CRISPRCas系统基因修饰技术最终PPT学习教案

1、会计学1 CRISPRCas系统基因修饰技术最终系统基因修饰技术最终PPT 课件课件 CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。蛋白对靶向基因进行修饰的技术。 1 CRISPR-Cas概述概述 第1页/共16页 CRISPR-Cas主要由两部分组成：主要由两部分组成： 识别识别切割切割 1 CRISPR-Cas概述概述 第2页/共16页 2 CRISPR-Cas系统的发现系统的发现 CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然是很多细菌和大部分古生菌的天然 免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行免疫系统

2、，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性特异性 的识别，利用的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自蛋白进行切割，从而达到对自 身的免疫。身的免疫。 第3页/共16页 2 CRISPR-Cas系统的发现系统的发现 第4页/共16页 2 CRISPR-Cas系统的发系统的发 现现 第5页/共16页 CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫特异性免疫, 而这种特异性是由间隔序列（而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主防御）决定的。在宿主防御 噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进

3、 化了化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是 由由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间 隔序列（隔序列（spacer）来实现的。）来实现的。 2 CRISPR-Cas系统的发现系统的发现 第6页/共16页 3 Type II CRISPR系统系统Cas9 随着越来越多的不同菌中的CRISPR系统被发现，研究者 们根据他们降解外源的遗传物质的方法，将他们分为了 三类。 Type I and Type III. 这两套系统由于参与的蛋白 众多，需要几个复合物共同作用才能发挥作用，使得它

4、 不宜操作和改造。 第7页/共16页 3 Type II CRISPR系统系统Cas9 2012年Jennifer A. Doudna和 Emmanuelle Charpentier的这篇Science发现了一个 比较简单的CRISPR（TypeII）系统的机理。这一系 统就简单多了，一个巨大的160KD的蛋白Cas9利用 RNA, 就可以完成识别和切割靶向的DNA。 第8页/共16页 他们发现了 1） Type II CRISPR系统中的Cas9是个核酸酶，这个核酸 酶结合两个RNA(crRNA, tracrRNA)就可以切割双链DNA. 2） 同时，他们进一步阐明了RNA和目标DNA配对的

5、原则， 同时将crRNA-tracrRNA连接成了chimera RNA，这样只需要 Cas9蛋白和一条定制的RNA就可以编辑特性的DNA。3） 同时他们进一步分析了Cas9作为核酸酶的活性位点：连个核 酸酶活性分别切割靶DNA的两条链。 3 Type II CRISPR系统系统Cas9 第9页/共16页 3 Type II CRISPR系统系统Cas9 CRISPR/Cas9介导DNA 双链断裂的过程如下：首 先，tracrRNA和pre-RNA array被转录；其次， tracrRNA杂交到pre-RNA array直接重复序列DRs 上并与Cas9结合在一起 形成二聚体，进一步介导 p

6、re-RNA成熟到crRNA； 再次，成熟的 crRNA:tracrRNA二聚体 通过crRNA上的spacers 与 D N A 靶 序 列 上 的 protospacers形成异源二 聚 体 ； 最 后 ， 在 protospacers中，Cas9在 靶DNA的PAM上游介导 产生DSB。 第10页/共16页 4 Cas9的应用的应用 1 真核系统的应用 1） 优化密码子，让Cas9蛋白可以在哺乳动物系统中 很好的表达。 2） 加了核定位序列(NLS)，这样可以把Cas9送到细 胞核内进行基因组编辑。 3） 当然，同时需要表达一个guide RNA，把Cas9定 位到靶DNA处。 第11页/共16页 4 Cas9的应用的应用 利用这个技术，就可以很方便高效廉价地在细胞上做基 因编辑：包括敲除、修改、插入。 第12页/共16页 2 进一步用Nickase增加编辑特异性 4 Cas9的应用的应用 因为Cas9介导的靶向主要依赖于guide RNA和目标DNA20左右的碱基 的配对，大家开始重视脱靶效应（off-target）。 很快，MIT的张峰在Cell上发表了Double Nick的方法。 Cas9会在目标DNA上切两刀，如果把其中一个核酸酶活性