的是大 多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂 中对温度特别敏感,温度稍高就会引起变性,且有 机溶剂与水混合时产生放热反应,因此有机溶剂 必须

20、预先冷至较低温度,操作要在冰盐浴中进行, 加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过 浓。一般规律是温度越低,得到的蛋白质活性越 高。 2021/3/2632 n样品浓度:低浓度样品要使用比例更大的有机溶剂 进行沉淀,且样品的损失较大,即回收率低,具有生 物活性的样品易产生稀释变性。但对于低浓度的样 品,杂蛋白与样品共沉淀的作用小,有利于提高分离 效果。 n反之,对于高浓度的样品,可以节省有机溶剂,减少 变性的危险,但杂蛋白的共沉淀作用大,分离效果下 降。 2021/3/2633 n pH值:有机溶剂沉淀适宜的pH值,要选择 在样品稳定的pH值范围内,而且尽可能选择 样品溶解度最低的pH值,通

21、常是选在等电点 附近,从而提高此沉淀法的分辨能力。 2021/3/2634 n 离子强度:离子强度是影响有机溶剂沉淀生物大分 子的重要因素。 n以蛋白质为例,盐浓度太大或太小都有不利影响,通常 溶液中盐浓度以不超过5为宜,使用乙醇的量也以不 超过原蛋白质水溶液的倍体积为宜,少量的中性盐 对蛋白质变性有良好的保护作用,但盐浓度过高会增 加蛋白质在水中的溶解度,降低了有机溶剂沉淀蛋白 质的效果, n通常是在低盐或低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。 2021/3/2635 n有机溶剂沉淀法经常用于蛋白质、酶、多糖和核酸等 生物大分子的沉淀分离, n使用时先要选择合适的有机溶剂,然后注意调整样品的 浓度、温度

22、、pH值和离子强度,使之达到最佳的分离效 果。 n沉淀所得的固体样品,如果不是立即溶解进行下一步的 分离,则应尽可能抽干沉淀,减少其中有机溶剂的含量, n如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂,以免影响样品 的生物活性 2021/3/2636 选择性变性沉淀法 n这一方法是利用蛋白质、酶与核酸等生物大 分子与非目的生物大分子在物理化学性质等 方面的差异,选择一定的条件使杂蛋白等非目 标物变性沉淀而得到分离提纯,称为选择性变 性沉淀法。 n常用的有热变性、选择性酸碱变性和有机溶 剂变性等。 2021/3/2637 热变性热变性 n利用生物大分子对热的稳定性不同,加热升高 温度使某些非目标生物大分子变

23、性沉淀而保 留目的物在溶液中。 n此方法最为简便,不需消耗任何试剂,但分离效 率较低,通常用于生物大分子的初期分离纯化。 2021/3/2638 表面活性剂和有机溶剂变性表面活性剂和有机溶剂变性 n不同蛋白质和酶等对于表面活性剂和有机溶剂 的敏感性不同,在分离纯化过程中使用它们可以 使那些敏感性强的杂蛋白变性沉淀,而目标物仍 留在溶液中。 n使用此法时通常都在冰浴或冷室中进行,以保护 目的物的生物活性 2021/3/2639 选择性酸碱变性选择性酸碱变性 n利用蛋白质和酶等对于溶液中酸碱不同pH 值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀,通常 是在分离纯化流程中附带进行的一个分离 纯化步骤 2021/

24、3/2640 等电点沉淀法等电点沉淀法 n等电点沉淀法是利用具有不同等电点的两性电解质,在 达到电中性时溶解度最低,易发生沉淀,从而实现分离 的方法。 n氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质,可以利用 此法进行初步的沉淀分离。但是,由于许多蛋白质的等 电点十分接近,而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍 有一定的溶解度,不能完全沉淀析出。 n因此,单独使用此法分辨率较低,效果不理想,因而此法 常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合 使用,以提高沉淀能力和分离效果。 n此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白,而不用于 沉淀目标物 2021/3/2641 有机聚合物沉淀法有机聚合物沉淀法 n

25、有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀 剂,最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和 病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。 n其中应用最多的是聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n 4)( Polyethylene Glycol 简写为 PEG ),它 的亲水性强,溶干水和许多有机溶剂,对热稳定,有 广泛围的分子量。 n在生物大分子制备中,用的较多的是分子量为 600020000的 PEG。 2021/3/2642 nPEG的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关,同时还受离子强 度、溶液pH和温度等因素的影响。 n在一定的pH值下,盐浓度越高,所需PEG时浓度越低,溶液的pH越接近 目的物的等电点,沉淀所需PEG的浓度越低。在一