苦参碱对脐静脉内皮细胞一氧化氮合酶基因表达的影响(一).doc

1、苦参碱对脐静脉内皮细胞一氧化氮合酶基因表达的影响(一 )【摘要】目的观察不同浓度苦参碱对人脐静脉内皮细胞一氧化氮生成及一氧化氮合酶活性的影响。方法采用体外培养第3 代人脐静脉内皮细胞。实验分为6 组，即对照组、 不同浓度苦参碱组 (50、100、 200、500 和 1000g/L)。各组细胞于培养24h 后收集标本，用Griess 法检测培养上清中一氧化氮水平，并测定人脐静脉内皮细胞的一氧化氮合酶活性及用内参半定量法分析 iNOSmRNA 的变化。 结果不同浓度苦参碱组一氧化氮含量和一氧化氮合酶活性、RNA的表达水平较对照组明显升高(P 0.05) 。结论苦参碱可增加人脐静脉内皮细胞的一氧化

2、氮合酶活性和一氧化氮产生及RNA 的表达水平。【关键词】苦参碱；一氧化氮合酶活性；内皮细胞；一氧化氮Abstract：ObjectiveToinvestigateeffectsofconstantmatrineonnitricoxide(NO)productionandnitricoxidesynth ase(NOS)activityinhumanumbilicalveinendothelialcells(HUVEC).MethodsThethirdpassageofculturedHUVECwereused.Thecellsweredividedintosixgroups：controlgr

3、oup，diferentmatrinegroup(50 g/L，100 g/L，200 g/L，500 g/L，1000 g/L)Sampleswerecollected24hafterculturing.NOlevelsinthesupernatantweredeterminedusingGriessreagent，andNOSactivityofhUVECwasdedected.andiNOSmRNAwastsNOlevels、NOSactivity、thelevelofmRNAexpressioninmatrinegroupweresignificantlyhigherthanthati

4、ncontrols(P0.05).ConclusionMatrinecanexctlyantagonizetheeffectsonNOproduction.TheiNOSmRNAexpressionwillincreasedwhenthematrinedosagereachesacertainlevel.Keywords：endothelialcells ；nitricoxide ； nitricoxidesynthase苦参 (SophovaFlavescensAit)是豆科槐属植物苦参的干燥根， “性寒味苦 ”入心、脾、肾三经，始载于神农本草经 ，列为中品， 谓其 “主心腹积气， 瘕积聚

5、”，能 “安五脏， 定志益精 ”。本草经百种录称 “此以味治也，苦入心，寒除火，故苦参专治心经之火 ”。苦参中的活性成分苦参碱 (Matrine) 具有较为广泛的生物学作用。据报道苦参碱具有镇咳、平喘、抗炎、降血脂等作用 1-4。本研究观察了苦参碱对内皮细胞一氧化氮的影响，以探讨苦参碱改善血管内皮功能的可能性，为预防动脉粥样硬化(AS)提供依据。1 材料和方法1.1 材料细胞 M199 培养基、 10mmol/LN-2- 羟乙基哌嗪 -N-2-乙磺酸 (HEPES)、10%胎牛血清、 100U/mL 青霉素、100g/mL 链霉素，DAB 显色试剂盒为北京中山生物工程公司产品， Trizo 为

6、 Invitrogen 公司产品， PCR试剂盒为 Takara公司产品。 CMIAS多功能真彩图像分析仪为北京航空航天大学产品。1.2 方法1.2.1HUVEC的培养和鉴定取新鲜婴儿脐带， D-Hanks 液冲洗， 注入 0.1mg/L 胶原酶， 置 37 D-Hanks 液中消化15min ，收集酶液， 1000r/min 离心 5min ，弃上清，加入完全培养基重悬，以 2105/mL的密度接种于培养瓶，于 37、饱和湿度、 50mL/LCO2 条件培养， 24h 后换液。待细胞长满瓶后， 1g/L 胰酶消化、传代 3 5 代细胞用于实验。1.2.2 实验分组及处理取生长状况良好的第3

7、代细胞，以1107个细胞数接种于96 孔板，每孔加入100L细胞悬液，每组 5 个复孔，并同时进行细胞爬片。细胞在接近融合生长时，换用无血清培养基培养24h。实验随机分为 6 组：对照组不予苦参碱干预；苦参碱组在培养基中加入苦参碱，剂量分别为 50、100、200、500、 1000g/L。各组细胞接种数目及培养条件一致，均于24h 后收集培养液和细胞标本。1.2.3 一氧化氮浓度测定用 Griess 法测定培养基中一氧化氮的稳定代谢产物亚硝酸盐(NO2-)浓度。测定方法按照NO试剂盒说明书操作。收集的培养液与Griess 试剂 1%对氨基苯磺酰胺，0.1%N(1 萘基 )乙二胺， 2.5%磷

8、酸反应， 721 分光光度计检测，从亚硝酸钠标准曲线上换算NO 值，以 fmol/d表示。1.2.4 一氧化氮合酶 (NOS)活性测定按照 NOS试剂盒说明书操作。 NOS活性测定原理： NOS催化 L-精氨酸和分子氧反应形成NO，NO 与亲合性物质生成有色化合物，在 530nm 波长下测定吸光度， 以此代表细胞NOS活性。细胞破碎采用超声波法裂解，蛋白定量采用Lowry 法。酶活性定义为每毫克组织蛋白酶中生成 1nmolNO 为一个活性单位。 NOS 活性 =(测定管吸光度 -空白管吸光度 ) 呈色物纳摩尔消光系数 (反应液总体积 取液量 ) 1/(比色光径 时间 ) 样品蛋白质含量，其中呈

9、色物纳摩尔消光系数为 38.3 10-。61.2.5RNA 的提取及筛选以 Trizol 试剂提取细胞总用核酸定量仪测定样品在RNA。经 0.9%琼脂糖凝胶电泳 (50mV， 1h)确定提取 RNA 的质量。 260nm 处的吸光度 (1A=40g/mL)，确定 RNA 的浓度。所用 RNA 的A260/A280 应控制在1.80 以上。1.2.6RT-PCR取 1LRNA(1g/L)作 cDNA 模板，以oligodT 为引物，按试剂盒操作顺序依次加样，总反应体积为 20L，反应混合物于 42孵育 45min ，目的基因 iNOS 引物序列及内参物 -actin 引物序列参照文献 5设计。

10、iNOS 引物序列为：上游 5-CCAGCTAGCCAAAGTCACCAT；-3下游5-GTCTCGGAGCCATACAGGATT；-扩3增产物为 353bp. -actin(5 )，5-caccacaccttctacaatgagc-3； -actin(3 )，3-gtgatctccttctgcatcctgt-3 扩增产物为 695bp 。将逆转录产物进行 iNOS 和 -actin 同管扩增。条件为 94变性后进行下列循环： 94 30s，5730s，72 40s，循环 30 次。扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳 (110mV，30min) 分析测定 A 值。 R=(NOS背-景 )/( -actin 背景 )，R为 iNOSmRNA相对于 -actin 的相对含量。1.3 统计学方法数据以 ( 表s)示，进行ANOVA 统计学分析，P0.05 为差异有统计学意义。2 结果21 苦参碱对一氧化氮浓度和NOS 活性的影响 (表 1)表 1 对人内皮细胞中NO 和 NOS活性的影响 (略)HUVEC与苦参碱共同培养24h，细胞上清 NO 浓度和对照组相比差异有统计学意义(