真核基因在大肠杆菌中的表达3

1、真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达 内容提纲内容提纲 真核基因的大肠杆菌表达体系真核基因的大肠杆菌表达体系 大肠杆菌的表达载体大肠杆菌的表达载体 真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达 影响真核基因表达效率的因素影响真核基因表达效率的因素 第一节第一节 真核基因的大肠杆菌表达体系真核基因的大肠杆菌表达体系 1. 1. 大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系 n基因工程的重要目标基因工程的重要目标 制备大量纯化的蛋白质产物制备大量纯化的蛋白质产物 因此，要选择能高水平表达异源真核蛋白的因此，要选择能高水平表达异源真核蛋白的 表达系统表达系统 n目前常用的表达系统目前常用

2、的表达系统 细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植 物和哺乳动物细胞等物和哺乳动物细胞等 背景清楚，特别是对其基因表达调控的分子机背景清楚，特别是对其基因表达调控的分子机 理研究的比较深入。理研究的比较深入。 安全安全(被被FDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物)， 且有多种不同的菌株和质粒载体。且有多种不同的菌株和质粒载体。 已有许多真核基因在大肠杆菌中实现高效表达。已有许多真核基因在大肠杆菌中实现高效表达。 培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进 行批量生产。行批量生产。 大肠杆菌表达系统的

3、优越性大肠杆菌表达系统的优越性 p真核基因与原核基因的差别：真核基因与原核基因的差别：编码基因的不连续编码基因的不连续 性，含有内含子序列，大肠杆菌不具备对性，含有内含子序列，大肠杆菌不具备对pre- RNA进行加工剪接的能力。进行加工剪接的能力。 pmRNAmRNA分子结构的差异：分子结构的差异：真核基因真核基因mRNA 5-mRNA 5-端有端有 帽子结构，帽子结构，3-3-端有端有poly(Apoly(A) )尾巴，影响其稳定性及尾巴，影响其稳定性及 与细菌核糖体结合的能力。与细菌核糖体结合的能力。 大肠杆菌表达真核基因的劣势大肠杆菌表达真核基因的劣势 p转录信号的不同：转录信号的不同：

4、真核基因转录的真核基因转录的mRNA不具不具 备结合细菌核糖体所必须的备结合细菌核糖体所必须的SD序列；细菌的序列；细菌的 RNA聚合酶不能识别真核启动子。聚合酶不能识别真核启动子。 大肠杆菌表达真核基因的劣势大肠杆菌表达真核基因的劣势 原 核 生 物 启 动 子 的 结 构 5 N N N N N T T G A C A N N N N N N N N N N N N N N N N N T A T A T T N N N N N N A N N N N 3 转转 录录 起起 始始 位位 点点- - 1 1 0 0 区区- - 3 3 5 5 区区 真 核 生 物 启 动 子 的 结 构 5

5、 N N N N N N N N N N N N N N N N N T A T A A A N N N N N N N N N N N N N N N N A N N N N 3 转转 录录 起起 始始 位位 点点- - 2 2 5 5 区区 T A T A T A p蛋白质产物的后修饰：蛋白质产物的后修饰：许多真核基因的蛋白质许多真核基因的蛋白质 产物存在翻译后的修饰过程，如磷酸化、糖基产物存在翻译后的修饰过程，如磷酸化、糖基 化等。大肠杆菌中无此过程，因此，表达的蛋化等。大肠杆菌中无此过程，因此，表达的蛋 白无法正确折叠，由此产生的三级结构通常是白无法正确折叠，由此产生的三级结构通常是

6、不可溶的，常形成包涵体，无活性。不可溶的，常形成包涵体，无活性。 p蛋白酶的降解：蛋白酶的降解：表达的真核蛋白质被细菌的蛋表达的真核蛋白质被细菌的蛋 白酶识别并降解。白酶识别并降解。 大肠杆菌表达真核基因的劣势大肠杆菌表达真核基因的劣势 解决方案解决方案 从真核细胞中分离完整加工的从真核细胞中分离完整加工的mRNA，采用反转，采用反转 录合成录合成cDNA，并连接到载体上，以克服内含子问，并连接到载体上，以克服内含子问 题。题。 如果知道蛋白质的氨基酸序列，且分子量不太大，如果知道蛋白质的氨基酸序列，且分子量不太大， 可以用化学方法合成不含内含子序列的寡聚核苷可以用化学方法合成不含内含子序列的

7、寡聚核苷 酸片断。酸片断。 将克隆的真核基因插入到原核启动子的下游。将克隆的真核基因插入到原核启动子的下游。 对于细菌中能降解真核蛋白的蛋白酶，可以通过对于细菌中能降解真核蛋白的蛋白酶，可以通过 突变的方法消除。突变的方法消除。 2. 2. 克隆基因正确表达的基本条件克隆基因正确表达的基本条件 n最基本条件：能够进行正常的转录和翻译最基本条件：能够进行正常的转录和翻译 转录：真核基因置于原核启动子的下游转录：真核基因置于原核启动子的下游 3-末端具有转录终止子末端具有转录终止子 翻译：翻译： mRNA分子具有分子具有RBS（ribosome binding site） 包括包括AUG或或GUG

8、和与和与16S rRNA 3-末端末端 互补的互补的SD（Shine-Dalgarno）序列。）序列。 n另一个重要条件：编码的蛋白质产物应能另一个重要条件：编码的蛋白质产物应能 维持正常的稳定性维持正常的稳定性 表达蛋白被大肠杆菌蛋白酶降解。表达蛋白被大肠杆菌蛋白酶降解。 蛋白质三级结构形成的速率与其稳定性有关。蛋白质三级结构形成的速率与其稳定性有关。 蛋白质三级结构的正确形成需要分子伴侣的参与。蛋白质三级结构的正确形成需要分子伴侣的参与。 大肠杆菌不可能对所有外源蛋白都存在正确的分大肠杆菌不可能对所有外源蛋白都存在正确的分 子伴侣。子伴侣。 第二节第二节 大肠杆菌的表达载体大肠杆菌的表达载

9、体 大肠杆菌表达载体的基本结构特征大肠杆菌表达载体的基本结构特征 核糖体结合位点核糖体结合位点 启动子启动子 转录终止子转录终止子 复制复制 起点起点 1. 1. 表达载体的基本成分表达载体的基本成分 u启动子（启动子（P P）：影响外源基因的表达水平）：影响外源基因的表达水平 使外源基因高水平表达必须具备的条件：使外源基因高水平表达必须具备的条件： 强启动子强启动子 启动子呈现一种低限的基础转录水平：表达的外启动子呈现一种低限的基础转录水平：表达的外 源蛋白可能对寄主细胞不利。源蛋白可能对寄主细胞不利。 诱导型启动子：能通过简单的方式使用廉价的诱诱导型启动子：能通过简单的方式使用廉价的诱 导

10、物使外源基因获得表达，如导物使外源基因获得表达，如IPTG、温度等。、温度等。 u转录终止子（转录终止子（TTTT） 上游启动子会抑制下游启动子上游启动子会抑制下游启动子 的转录功能的转录功能(启动子封堵作用启动子封堵作用)， 因此需要在克隆基因编码区的因此需要在克隆基因编码区的 3-末端接上一个有效的转录终末端接上一个有效的转录终 止子。止子。 转录终止子能增强转录终止子能增强mRNA分子分子 的稳定性，从而提高蛋白质产的稳定性，从而提高蛋白质产 物的水平。物的水平。 u翻译起始序列翻译起始序列：决定：决定mRNA翻译起始效率。翻译起始效率。 未鉴定出其保守结构，只能采取一些方法降未鉴定出其

11、保守结构，只能采取一些方法降 低低mRNA 5-末端二级结构的形成，增加末端二级结构的形成，增加RBS中中A、 T含量，碱基定点突变等含量，碱基定点突变等。 u增强子增强子：特殊的序列元件，能显著增强外源：特殊的序列元件，能显著增强外源 基因的表达效率。基因的表达效率。 u翻译终止子翻译终止子：必须存在终止密码子。：必须存在终止密码子。 构建表达载体时通常装上全部的三个终止密码子构建表达载体时通常装上全部的三个终止密码子 (UAA,UGA,UAG)，以阻止核糖体的跳跃现象。，以阻止核糖体的跳跃现象。 大肠杆菌最偏爱的密码子：大肠杆菌最偏爱的密码子：UAA 当为四联核苷酸当为四联核苷酸UAAU时

12、，终止效率进一步增强。时，终止效率进一步增强。 2. 2. 常用的大肠杆菌表达载体常用的大肠杆菌表达载体 LacLac启动子的表达载体启动子的表达载体 T7T7启动子的表达载体启动子的表达载体 Lac Lac启动子的表达载体启动子的表达载体 乳糖操纵子结构模型乳糖操纵子结构模型 nlac操纵子受操纵子受lac阻遏物的负调节。阻遏物的负调节。 n培养基中缺乏乳糖或其它诱导物时，培养基中缺乏乳糖或其它诱导物时， lac阻遏物同阻遏物同 操纵单元结合，关闭乳糖操纵子的活动。操纵单元结合，关闭乳糖操纵子的活动。 n培养基中加入乳糖或其它诱导物培养基中加入乳糖或其它诱导物(IPTG)时，同阻时，同阻 遏

13、物结合，使乳糖操纵子去阻遏。遏物结合，使乳糖操纵子去阻遏。 因此，我们可以通过加入因此，我们可以通过加入IPTG诱导来实现外源基诱导来实现外源基 因的表达。因的表达。 nLac操纵子的控制区，包括操纵子的控制区，包括核糖体核糖体结合区、结合区、RNA聚合酶聚合酶 结合区及阻遏物结合区都位于长结合区及阻遏物结合区都位于长203 bp的的HaeIII片断上。片断上。 n203 bp的的HaeIII片断含有片断含有Lac启动子、操纵单元及启动子、操纵单元及-半乳半乳 糖苷酶的前糖苷酶的前8个密码子。个密码子。 n将该片断插入到质粒中，构建含有将该片断插入到质粒中，构建含有lac启动子的质粒表达启动子

14、的质粒表达 载体。载体。 n这种多拷贝质粒中的操纵单元可以把大肠杆菌中所这种多拷贝质粒中的操纵单元可以把大肠杆菌中所 有的有的Lac阻遏物都结合掉，使细菌染色体的阻遏物都结合掉，使细菌染色体的-半乳半乳 糖苷酶基因解抑制。糖苷酶基因解抑制。 n含有质粒载体（含有质粒载体（Lac启动子、操纵单元）的大肠杆启动子、操纵单元）的大肠杆 菌能够合成菌能够合成-半乳糖苷酶，因此菌落在加有半乳糖苷酶，因此菌落在加有X- gal(底物底物)的琼脂平板上呈蓝色。的琼脂平板上呈蓝色。 n这种显色反应可用来快速鉴定阳性克隆。这种显色反应可用来快速鉴定阳性克隆。 T7 噬菌体启动子噬菌体启动子：它是来自：它是来自T

15、7噬菌体的启动噬菌体的启动 子，具有高度的特异性。子，具有高度的特异性。 只有只有T7 RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克聚合酶才能使其启动，故可以使克 隆化基因独自得到表达。隆化基因独自得到表达。T7 RNA聚合酶的效率聚合酶的效率 比大肠杆菌比大肠杆菌 RNA聚合酶高聚合酶高5倍左右倍左右 第三节第三节 真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达 1. 1. 外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 n细胞质中表达细胞质中表达：易形成包涵体：易形成包涵体 包涵体：由不可溶性蛋白聚集折叠形成，是外源基因高包涵体：由不可溶性蛋白聚集折叠形成，是外源基因高 效表达

16、时常发生的一种特殊生理现象。效表达时常发生的一种特殊生理现象。 包涵体形成的理化参数：包涵体形成的理化参数： 电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基的组分、半胱氨电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基的组分、半胱氨 酸的组分、脯氨酸的组分、亲水性和氨基酸残基的总数。酸的组分、脯氨酸的组分、亲水性和氨基酸残基的总数。 表达蛋白形成包涵体的优缺点：表达蛋白形成包涵体的优缺点： 优点：易于分离优点：易于分离 蛋白被保护而免受胞内酶的降解蛋白被保护而免受胞内酶的降解 蛋白质没有活性，不会对寄主细胞造成伤害蛋白质没有活性，不会对寄主细胞造成伤害 缺点：很难恢复生物学活性缺点：很难恢复生物学活性 蛋白质的终产量低

17、蛋白质的终产量低 解决方案：限制包涵体的形成解决方案：限制包涵体的形成 外源基因外源基因与分子伴侣共表达与分子伴侣共表达 分子伴侣：能够阻止聚合作用而使蛋白质正确折叠。分子伴侣：能够阻止聚合作用而使蛋白质正确折叠。 使用硫氧还蛋白缺陷的寄主菌株使用硫氧还蛋白缺陷的寄主菌株 目的：维持有利的氧化还原电位目的：维持有利的氧化还原电位 低温诱导，降低蛋白质的合成速率低温诱导，降低蛋白质的合成速率 与高可溶性的多肽融合表达与高可溶性的多肽融合表达 1. 稀释复性：稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增 加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。稀释法

18、主要有一次加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。稀释法主要有一次 稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。 2. 透析复性透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来 控制变性剂去除速度，但可能形成无活性蛋白质聚体，且不适控制变性剂去除速度，但可能形成无活性蛋白质聚体，且不适 合大规模操作，无法应用到生产规模。合大规模操作，无法应用到生产规模。 3. 超滤复性超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速 度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可度进行

19、控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可 能在超滤过程中不可逆的变性。能在超滤过程中不可逆的变性。 包涵体蛋白复性方法包涵体蛋白复性方法 4. 柱上复性柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种 复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分 成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。其中的凝胶柱复性均是用成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。其中的凝胶柱复性均是用 Sephacry1S-100或或Superdex75 等分子筛填料，柱较长等分子筛填料，柱较长 （40cm-100cm不等）。相比稀释

20、和透析两种方法，色谱柱不等）。相比稀释和透析两种方法，色谱柱 复性回收率高（高达复性回收率高（高达90%以上）、快速、易放大，样品稀释以上）、快速、易放大，样品稀释 倍数小（一般五倍左右）倍数小（一般五倍左右） 5. 高蛋白质浓度下的复性高蛋白质浓度下的复性：通常有两种方法，一是缓慢地连续：通常有两种方法，一是缓慢地连续 或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加 入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性；二是采入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性；二是采 用温度跳跃式复性，即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋用

21、温度跳跃式复性，即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋 白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速提白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速提 高温度以促进蛋白质折叠复性。高温度以促进蛋白质折叠复性。 6. 添加促进剂的复性方法添加促进剂的复性方法： 包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定 正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定 性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的 溶解性。溶解性。 a、

22、共溶剂：如、共溶剂：如PEG600020000、甘油等、甘油等 b、去污剂及表面活性剂：如、去污剂及表面活性剂：如Trition X-100、CHAPs 等等 C、氧化、氧化-还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加 入氧化还原体系，如入氧化还原体系，如GSH/GSSG 等等 d、0.40.6M L-Arg：L-Arg能使得不正确折叠的蛋白质结构以能使得不正确折叠的蛋白质结构以 及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可 大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率大幅度地提高包涵体蛋白

23、质的折叠效率 e、分子伴侣和折叠酶、分子伴侣和折叠酶 n周质中表达周质中表达 优点：周质中细胞蛋白少，有利于外源蛋白的纯化。优点：周质中细胞蛋白少，有利于外源蛋白的纯化。 周质中的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠。周质中的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠。 周质中蛋白质的降解作用小。周质中蛋白质的降解作用小。 条件：需要信号肽的引导，使表达蛋白由细胞内膜转条件：需要信号肽的引导，使表达蛋白由细胞内膜转 运到周质。运到周质。 蛋白转运过程相当复杂蛋白转运过程相当复杂 蛋白质跨膜过程还与细胞的结构特征有关。蛋白质跨膜过程还与细胞的结构特征有关。 即使存在信号肽，也不能保证蛋白正确转运到周即使存在信号肽

24、，也不能保证蛋白正确转运到周 质中。质中。 如：免疫球蛋白与如：免疫球蛋白与T-细胞受体分子结构相似。细胞受体分子结构相似。 免疫球蛋白可以在周质中表达。免疫球蛋白可以在周质中表达。 T-细胞受体不能在周质中表达。细胞受体不能在周质中表达。 n细胞外表达细胞外表达：易于分离纯化，但相当困难。：易于分离纯化，但相当困难。 原因：细菌细胞有两层膜，即内膜和外膜，表达蛋白原因：细菌细胞有两层膜，即内膜和外膜，表达蛋白 需跨越两层膜屏障。需跨越两层膜屏障。 解决方案：解决方案： 利用大肠杆菌固有的途径：将外源蛋白与利用大肠杆菌固有的途径：将外源蛋白与 E. coli分泌型蛋白融合表达。分泌型蛋白融合表

25、达。 增加增加E. coli细胞外膜的渗漏性：信号肽序列、细胞外膜的渗漏性：信号肽序列、 透化剂、与细菌素释放蛋白或具透化作用的基因共表达。透化剂、与细菌素释放蛋白或具透化作用的基因共表达。 2. 2. 融合蛋白的表达融合蛋白的表达 融合基因的概念：具有来自两个或两个以融合基因的概念：具有来自两个或两个以 上不同基因的核苷酸序列的新型基因。上不同基因的核苷酸序列的新型基因。 DNA体外重组构建的融合基因：体外重组构建的融合基因： 两个或以上不同基因的编码序列组成的融合基因：两个或以上不同基因的编码序列组成的融合基因： 编码产物为单一的多肽序列，称为融合蛋白、杂编码产物为单一的多肽序列，称为融合

26、蛋白、杂 种蛋白、嵌合蛋白。种蛋白、嵌合蛋白。 表达融合蛋白的策略表达融合蛋白的策略 F用融合载体表达融合蛋白质：在设计时注意外源基因与用融合载体表达融合蛋白质：在设计时注意外源基因与 靶基因连接后仍保持正确的读码框。靶基因连接后仍保持正确的读码框。 BamHI, SmaI, EcoRI, XbaI, NcoI, SalI XhoI, SacI, HindIII pGEX-KG 5.0 kb Ptac BspMI BalI PstI AlwN I pBR2332 ori Mlu I BstE II Nar I EcoR V BssH II Stop CodonsI GST Amp Lac I

27、GA ATT CTA GA Eco RIXba I 融合蛋白的纯化：融合蛋白的纯化： 利用与融合蛋白中的配偶体相对应的配体作为吸附剂，利用与融合蛋白中的配偶体相对应的配体作为吸附剂， 制备亲和层析柱。制备亲和层析柱。 通过配偶体与配体之间的相互作用，过柱的融合蛋白通过配偶体与配体之间的相互作用，过柱的融合蛋白 被滞留下来，其它蛋白则流出柱外。被滞留下来，其它蛋白则流出柱外。 通过洗脱处理，可回收到纯化的融合蛋白。通过洗脱处理，可回收到纯化的融合蛋白。 融合蛋白的切割：配偶体的存在可能影响融合蛋融合蛋白的切割：配偶体的存在可能影响融合蛋 白的功能。白的功能。 方法：方法： 化学切割：化学切割：如

28、溴化氰特异切割甲硫氨酸残基，如溴化氰特异切割甲硫氨酸残基，AUG不是不是 起始密码子时编码，适合链内不含起始密码子时编码，适合链内不含甲硫氨酸残基的多肽甲硫氨酸残基的多肽 的切割。的切割。 Met GST 外源蛋白 酶切割：酶切割：如凝血因子如凝血因子Xa，在融合基因之间插入编码，在融合基因之间插入编码Xa 的识别序列，融合蛋白纯化后可用的识别序列，融合蛋白纯化后可用Xa切除大肠杆菌的多切除大肠杆菌的多 肽，得到天然的目标蛋白。肽，得到天然的目标蛋白。 Ile-Glu-Gly-Arg GST 外源蛋白 3. 3. 外源蛋白在大肠杆菌中的稳定性外源蛋白在大肠杆菌中的稳定性 影响因素：影响因素：

29、蛋白的酶解作用：细菌细胞的蛋白酶能选择性地酶蛋白的酶解作用：细菌细胞的蛋白酶能选择性地酶 解异常蛋白质，包括外源蛋白。解异常蛋白质，包括外源蛋白。 解决方案：解决方案：外源蛋白在周质或胞外表达外源蛋白在周质或胞外表达 使用蛋白酶缺陷的菌株使用蛋白酶缺陷的菌株 低温培养、与分子伴侣共表达低温培养、与分子伴侣共表达 消除蛋白酶切割位点、目标蛋白的疏水性修饰消除蛋白酶切割位点、目标蛋白的疏水性修饰 结构决定因子：结构决定因子：N-氨基酸性质及内部的氨基酸性质及内部的PEST序列序列 N-端法则：端法则：N-端为精端为精aa、赖、赖aa、亮、亮aa、苯丙、苯丙aa、酪、酪aa、色、色aa时，蛋时，蛋

30、白质的稳定性差。白质的稳定性差。 N-端附近的内部赖端附近的内部赖aa是遍在蛋白质的受体，易受依赖于遍在蛋白质是遍在蛋白质的受体，易受依赖于遍在蛋白质 的蛋白酶降解。的蛋白酶降解。 PEST序列：指真核蛋白中富含脯序列：指真核蛋白中富含脯aa、谷、谷aa、丝、丝aa、苏、苏aa的区段，的区段， 易发生胞内降解，该序列的磷酸化作用增加了与钙离子结合，从而易发生胞内降解，该序列的磷酸化作用增加了与钙离子结合，从而 促进依赖于钙离子的蛋白酶的降解。促进依赖于钙离子的蛋白酶的降解。 表达部位：周质与胞外所含蛋白酶较少，在这些部位表达部位：周质与胞外所含蛋白酶较少，在这些部位 表达的蛋白不易被降解。表达

31、的蛋白不易被降解。 分子伴侣的稳定作用：阻止聚合作用，促进蛋白质的分子伴侣的稳定作用：阻止聚合作用，促进蛋白质的 正确折叠。正确折叠。 一种分子伴侣的超量表达无法使蛋白正确折叠，不同一种分子伴侣的超量表达无法使蛋白正确折叠，不同 类型分子伴侣彼此协调参与蛋白质的折叠。类型分子伴侣彼此协调参与蛋白质的折叠。 如何提高目的蛋白的可溶性表达如何提高目的蛋白的可溶性表达 1.降低蛋白合成的速度。可以通过以下降低蛋白合成的速度。可以通过以下 方法实现：方法实现： a.降低培养温度降低培养温度 b.使用弱启动子使用弱启动子 c.使用低拷贝数的质粒表达载体使用低拷贝数的质粒表达载体 d.降低诱导物的浓度降低

32、诱导物的浓度 2. 改变培养基。改变培养基。 a.培养基中加入可以帮助蛋白折叠的因子培养基中加入可以帮助蛋白折叠的因子 b.加入缓冲液保持加入缓冲液保持pH稳定稳定 c.加入加入1%的葡萄糖，抑制的葡萄糖，抑制lac启动子启动子 d.加入山梨糖醇等可以稳定蛋白天然结构加入山梨糖醇等可以稳定蛋白天然结构 的因子的因子 e.加入乙醇、硫醇等加入乙醇、硫醇等 3.与分子伴侣或折叠酶共表达。与分子伴侣或折叠酶共表达。 常用的分子伴侣有：常用的分子伴侣有： GroES-GroEL DnaK-DnaJ-GrpE ClpB 常用的折叠酶有：常用的折叠酶有： peptidyl prolyl cis/trans

33、 isomerases (PPIs) disulfide oxidoreductase (DsbA) and disulfide isomerase (DsbC) protein disulfide isomerase (PDI) 4.分泌表达：使目的蛋白分泌到周质空间。分泌表达：使目的蛋白分泌到周质空间。 n周质空间的氧化性的环境有利于二硫键的周质空间的氧化性的环境有利于二硫键的 形成，而胞内则是还原性的。形成，而胞内则是还原性的。 n周质空间有折叠酶周质空间有折叠酶DsbA和和DsbC的存在，的存在， 帮助蛋白正确折叠。帮助蛋白正确折叠。 n周质空间很少有蛋白酶存在，不会被水解。周质空间很

34、少有蛋白酶存在，不会被水解。 n可以使对细胞有毒性的蛋白大量存在。可以使对细胞有毒性的蛋白大量存在。 5.使用特定的菌株。使用特定的菌株。 nAD494, which has a mutation in thioredoxin reductase (trxB). nOrigami，a double mutant in thioredoxin reductase (trxB) and glutathione reductase (gor). 6.与可溶性多肽融合表达。与可溶性多肽融合表达。 7.表达目的蛋白的一个片段。大于表达目的蛋白的一个片段。大于 70 kDa的的 蛋白在大肠杆菌中是很难表达

35、的。蛋白在大肠杆菌中是很难表达的。 8.体外去折叠，重新折叠。体外去折叠，重新折叠。 第四节第四节 影响真核基因表达效率的因素影响真核基因表达效率的因素 n影响因素影响因素： 启动子的强度、启动子的强度、DNA转录起始序列转录起始序列 密码子的选择、密码子的选择、 mRNA的二级结构的二级结构 转录的终止、质粒的拷贝数及稳定性转录的终止、质粒的拷贝数及稳定性 寄主细胞的生理特征等寄主细胞的生理特征等 1. 5-UTR1. 5-UTR对克隆基因表达效率的影响对克隆基因表达效率的影响 v启动子结构的影响：启动子结构的影响： 启动子序列具有启动子序列具有2种保守序列，即种保守序列，即-35区区(5-

36、TTGACA)和和- 10区区(5-TATAAT)。启动子序列与此越相似，其表达能。启动子序列与此越相似，其表达能 力越强。力越强。 -35区和区和-10区之间的距离：也是影响克隆基因表达效率的区之间的距离：也是影响克隆基因表达效率的 重要因素。距离越接近重要因素。距离越接近17bp，启动子的活性越强，启动子的活性越强。 对于某些启动子，对于某些启动子，-35区上游的区上游的10-100bp序列：起上游激序列：起上游激 活物的作用。活物的作用。 v启动子与克隆基因之间距离的影响：启动子与克隆基因之间距离的影响： 发生发生2-3nt长度的变化，就能显著影响翻译的效率。长度的变化，就能显著影响翻译

37、的效率。 与质粒与质粒mRNA 5-端的二级结构有关：端的二级结构有关：SD序列或序列或AUG密码子参与密码子参与 mRNA分子的碱基配对会明显降低分子的碱基配对会明显降低mRNA的翻译效率。的翻译效率。 要获得良好表达，要获得良好表达， AUG密码子或密码子或SD序列必须处于易接触的部位，以序列必须处于易接触的部位，以 利于与核糖体结合起始翻译过程。利于与核糖体结合起始翻译过程。 mRNA 5-末端与末端与SD序列的距离也是影响翻译效率的重要因素，距离序列的距离也是影响翻译效率的重要因素，距离 小于小于15nt时，翻译效率会显著下降。时，翻译效率会显著下降。 v提高克隆基因表达效率的方案：提

38、高克隆基因表达效率的方案： 建立克隆库：使目的基因放置在与启动子不同距离的位建立克隆库：使目的基因放置在与启动子不同距离的位 置上，从重组体中筛选产量最高的克隆。置上，从重组体中筛选产量最高的克隆。 对于表达产物难以测定的基因，可先将其对于表达产物难以测定的基因，可先将其N-端片断与报端片断与报 告基因融合，再建立克隆库，通过报告基因产物的活性告基因融合，再建立克隆库，通过报告基因产物的活性 来筛选克隆基因有效表达的重组菌落。最后将该质粒中来筛选克隆基因有效表达的重组菌落。最后将该质粒中 的报告基因用克隆基因的的报告基因用克隆基因的C-端片断替换端片断替换，即得到高效表，即得到高效表 达克隆基

39、因的重组质粒。达克隆基因的重组质粒。 质粒的拷贝数的影响：质粒的拷贝数的影响： 提高表达效率的途径：增加提高表达效率的途径：增加mRNA的数量。影响的数量。影响mRNA合合 成速率的因素有两种，即启动子的强度和基因的拷贝数。成速率的因素有两种，即启动子的强度和基因的拷贝数。 提高基因的拷贝数：将其克隆到高拷贝数的质粒载体上。提高基因的拷贝数：将其克隆到高拷贝数的质粒载体上。 质粒的不稳定性的影响：发生质粒丢失质粒的不稳定性的影响：发生质粒丢失 保持抗生素的选择压力保持抗生素的选择压力 将质粒分配功能区将质粒分配功能区par克隆到质粒载体上克隆到质粒载体上 2. 2. 质粒的生物学特性对表达效率的