保护酶活性测定方法过氧化物酶POD活性测定1酶液的制备.doc

1、保护酶活性测定方法一、过氧化物酶（POD ）活性测定1、 酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布4过滤，定容至 10ml ，低温离心 （ 1210 r/min,04 ）15min, 取上清夜置于低温冰箱备用。2、 试剂：0.05 mol/L pH 5.5 磷酸缓冲液0.05 mol/L愈创木酚溶液（2-甲基酚）20%三氯乙酸溶液2%H 2O23、 仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管4、 过氧化物酶活性测定：（1）加入反应混合液2.9 ml 磷酸缓冲液1 ml 愈创木酚溶液（2-甲基酚）1 ml H 2O20.1m

2、l 酶液（2） 37水浴锅中保温15min, 迅速转入冰浴，并加入2ml 三氯乙酸溶液终止反应（3）过滤，适当稀释。在470nm 处测 OD 470。5、 结果计算：以每分钟内OD 变化 0.01 为 1 个酶活力单位。即酶活力 =OD D / 0.01t酶的比活力 = ODD / （ 0.01tw ）其中： OD为反应时间内吸光度的变化W为材料鲜重t 为反应时间D 为稀释倍数。即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数二、多酚氧化酶（PPO ）活性测定1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8 的磷酸缓冲液少量，用粗纱布1过滤，定容至10ml ，低温离心（12104r

3、/min,04 ） 15min, 取上清夜置于低温冰箱备用。2、试剂：0.05 mol/L pH 5.5磷酸缓冲液0.05mol/L 儿茶酚溶液（邻苯二酚）20% 三氯乙酸溶液2%H 2O23、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管4、多酚氧化酶活性测定：（1）加入反应混合液3.9 ml 磷酸缓冲液1 ml 儿茶酚溶液0.1ml 酶液（2） 37水浴锅中保温15min, 迅速转入冰浴，并立即加入2ml 三氯乙酸溶液终止反应。（3）过滤，适当稀释。在525 nm 处测 OD 525。（4）结果计算：以每分钟内OD 变化 0.01 为 1 个酶活力单位。即酶活力 =OD D /

4、 0.01t酶的比活力 = ODD / （ 0.01tw ）其中： OD为反应时间内吸光度的变化W为材料鲜重t 为反应时间D 为稀释倍数。即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数三、超氧物歧化酶（SOD）活性测定1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8 的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至10ml ，低温离心（12104r/min,04 ） 15min, 取上清夜置于低温冰箱备用。2、试剂：14.5 m mol/L甲硫氨酸溶液（A ）310-3 m mol/L乙二胺四乙酸（B）2.25 m mol/L氯化硝基四氮唑蓝（C）26010-3 mol/L核黄素（ D ）

5、0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液3、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管4、超氧物歧化酶活性测定：（1）加入反应混合液甲硫氨酸溶液（A ）3 ml乙二胺四乙酸（B ）2 ml氯化硝基四氮唑蓝（C）2 ml核黄素（ D ）2 ml（2）在盛有反应混合液3 ml 的试管中，加入0.1ml 酶液，混合后放在透明的试管架上，在 25生化培养箱中，光照15min，并立即遮上黑布终止反应。（3）过滤，适当稀释。在560 nm 处测 OD 560。（4）结果计算：以每分钟内OD 变化 0.01 为 1 个酶活力单位。即酶活力 =OD D / 0.01t酶的比活力 = ODD

6、 / （ 0.01tw ）其中： OD为反应时间内吸光度的变化W为材料鲜重t 为反应时间D 为稀释倍数。即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数四、苯丙氨酸解胺酶（PAL ）活性测定1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8 的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至50ml ，低温离心（10104r/min,04 ） 15min, 取上清夜置于低温冰箱备用。2、试剂：0.05 mol/L Tris-H 2 SO4 缓冲液 （ pH8.8 ）：称取 Tris 6.057 g 溶于水中， 用 H2SO4 调节 pH 值至 8.8，用水定容至1L 。0.02 mol/L苯丙氨

7、酸溶液：称取 3.3038 g 苯丙氨酸，溶于1L 的 0.05 mol/L Tris-H 2SO4 缓冲液（ pH8.8 ）。PAL 酶提取液： 称取 Tris 12.114g, EDTA-N a 0.3722 g,甘油 76.2 g，巯基乙醇0.52 ml，溶于3水中，用 H 2SO4 调节 pH 值至 8.3，用水定容至1L。3、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管4、苯丙氨酸解氨酶活性测定：（1）加入反应混合液试剂苯丙氨酸溶液Tris-H 2SO4 缓冲液（ pH8.8 ）PAL 酶液备注处理242对照62空白（调零用）26只需 1管（ 2） 30水浴锅中保温 3

8、0min。（ 3）在 290 nm 处测 OD 290。（ 4）结果计算：以每分钟内OD 变化 0.01 为 1 个酶活力单位。即酶活力 =OD D / 0.01t酶的比活力 = ODD / （ 0.01tw ）其中： OD为反应时间内吸光度的变化W为材料鲜重t 为反应时间D 为稀释倍数。即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数测定方法苯丙氨酸解氨酶活性测定按欧阳光察方法5;多酚氧化酶活性测定按朱广廉方法6 稍加修改 ;过氧化物酶活性测定采用比色法7;可溶性蛋白质含量测定以牛血清蛋白为标准蛋白,按 Folin- 酚法测定 8 。参考文献：2 周爱琴 ,祝军 ,生吉萍 ,等 .苹果花青素形成与 PAL

9、 活性及蛋白质含量的关系 J. 中国农业大学学报 ,1997,2(3):97-99.3 吴振先 ,苏美霞 ,陈维信 ,等 .贮藏荔枝果皮多酚氧化酶及过氧化物酶与褐变的研究J.华南农4业大学学报 ,1998,19(1):12-15.4 张华云 ,王善广 ,牟其芸 ,等 .套袋对莱阳茌梨果皮结构和PPO、 POD 活性的影响 J.园艺学报,1996,23(1):23-26.5 上海植物生理学会 .植物生理学实验手册 M. 上海 :上海科技出版社 ,1985.191-192.6 朱广廉 ,钟海文 ,张爱琴 .植物生理学实验 M. 北京 :北京大学出版社 ,1990.37-40.7 张志良 .植物生理学实验指导 M. 北京 :高等教育出版社 ,1990.154-155. 8LowryOH,RosebroughNJ,FarrAI.ProteinmeasurementwithFolinphenolreagentJ.BiolChem,1951,193:265-27512 欧阳光察 ,薛应龙 .植物苯丙烷类代谢的生理意义及其调控J.植物生理学通