流式演示文稿(2010研究生)

1、流式细胞仪流式细胞仪 2010年3月 流式细胞仪简介 流式细胞仪（Flow Cytometry, FCM）是检测细 胞各种成分的重要细胞生物学工具。定量检测细 胞膜、细胞质和细胞核中的各种细胞成分；研究 细胞的各种功能状态(细胞增殖，细胞凋亡、细 胞分化、酶活性、细胞膜通透性、氧化还原状态、 吞噬性等)；测量细胞或亚细胞结构的新型分析 技术和分选技术。 主要包括了样品的液流技术、计数技术和细胞的 分选，以及数据的采集和分析技术等。 BD FACSCalibur流式细胞分析仪流式细胞分析仪 COULTER MAXM血细胞流式分析仪 美国 流式细胞分析仪流式细胞分析仪 德国德国 流式细胞仪的特点：

2、 测量速度快。最快可在1秒种内计测数万个细 胞； 可进行多参数测量。可以对同一个细胞做有关 物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统 计学意义； 是一门综合性的高科技技术。它综合了激光技 术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技 术等多领域的知识和成果； 既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。 流式细胞仪的构造 流式细胞仪主要由五部分组成 1.流动室和液流系统； 2.激光源和光学系统； 3.光电管和检测系统； 4.计算机和分析系统； 5.细胞分选系统 1.流动室的基本结构 流动室是仪器的核心部件，被测样品在此与激 光相交，得到准确的细胞荧光信息。 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压

3、力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓 冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向 与待测样品流成一定角度，鞘液包裹着样品高 速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘 液的包裹下单行排列，依次通过检测区域。 液流驱动系统 进样速率： 改变样本的进 样速率开关，可提 高采样分析的速度， 但是，这并不是提 高样本的速度，而 是改变了细胞的距 离（整个系统运行 中流速是不变的）。 从图可以看出，样 本流变宽，细胞间 距离缩短，这样单 位时间内流经激光 区的细胞就增加。 Lo:12L/min、 Med:35L/min、Hi:60L/min 2.激光源和光学系统 通常以激光作为发光源（氩离子气体激光器和

4、 小功率半导体激光器）。经过聚焦整形后的光 束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞 在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。 光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号 基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接 受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射 镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的 荧光信号。这两种信号同时被前向光电二极管 和90方向的侧向光电倍增管接收。 FACSCalibur流式细胞仪的光平台系统流式细胞仪的光平台系统 3.光电管和检测系统： 经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通 过光电转换器转变成电信号而进行测量的。 二种探测器和二类放大器 二种探测器:光电二极管

5、和光电倍增管。 光电二极管对光的敏感度低于光电倍增管,用于探测FSC, 因FSC是强信号。 光电倍增管（PMTs）用于探测SSC,FL1,FL2,FL3,因为它 们是弱信号。PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响 应特性好，在200900nm的光谱区，光量子产额都比较 高。光电倍增管的增益从103到108可连续调节，因此对 弱光测量十分有利。 两类放大器:一类是输出信号辐度与输入信号 成线性关系，称为线性放大器。另一类是对 数放大器，输出信号和输入信号之间成常用 对数关系。 放大器的作用:可对信号进行微调。通过对 FSC,SSC,FL1,FL2,FL3设置放大模式和微调放 大增益获得最佳细

6、胞信号。 这是因为从PMT输出的电信号仍然较弱，需要 经过放大后才能输入分析仪器。 4.计算机和分析系统 经放大后的电信号被送往计算机分析器。 荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物 质的浓度，经光电倍增管接收后转换为电信号，再通过模数 转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。 计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显 示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式 存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 流式细胞仪流式细胞仪系统流程： 标本激光系统流动系统 信号处理系统放大系统 计算机系统结果打印 5.细胞分选系统 细胞的分选是通过分离含

7、有单 细胞的液滴而实现的。在流动 室的喷口上配有一个超高频电 晶体，充电后振动，使喷出的 液流断裂为均匀的液滴，待测 定细胞就分散在这些液滴之中。 将这些液滴充以正负不同的电 荷，当液滴流经带有几千伏特 的偏转板时，在高压电场的作 用下偏转，落入各自的收集容 器中，不予充电的液滴落入中 间的废液容器，从而实现细胞 的分离。 流式细胞仪有关的测量参数及数据处理 测量参数： 检测数据的显示视测量参数的不同有多种形式可供 选择。FSC(Forward Scatter),SSC(Side Scatter), 第一激光（488nm）激发出的FL1,FL2,FL3,第二激 光（635nm）激发出的FL4。

8、 数据处理： 主要包括数据的显示和分析。流式数据可以用一维 直方图、二维散点图、等高线图、密度图等来表示。 激发光光源波长激发光光源波长488nm的示意图的示意图 u测量参数： 1.散射光信号：前向角散射和侧向角散射（细胞的物理固有参 数） (1)前向角散射，即FSC与细胞的大小（直径的平方）相关，我们 平时上机的时候，有时用FSC做阈值，排除样品中的各种碎片及鞘 液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。（一般流式细胞仪流式细胞仪能 够测量到0.2m0.5m）。 (2)侧向角散射，即SSC是指与激光束正交90度方向的散射信号， 它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可以提供有关细胞 内精细结构

9、及颗粒性质的信息。 （这两种信号来自于激光原光束，波长与激光相同） 利用这两个参数可以对细胞进行分群，通过设门就可以将具有一 定SSC和FSC的细胞群从大量细胞中区分出来。 细胞的光散射特性 根据FSC/SSC，可区分裂解红细胞处理后外周血 白细胞中的淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞 三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的 全血样本中找出血小板和红细胞等细胞群体。 R1 FSC、SSC二维散点图 2.荧光信号：当激光光束与细胞正交时，一般会产生 两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出 微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经 过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的特异 荧光信号，通

10、过对这类荧光信号的检测和定量分析 就能了解所研究细胞参数的存在与定量。 测量荧光信号的主要参数： （1）荧光信号的线性测量和对数测量模式 （2）细胞高度、面积和宽度的荧光信号测量 （3）光谱重叠的校正(调节荧光补偿电压)， 因 FL1、FL2、FL3是来自于同一点光源，它们之间 的补偿是不可避免的。 （1）荧光信号线性测量和对数测量模式 线性测量：输出信号与输入信号成线性关系。 适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物 学线性过程的信号，例DNA、RNA、总蛋白含 量的测量。 对数测量：输出信号和输入信号之间成常用对 数关系。在免疫学测量中常使用对数测量。细 胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍

11、甚至几 万倍。如用线性放大器，将无法在一张图上清 晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来。 （2）荧光信号的高度、面积和宽度 荧光信号的高度 荧光信号的高度（ 如FL2-H）是对细胞高 度的荧光信号的测量。一般都采用此参数 进行检测，因为细胞高度的荧光信号虽有 差异，但不影响阴性群和阳性群细胞在各 区域的分布，从而通过统计学（正态分布） 得到它们各自分布在不同区域的百分含量。 荧光信号的面积 所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行 积分测量，一般对DNA倍体测量时采用面积 （如FL2-A），这是因为荧光脉冲的面积比荧 光脉冲的高度更能准确反应DNA的含量，当形 状差异较大，而DNA含量相等的二

12、个细胞，得 到的荧光脉冲高度是不等的，而经过对荧光信 号面积积分后，所得到的信号值就相等。 荧光信号的宽度 宽度（如FL2-W）常用来区分双联体细胞，由于 DNA样本极容易聚集，当两个G1期细胞粘连在一起 时，其测量到的DNA荧光信号（FL2-A）与G2期细 胞相等，这样得到的测量数据G2期细胞比例会增高， 影响测量准确性，通过设“门”排除双联体细胞， 其原理是双联体细胞所得到的荧光信号（FL2-W） 比单个G2期细胞大，设“门”后得到真正的DNA含 量分布曲线和细胞周期。 小牛胸腺细胞的DNA分布曲线 （3）光谱重叠的校正 当细胞携带两种荧光素（PE和FITC）受 激光激发而发射出两种不同波

13、长的荧光 时，理论上，可选择滤片使每种荧光仅 被相应的检测器检测到，而不会检测到 另一种荧光。由于目前使用的各种染料 都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自 发射峰值各不相同，但发射谱范围有一 定的重叠，克服这种误差的最有效方法 是使用荧光补偿电路。 FITC探测器会探测到少量的 PE光谱，而PE探测 器则探测到较多的FITC光谱。 补偿前后模型图 数据处理： u 直方图：显示一个参数与细胞之间的关系。 每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计 分布，以直方图的方式来显示。在图中，横坐 标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值， 其单位是道数，可以是线性（line）或者对数 （log）。纵坐标是细胞

14、数。 2N代表G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞， 两者中间代表S期细胞。这是以2倍体和4倍体 细胞为主的流式DNA图。 DNA周期检测中的死亡和凋亡 图中100101（M1）为阴性细胞，101以 上的（M2）为阳性细胞。 u散点图散点图： 散点图常被用来分析多参数数据，如CD4、 CD8、CD34、CD45等分子的表达，以及凋亡 周期特异性，早期凋亡的检测等 细胞凋亡的检测结果：横坐标是Annexin-V FITC, 纵坐 标是PI，右上象限代表死亡的细胞，左下象限是存活 的细胞，右下象限是凋亡的细胞。 双染色区分凋亡和死亡的细胞 Annexin V-FITC/PI染色右上角表示：坏死

15、晚期凋亡 在实际应用中，可根据需要选择匹配，以便了解和获得尽可能 多的有用信息。 流式细胞仪的常用技术参数 为了表征仪器性能，往往根据使用目的和 要求而提出几个技术参数或指标来定量说 明。 1.荧光分辨率 2.荧光灵敏度 3.适用样品浓度 4.分选纯度 5.分析测量参数 （1）荧光分辨率：强度一定的荧光在测量时是在一定道 值上的一个正态分布的峰，荧光分辨率是指两相邻的峰 可分辨的最小间隔。通常用变异系数（C.V值）来表示。 （2）荧光灵敏度：反映仪器所能探测的最小荧光光强的 大小。一般用荧光微球上所标可测出的FITC的最少分子 数来表示。目前仪器均可达到1000左右。 （3）分析速度/分选速度

16、：仪器每秒种可分析/分选的数 目。一般分析速度为500010000；分选速度掌握在 1000以下（300/s）。 （4）样品浓度：主要给出仪器工作时样品浓度的适用范 围。一般在105107细胞/ml的数量级。 （5）分析测量参数 : FSC,SSC,FL1,FL2,FL3,FL4、 FL2- A, FL2- W及线性和对数测量模式。 常用流式软件常用流式软件 1.cellquest cellquest是BD公司推出的针对流式的试验数据获取和分析 软件。界面友好，操作简单，是目前流式相关软件中应用 最多的软件之一。 获取：建立检测模板（选测样通道、设“门”、作象限图、 直方图），调节探测器和确定

17、放大器测量模式可使所需信 号出现在二维点图的适当位置。（颗粒通过激光束时产生 光信号，然后转换成电信号，并在点图上相对应于一个道 值）。 分析：建立分析模板（设“门”、作象限图、直方图）， 经数学统计后得到分析结果。 设门的概念 所说的设门，是指在进行检测时，所设的选择区域，可以用“门”选择 感兴趣的细胞群。（设门技术比较复杂，染色和上机都需要操作人员有 一定的经验）。 数据分析 Cellquest的仪器控制： 有二种探测器：光电二极管和光电倍增 管(PMTs) 光电二极管用于探测FSC ，因为FSC是 强信号。可通过调电压选择对FSC信号 的不同放大。 光电倍增管(PMTs)用于探测SSC、

18、FL1、 FL2、FL3 、FL4，因为它们是弱信号。 PMTs的电压调节从150-999。当电压上 升时，信号增加，数据出现在道值较高 处。 放大器：可对信号进行微调。对FSC、 SSC、FL1、FL2、FL3可设置放大模式 和放大增益。放大模式选择Lin（线 性），放大器的增益在1-9.99之间调节。 放大模式选择Log（对数），放大器的 增益不可调节。对数常用于分开阴性信 号和弱阳性信号。 （E00、E01、E02、E03、 E-1表示将信号放大100、 101、102、103、10-1倍） 阈值：可用来设置低于该道值的数据信号不被处理，只有高于或 等于阈值道数的信号才传送到计算机进行处

19、理。在免疫表型中， 在FSC上设阈值。在DNA分析中，在FL2上设阈值。 补偿：当样本用2色或3色荧光染色时需调节补偿以消除光谱重叠。 补偿调节量依赖于探测器的电压。当补偿过后的群体与阴性群体 一致时，补偿调节正确。 鼠中人造血干细胞表型分析 (双染色） File: 2006/9/19 45/34.002 Acquisition Date: 19-Sep-06 QuadEvents% Gated % Total X Geo Mean UL10.010.0113.10 UR190.210.1927.88 LL903299.6690.322.11 LR110.120.1116.82 File: 2

20、006/9/19 45/34.003 Acquisition Date: 19-Sep-06 QuadEvents% Gated % Total X Geo Mean UL70.080.077.07 UR5506.165.50138.26 LL574564.3757.451.89 LR262329.3926.23100.75 File: 2006/9/19 45/34.003 Acquisition Date: 19-Sep-06 QuadEvents% Gated % Total X Geo Mean UL00.000.00* UR63818.706.38150.29 LL70.210.07

21、13.97 LR276781.1027.6799.08 File: 2006/10/24 Yang.001 Acquisition Date: 24-Oct-06 QuadEvents % Gated % Total X Geo Mean UL130.140.1313.44 UR560.600.5646.56 LL921698.7792.164.14 LR460.490.4628.67 File: 2006/10/24 Yang.002 Acquisition Date: 24-Oct-06 QuadEvents % Gated % Total X Geo Mean UL128313.6212

22、.833.66 UR500.530.5042.45 LL806885.6480.683.61 LR200.210.2028.21 R1 Control 人造血干细胞表型分析 (单染色） 毕赤酵母发酵液中细胞活性的检测（PI染色) R2 R1 亚洲玉米螟昆虫细胞周期的获取 流式细胞术检测毕赤酵母发酵过程中胞内活性氧水平 左下区域为双阴性区(DCF-PI-)，对应于无(或低)ROS积累活细胞； 右下区为DCF阴性PI阳性区(DCF-PI+)，为无(或低)ROS积累的死 亡细胞；左上为DCF阳性PI阴性区(DCF+PI-)高ROS积累活细胞； 右上为双阳性区(DCF+PI+)，为高ROS积累死亡细胞

23、。 File: 2007/12/28 GFP Liu.001 Acquisition Date: 28-Dec-07 QuadEvents % Gated % Total UL00.000.00 UR160.170.16 LL946699.1694.66 LR640.670.64 File: 2007/12/28 GFP Liu.009 Acquisition Date: 28-Dec-07 QuadEvents % Gated % Total UL00.000.00 UR680.790.68 LL3734.333.73 LR817494.8881.74 R1 检测动物细胞中表达的GFP含量

24、2.Modfit分析软件分析软件 ModFit 是专门用于流式细胞术中进行细胞 周期分析的软件。它通过对DNA含量直方图 进行曲线拟合，能快速计算出各种倍体细胞 的含量、细胞周期各时相及亚二倍体细胞所 占的比例、DNA指数、G0/G1期峰的变异系 数等。 Channels (FL2-A) 0306090120150 ModFitLT V3.0(PMac) File analyzed: Data.440 Date analyzed: 4-Apr-2006 Model: 1nn0n_DSF Analysis type: Manual analysis Diploid: 100.00 % Dip G

25、1: 48.40 % at 52.85 Dip G2: 27.31 % at 104.57 Dip S: 24.29 % G2/G1: 1.98 %CV: 3.55 Total S-Phase: 24.29 % Total B.A.D.: 0.00 % no debris no aggs Debris: % Aggregates: 0.00 % Modeled events: 17541 All cycle events: 17541 Cycle events per channel: 333 RCS: 1.199 Dip G1 Dip G2 Dip S FSC-H 0306090120 R1 FL2-W 0306090120 R2 亚洲玉米螟昆虫细胞周期分析 笃丝越桔对神经细胞氧化损伤起保护作用过程中的笃丝越桔对神经细胞氧化损伤起保护作用过程中的DNA 的检测的检测 DNA检测的常用术语： 分辨率(变异系数CV) ： % CV= (SD标准微球/mean平均荧光强度) 1003%。影响CV的因素：仪器（液流、光路、机器 调试等）；人为影响（样本