H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备、鉴定及其模拟表位的筛选

1、H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的 制备、鉴定及其模拟表位的筛选 禽流感 禽流感血凝素 HA功能 HA表位 文献综述 丝状噬菌体具有一条单链 环状DNA基因组 外源基因整合到噬菌体基 因组中 外源蛋白与噬菌体衣壳蛋 白融合表达,展示在噬菌体 表面 噬菌体原理 文献综述 n针对当前禽流感病毒的流行趋势，有必要研制 良好特异的单克隆抗体，以加强我国亚型 高致病性禽流感病原学的监测工作。 nHA是刺激机体产生中和抗体主要抗原，利用中 和性的单抗和分子生物学手段分析流感病毒的 中和表位，可以为表位疫苗的研制奠定基础。 制备抗H5亚型禽流感病毒HA的单克隆抗体 单抗纯化 单抗鉴定 噬菌体淘筛 测序鉴定

2、 阳性噬菌体抗血清制备 技技 术术 路路 线线 HI试验中和试验 模拟肽功能确定 单克隆抗体的制备流程单克隆抗体的制备流程 技术路线 n将抗体固相化，再加入 噬菌体肽库与其结合。 n通过洗脱，即可收集到 带有目的多肽的重组噬 菌体。 n将这些噬菌体侵染大肠 杆菌而得到进一步扩增。 n经过34轮的筛选可获 得与抗体结合紧密的噬 菌体克隆 噬菌体技术 技术路线 结果与分析结果与分析 杂交瘤细胞的制备 DW毒毒株 /Chicken/Hubei/327/2004) 13 l杂交瘤细胞染色体数目均高于两亲本细胞染色体数目 单抗1D111H82B72C92H44C9 细胞上清HI效价21212121242

3、2 腹水HI效价2727272821229 单抗1C41D41E122E114C124G25E12 细胞上清HI效价27242425252525 腹水HI效价218210213216214214216 l 腹水HI效价要比上清高611个滴度 注：+表示HI试验阳性，表示HI试验阴性 AIVH5 中和效价（Neutralization titer） 1H81D112B72C92H44C9 A/CK/Hubei/327/20041:731:7241:20481:163841:14451:2048 A/Goose/ZF/ZFE/20041:1091:40961:16241:163841:40961:

4、5236 A/CK/XF/XFJ/20041:271:6311:1001:163841:1781:128 A/Duck/XF/XFY/20041:2561:40961:40961:163841:81921:6457 第2批单抗对病毒A/CK/Hubei/327/2004A/CK/Hubei/327/2004的中和效价 单抗 McAbs 1C41D41E122E114C124G25E12 中和效价 Neutralization titer 1:327681:47321:223871:327681:100001:327681:32768 1C4 2E12 4G2 5E12 1E12 4C121D4

5、 1C4 2E12, 5E12 4G2 4C12 1E121D4 M： protein marker 1： Mcab 1C4 单抗单抗1C4提纯后提纯后SDS-PAGE（12）电泳图）电泳图 提纯后的抗体可见有两条带，一条重链带50Kd左右， 一条轻链带27Kd左右 轮数 Round 加入物 Input 洗脱物 Output 产出率 Vield 第一轮 first round 1.3210111.461021.11109 第二轮 second round 10111.171039.75109 第三轮 third round 10116.41053.28106 第四轮 fourth round

6、10116.31073.18104 四轮亲和筛选对噬菌体的富集 以纯化单抗1C41C4为筛选配基，进行了四轮淘筛，随 着淘筛次数增加，产出率都在提高 图3-2 噬菌体结合活性分析图3-2 噬菌体结合活性分析 Fig.3-2 The detection binding of phage clone to BSA and McAb1C4 by ELISA 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 123456789101112131415 噬菌体克隆 A630 BSA McAb 1C4 竞争抑制实验结果竞争抑制实验结果 取其中阳性噬菌体扩增液上清与不同浓度的H5亚型 禽流感病毒等体积混合，加入到单抗1C4包被的酶标板中，其余 操作步骤同ELISA 抑制率（未抑制630-抑制630）/未抑制630100。 12481632 0 10 20 30 40 50 60 率 制 抑 病毒稀释倍数 % 小小 结结 共获得13株特异性的针对HA的单克隆抗体，其中有5株 单抗的HI效价大于214，最高可达218。这些单抗具有良 好的亚型特异性，为流