实验四、PCR基因扩增

1、PCR基因扩增基因扩增 实验四实验四 一、实验目的一、实验目的 1）学习掌握PCR反应原理 2）掌握PCR技术的操作过程 3）通过PCR获得银杏黄酮代谢过程中的一个关键酶基因CHS基 因（查尔酮异构酶基因） 二、二、实验原理实验原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA 模板加热变性解链， 随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序 列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以 延伸。 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就 是在合适条件下的这种循环的不断重复。 三、实验试剂、材料、仪器三、实验试剂、材料、仪器 试剂试剂：Taq DNA聚合酶

2、，PCR缓冲液（含MgCl2），dNTP （每种2.5mmol/L）混合物，引物(终浓度各0.5mol/L) ；琼脂糖， 50TAE 缓冲液，无菌双蒸水等 材料材料：银杏DNA 仪器仪器：微量移液器，吸头，0.2ml PCR薄壁管，PCR仪，台式 离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉等 四、操作步骤四、操作步骤 1）取一个干净的PCR薄壁管 2）往PCR管里面加入各种试剂： 1l Primer1 1l Primer2 1l DNA模板 15l PCR反应液 12l 无菌ddH2O 30l Note 3）设定好PCR反应程序如下： 95 4 min 95 50s 61 1.5 min 35 cyc

3、les 72 2min 72 10 min End 4）开始PCR 5）1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果 五、注意事项五、注意事项 ）PCR非常灵敏， 注意移液器的规范使用，保证各种反应试剂吸取 的精确性。 ）所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染；吸头、离心管应高压 灭菌，每次吸头用毕应更换，不要互相污染试剂。 3） PCR的所用试剂应在冰浴上化开，并且要充分混匀 。 六、作业 1）将你PCR实验结果的电泳图片附在实验报告上，并根据图片分析你 扩增的结果 2）思考：有哪些因素会影响PCR的质量？ DNA的结构（的结构（1） 三磷酸核糖核苷NTP 三磷酸脱氧核糖核苷dNTP 三磷酸双脱氧核糖核苷

4、ddNTP 补充：补充：PCR 原理原理 DNA的结构（的结构（2） A腺嘌呤 G鸟嘌呤 C胞嘧啶 U尿嘧啶 T胸腺嘧啶 五 种 碱 基 A-T C-G DNA的结构（的结构（3） 氢键维持了DNA的双螺旋结构 DNA的复制（的复制（1） 3-OH进攻5- Pi DNA聚合酶催化 DNA的延伸方向:5-3 DNA的复制（的复制（2） DNA复制相关蛋白在复制起始点打开双链DNA，然后DNA解链 酶结合到单链DNA上进一步解开双链DNA DNA的复制（的复制（3） DNA的复制的复制 和和 体外的模拟体外的模拟 模板（母链） 细胞内源 外源加入 打开双链 解链酶 加热变性 维持单链 单链结合蛋白

5、 高温 引物 引物合成酶 外源加入 底物dNTP 细胞内源 外源加入 聚合酶 细胞内源 外源加入 反应环境 细胞内环境 缓冲液 PCR循环循环-变性变性 PCR循环循环-变性变性 PCR循环循环-变性变性 PCR循环循环退火退火 PCR循环循环延伸延伸 PCR循环循环延伸延伸 PCR循环循环延伸延伸 PCR循环循环延伸延伸 PCR整个过程整个过程 讨论讨论1：为何酶促反应需要那么高的温度：为何酶促反应需要那么高的温度 v为了确保模板是单链，尤其是第一次反应的模板 v防止非特异性的引物退火 v延伸的温度必须大于退火温度，而小于变性温度 DNADNA聚合酶不能热变性，所以选用耐高温的聚合酶聚合酶不

6、能热变性，所以选用耐高温的聚合酶 常规用的PCR DNA聚合酶是从一种嗜热细菌分离出来的DNA聚合酶。 酶活性在100 条件下，能保持几个小时。而其最适合酶促温度在72 左右。 讨论讨论2：影响：影响PCR质量的一些因素质量的一些因素 模板：选用纯度较高的DNA作模板，杂质蛋白和RNA的存在都会影响 到DNA聚合酶与引物和模板的结合。 目的片断：目的片断或者目的片断相邻的DNA含GC量较高，或者有重 复序列存在，都会导致二级结构的存在。可在反应体系里加入DMSO， 破坏模板的二级结构。 引物的设计：引物太短，要求退火的温度就低，错配的可能性就大， 再者，两条引物不能存在较长的互补片断 。 酶：

7、纯度、可信度，碱基错配率1/10000。 讨论讨论3：PCR的应用的应用 q从蓝藻里面克隆从蓝藻里面克隆SODSOD (超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶) SOD作用：清除人体内细胞中自由基 抗氧化、抗辐射、消炎、抗衰老、抗癌 高压氧中毒、肺气肿、糖尿病、早衰 食品、保健品、药品、化妆品 基因库检索 SOD的序列 设计引物以蓝藻总DNA位模板做PCR 获得的基因片断连接在表达载体原核表达蛋白 讨论讨论3：PCR的应用的应用 q检测粉末样品是否含检测粉末样品是否含 有炭疽杆菌有炭疽杆菌 炭疽菌恐慌，降临美国，席卷全球 生命力强、传染快、发作快、死亡率高。 有两对引物是根据编码炭疽杆菌EF因子的基因序列设计的，仅与各 种炭疽杆菌的EF因子同源。PCR产物是1247bp和208bp的片断。非炭疽 杆菌均呈阴性。 用营养肉汤培养2小时取培养液直接作PCR PCR技术是现代分子生物学实验技术的一项技术是现代分子生