生物化学实验报告论

1、 生物化学实验报告论文 班级:质量121 学号:20120844119 姓名:张瑶瑶一、前言 生物化学是一门联系生物和化学的一门科学学科，学习生物化学可以提高我们严谨的科学分析以及熟练的实验操作，本文主要讲了金黄色葡萄球菌核糖核酸酶的分离实验，金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，属于葡萄球菌属，可引起许多严重污染，本文主要通过 核酸酶活性的测定，考马斯亮蓝法测定蛋白质溶液浓度，DEAE-纤维素的处理及装柱，蛋白质亚基分子量测定SDS-PAGE凝胶电泳 二、实验材料准备 共分为四组，了解实验目的、方案 、原理 。 2.1、取已配制好的金黄色葡萄球菌于离心管内，8000 rpm离心除掉菌体，保留

2、上清（留1-2ml,p1）,用作后续实验。 2.2 、将锥形瓶中的金黄色葡萄球菌液体放到沸水中煮30分钟，10000rpm 离心，保留上清液（留1-2ml,p2）,用作后续实验。 2.3、将离心好的上清液取60ml进行75%硫酸铵饱和度沉淀实验，放置离心管，配平后4度冰箱中放置24小时。将硫酸铵沉淀液10000rpm离心，去上清，保留沉淀，缓冲液洗涤，方法是在第一支离心管中加入2ml缓冲液混匀倒入第二支离心管中，再取2ml于第一支离心管中洗一次，再倒入第二支离心管中，最后在第二支离心管中再加入2ml缓冲液。终体积为6ml（留0.5ml,p3）。 2.4、DEAE-纤维素的处理及装柱 2.4.1

3、、处理 本实验采用的是DEAE-纤维素DE52是弱酸型阴离子交换剂，具体处理方法为:先将DE52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5N的Hcl溶液中浸泡1h,再用无离子水或蒸馏水洗至pH4以上，并将其在抽滤中抽干；将抽干的离子交换剂浸在0.5N的NaOH溶液中1h,再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性。 2.4.2、装柱 将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱才，轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部；凝胶沉积至高度10cm处，停止装柱；夹上止液夹。 2.4.3、平衡 在柱层析上样前必须对层析柱进行

4、平衡，将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时（大于50ml平衡液），层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.001M Tris-HCl缓冲液PH9.0（内含0.0001M EDTA）,预先将DE-52柱进行平衡。 2.5、上样 平衡液50ml用于收集，收集30-40ml即可。然后装入透析袋，PEG2包埋，浓缩。收集浓缩液p4-x； 2.6、透析袋预处理 新的透析袋在沸水中煮沸10min.即可进行透析。三、核酸酶活性的测定 将甲苯胺蓝核酸琼脂溶化后，倒入平板中，凝固后，用直径为2mm的打孔器打孔，将琼脂取出，将待检酶液10ul,滴入孔中，置

5、于加有湿棉纱的湿盒内，在37培养4h,阳性反应在孔的周围会出现1mm以上的粉红圈，测量粉红圈的直径。四、 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 4.1、实验原理 考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高度敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm,考马斯亮G250-蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高度敏感度。在一定范围内，考马斯亮蓝 G250-蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可用于蛋白质浓度的测定。 4.2、实验仪器及用品 实验试剂:（1）水；（2）标

6、准蛋白液:牛血清蛋白（0.1mg/ml）;（3）染液:考马斯亮蓝G250（0.01%）,称取0.1g考马斯亮蓝G250 溶于50ml95%乙醇，再加入100ml浓磷酸，加蒸馏水定容到1000ml;（4）样品液:取牛血清白蛋白（0.1mg/ml）溶液，用0.9%NaCL稀释至一定浓度。 4.3、实验内容及步骤 4.3.1、标准曲线的绘制 4.3.2、取7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂试剂1234567标准蛋白液（ml）00.10.20.40.60.80.8样液S水(ml)1.00.90.80.60.40.20.2考马斯亮蓝染液（ml）4.04.04.04.04.04.04.0蛋白质浓度（m

7、l）01020406080未知A59500750.1060.2140.3500.4630.299 4.3.3、数据记录及处理 根据标准溶液的吸光度，在坐标纸上绘制出浓度-吸光度曲线，测出未知液的吸光度后，在标准曲线上查出未知液的浓度。 五、蛋白质亚基分子量测定SDS-PAGE凝胶电泳 5.1目的 掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量的基本原理和操作方法 5. 2、 原理 SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级，三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇，-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。因此，在样品和凝胶中

8、加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。 5. 3、试剂和器材试剂：1低分子量标准蛋白质 2待测 蛋白质样品 3凝胶贮液：30克丙烯酰胺，0.8克甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml蒸馏水中，过滤，于4暗处储藏，一个月内使用 4：1moll，ph8.8tris-HCl缓冲液，tris12.1g溶于蒸馏水，用浓盐酸调至PH8.8，以蒸馏水定容至100ml 5：10%

9、（wv）SDS 6：10%（wv）过硫酸铵溶液（当天配） 7：四甲基乙二胺（TEMED） 8：电极缓冲液PH8.3：Tris30.3g，甘氨酸144.2g，SDS10g，溶于蒸馏水并定容至1000ml，使用时稀释十倍 9：样品稀释液：SDS500mg，巯基乙醇1ml，甘油3ml，溴酚蓝4mg，1mollTris-HCL（pH6.8），用蒸馏水溶解并定容至10ml，按每份1ml分装，可在4存放数周，或在-20保存数月。以此液制备样品时，样品若为液体，则加入与阳平等体积的原液混合即可。10 固定液：500ml乙醇，100ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml 11脱色液：250ml乙醇，80ml冰

10、醋酸，用蒸馏水定容至1000ml 12染色液：0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中器材：微量进样针，电泳仪，电泳槽 5. 4操作步骤 5.4.1分离胶制备： 凝胶浓度12.5%，凝胶贮液12.5ml，Tris-HCLPH8.81molL11.2ml，水8.7ml，10%SDS0.3ml，10%过硫酸胺0.1ml，TEMED20L将上述胶液配好，混匀后，迅速加入两块玻璃板间隙中，使胶液面与矮玻璃和高玻璃之间形成凹槽处处平齐，而后插入“加样梳”，在室温下放置1小时左右，分离胶即可完全凝集。凝聚后，慢慢取出“加样梳”，取出时应防止把加样孔弄破，取出“加样梳”后，在形成的加样孔中加入

11、蒸馏水，冲洗未凝集的丙烯酰胺，倒出加样孔中的蒸馏水后，在加入已稀释的电极缓冲液。 5.4.2 样品制备：标准蛋白质制备，待测蛋白样品制备：液体待测样品，可取500L，加入等体积的“2样品稀释液”，混匀，在沸水浴中加热5min，取出，冷却至室温备用。若液体待测样品蛋白质浓度太稀可经浓缩后再制备。 5.4.3，点样用微量进样针吸取上述蛋白质样品20l分别加入到各个加样孔中，为了获得准确的结果，每个样品应做两次重复。 5.4.4，电泳将电泳槽与电泳仪连结，在电泳槽中加入已经稀释的电极缓冲液，打开电源，选择合适电压，保持恒电压300v，进行电泳，直至样品中燃料迁移至离下端1cm处，停止。 5.4.5，

12、固定，染色，脱色 将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中，置摇床上缓慢震荡30min以上（染色时间需要根据凝胶厚度适当调整）。取出凝胶在水中漂洗数次，再加入考马斯亮蓝脱色液，震荡。凝胶脱色至大致看清条带约需1h，完全脱色则需要更换脱色液2-3次，震荡达24h以上。凝胶脱色后可经过扫描、摄录等方法进行蛋白质定量检测。六、结果分析及讨论 6.1、核酸酶活性的测定的结果分析 P1:粉红圈内直径6.4mm ,外直径19.6mm P2:粉红圈内直径6.6mm,外直径19.8mm p3:粉红圈内直径6.8mm,外直径20.00mm p4:粉红圈内直径7.0mm,外直径22.00mm 6.2、考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的结果分析试剂1234567标准蛋白液（ml）00.10.20.40.60.80.8样液蛋白质浓度（ml）01020406080未知A5950.0750.1060.214