细胞培养5：培养物的观察和检测方法

1、我的细胞培养计划我的细胞培养计划 （手写和打印均可）（手写和打印均可） 应包括如下内容：应包括如下内容： 1 1、培养目的：、培养目的： 2 2、实验室条件：、实验室条件：已具备的条件；尚未具备的条件。已具备的条件；尚未具备的条件。 3 3、培养方法：、培养方法： 1 1）培养基的选用（含应补充的附加成分）及培养所需的其它用液；）培养基的选用（含应补充的附加成分）及培养所需的其它用液； 2 2）具体操作方法及步骤（按实际操作分步列出）；）具体操作方法及步骤（按实际操作分步列出）； 3 3）培养过程观察的注意事项；）培养过程观察的注意事项； 4 4、目的细胞的鉴定方法：、目的细胞的鉴定方法： 1

2、 1）具体方法（可列）具体方法（可列1 13 3种）；种）； 2 2）应出现的结果：阳性；阴性。）应出现的结果：阳性；阴性。 5 5、困难及解决办法：、困难及解决办法： 本课程的作业及考核依据之一本课程的作业及考核依据之一 我的细胞培养计划我的细胞培养计划 （手写和打印均可）（手写和打印均可） 注意事项：注意事项： 1 1、作业上交时间及地点：、作业上交时间及地点： 时间：校历第时间：校历第1313周（周（2011.11.252011.11.25）前）前 地点：地点：104104馆三楼（组胚教研室）馆三楼（组胚教研室） 本课程的作业及考核依据之一本课程的作业及考核依据之一 2 2、作业必须标明

3、的项目：、作业必须标明的项目： 题题 目目 学号学号 姓名姓名 专业专业 导师导师 课课 程程 安安 排排 及及 进进 度度 体外培养的原理与技术体外培养的原理与技术 薛庆善薛庆善 主编主编 广西医科大学组胚教研室广西医科大学组胚教研室 何少健何少健 电话：电话：13367805949133678059490771-5358577(办办) ) 体外培养的基本原理与技术体外培养的基本原理与技术 一、从体内生存环境到体外生长条件一、从体内生存环境到体外生长条件 二、体外培养的基本方法和过程二、体外培养的基本方法和过程 三、体外培养物的生长生物学三、体外培养物的生长生物学

4、 四、细胞分离与纯化四、细胞分离与纯化 五、细胞系（株）、细胞克隆五、细胞系（株）、细胞克隆 六、培养物的观察检测方法六、培养物的观察检测方法 无论是在进行体外培养的过程中还是在培养工作结束之后，经无论是在进行体外培养的过程中还是在培养工作结束之后，经 常需要对培养物（培养的细胞或者植块）进行观察检测，以了解培常需要对培养物（培养的细胞或者植块）进行观察检测，以了解培 养物的生长状况，研究培养物的生命活动变化。养物的生长状况，研究培养物的生命活动变化。 这方面的内容涉及到形态学、细胞生物学、生理生化、遗传学这方面的内容涉及到形态学、细胞生物学、生理生化、遗传学 以及分子生物学等多学科的技术手段

5、。以及分子生物学等多学科的技术手段。 观察检测体外培养物最常用的技术方法，包括：观察检测体外培养物最常用的技术方法，包括： 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 1.1.活细胞的观察检测方法活细胞的观察检测方法 2.2.普通染色观察普通染色观察 3.3.细胞化学技术细胞化学技术 4.4.免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术 5.5.原位杂交技术原位杂交技术 6.6.电子显微镜技术电子显微镜技术 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 1.1 1.1 相差显微镜观察培养物的形态结构相差显微镜观察培养物的形态结构 由于培养的细胞在生活状态下，几乎是透明的，结构之间由于培养的细胞在生活状态下，几乎

6、是透明的，结构之间 的反差很小，如果用普通光学显微镜观察，看不清活细胞的形的反差很小，如果用普通光学显微镜观察，看不清活细胞的形 态结构。若要观察其微细结构和变化，就须借助能够增强结构态结构。若要观察其微细结构和变化，就须借助能够增强结构 之间反差的特殊显微镜，此即之间反差的特殊显微镜，此即相差显微镜相差显微镜（phase contrast phase contrast microscope)microscope)。 相差显微镜专门用于对体外培养的活细胞进行观察相差显微镜专门用于对体外培养的活细胞进行观察。用相。用相 差显微镜可直接观察到活细胞的形态结构、分裂增殖的动态变差显微镜可直接观察到活

7、细胞的形态结构、分裂增殖的动态变 化及细胞运动等各种生命现象。化及细胞运动等各种生命现象。 1.1.活细胞的观察检测方法活细胞的观察检测方法 相差显微镜的原理：相差显微镜的原理： 用一般光镜之所以难以看清活细胞，是由于活细胞无色透明，用一般光镜之所以难以看清活细胞，是由于活细胞无色透明， 当光波通过它时，颜色和亮度变化不大。当光波通过它时，颜色和亮度变化不大。 相差显微镜则是利用细胞内各结构密度的不同而对光产生折相差显微镜则是利用细胞内各结构密度的不同而对光产生折 射率有差异的原理，在折射率大的物体中比折射率小的物体中光射率有差异的原理，在折射率大的物体中比折射率小的物体中光 波前进的距离较短

8、，此距离差异叫光程差，由于光程差引起光的波前进的距离较短，此距离差异叫光程差，由于光程差引起光的 相位变化称为相位差或相差。使用相差显微镜可使用肉眼不能分相位变化称为相位差或相差。使用相差显微镜可使用肉眼不能分 辨的相位差变为可分辨的振幅差（即明暗差），故使无色透明的辨的相位差变为可分辨的振幅差（即明暗差），故使无色透明的 物体在镜下其结构的反差显著，影像清晰。物体在镜下其结构的反差显著，影像清晰。 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 1.1.1 1.1.1 相差显微镜相差显微镜 1.1.活细胞的观察检测方法活细胞的观察检测方法 1.1 1.1 相差显微镜观察培养物的形态结构相差显微镜观

9、察培养物的形态结构 Pale Squamous Cells (scrapings from the inside of mouth) 1600 x Bright Field Pale Squamous Cells (scrapings from the inside of mouth) 1600 x - Phase Contrast 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 1.1.2 1.1.2 用相差显微镜观察活细胞的方法用相差显微镜观察活细胞的方法 （略）（略） 1.1.活细胞的观察检测方法活细胞的观察检测方法 1.1.1 1.1.1 相差显微镜相差显微镜 1.1 1.1 相差显微镜观察

10、培养物的形态结构相差显微镜观察培养物的形态结构 1.1.3 1.1.3 活细胞的动态观察与缩时电影活细胞的动态观察与缩时电影 （略）（略） 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 1.1.活细胞的观察检测方法活细胞的观察检测方法 1.2 1.2 细胞计数法细胞计数法 细胞计数法（细胞计数法（cell cell countingcounting）是用来计数细胞悬）是用来计数细胞悬 液中细胞数量的一种方法。一液中细胞数量的一种方法。一 般利用细胞计数板（即血细胞般利用细胞计数板（即血细胞 计数板）进行（见右图）。既计数板）进行（见右图）。既 可用于分离（散）细胞培养接可用于分离（散）细胞培养接

11、种前计数所制备的细胞悬液中种前计数所制备的细胞悬液中 的细胞数量，也可用于对培养的细胞数量，也可用于对培养 物的细胞数量进行计数。物的细胞数量进行计数。 计算公式：细胞密度计算公式：细胞密度(4(4大格细胞总数大格细胞总数4) 4) * * 10,000( 10,000(个个ml)ml) 大格大格 对于压线的细胞只计算在上线和左线者对于压线的细胞只计算在上线和左线者 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 1.1.活细胞的观察检测方法活细胞的观察检测方法 1.3 1.3 细胞生长曲线细胞生长曲线 细胞生长曲线细胞生长曲线 （cell growth cell growth curvecurve

12、）是观测细胞）是观测细胞 在一代生存期内的在一代生存期内的 增生过程的重要指增生过程的重要指 标，它以培养时间标，它以培养时间 （d)d)为横坐标、细为横坐标、细 胞密度为纵坐标作胞密度为纵坐标作 坐标图。坐标图。 制作细胞生长曲线的过程：制作细胞生长曲线的过程： （1 1）培养细胞）培养细胞 首先在培养板的首先在培养板的2121个孔内分别接种相同数量的细胞（如果使用培养个孔内分别接种相同数量的细胞（如果使用培养 瓶，则需接种瓶，则需接种2121瓶）。计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记瓶）。计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记 为为 0 h0 h。 （2 2）计数细胞密度）计数细

13、胞密度 从接种时间算起，每隔从接种时间算起，每隔24h24h计数计数3 3孔（瓶）内的细胞密度，算出平均孔（瓶）内的细胞密度，算出平均 值。为提高准确率，对每孔（瓶）细胞可计数值。为提高准确率，对每孔（瓶）细胞可计数2 23 3次。如此操作至第七次。如此操作至第七 天结束。天结束。 （3 3）绘制曲线）绘制曲线 以培养时间（以培养时间（d)d)为横坐标、细胞密度为纵坐标，将全部结果在坐标为横坐标、细胞密度为纵坐标，将全部结果在坐标 纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线（见下图所示）。纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线（见下图所示）。 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 1.1.活细胞的观察

14、检测方法活细胞的观察检测方法 1.3 1.3 细胞生长曲线细胞生长曲线 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 1.1.活细胞的观察检测方法活细胞的观察检测方法 1.4 1.4 体外活体染色观察与活体染料体外活体染色观察与活体染料 体外活体染色就是在体外条件下用某种染色剂（即体外活体染色就是在体外条件下用某种染色剂（即活体染活体染 料料）对活的组织或细胞进行染色，而不影响活细胞的生命活动）对活的组织或细胞进行染色，而不影响活细胞的生命活动 的方法。的方法。 利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，经染色的培利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，经染色的培 养物还可以继续进行培养。养物还可以

15、继续进行培养。 能够能够使活细胞着色使活细胞着色而不影响细胞生命的染料就是而不影响细胞生命的染料就是活体染料活体染料。 真正的活体染料，既能固着在活细胞的某种结构上，又对真正的活体染料，既能固着在活细胞的某种结构上，又对 细胞本身不产生明显的毒性作用。细胞本身不产生明显的毒性作用。 活体染料可分为活体染料可分为碱性活体染料碱性活体染料和和酸性活体染料酸性活体染料两大类：两大类： 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 1.1.活细胞的观察检测方法活细胞的观察检测方法 1.4 1.4 体外活体染色观察与活体染料体外活体染色观察与活体染料 体外活体染色一般使用体外活体染色一般使用碱性活体染料碱性

16、活体染料（带正电荷）。（带正电荷）。 酸性活体染料酸性活体染料多用于体内活体染色，体外活细胞难以着色。多用于体内活体染色，体外活细胞难以着色。 1.4.1 1.4.1 活体染料的类别活体染料的类别 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 1.1.活细胞的观察检测方法活细胞的观察检测方法 1.4 1.4 体外活体染色观察与活体染料体外活体染色观察与活体染料 1.4.2 1.4.2 工作浓度工作浓度 体内活体染色体内活体染色时，注射的活体染料溶液浓度可高达时，注射的活体染料溶液浓度可高达1 1甚至甚至2 2 。而。而体外活体染色体外活体染色一般使用一般使用2 2 、1 1 甚至甚至0.1 ,0.

17、05 0.1 ,0.05 或或 者更淡的染液。以者更淡的染液。以1 1 0.3 0.3 的浓度较为合适。的浓度较为合适。 可以用平衡盐溶液、可以用平衡盐溶液、PBSPBS或生理盐水等配制。或生理盐水等配制。 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 1.1.活细胞的观察检测方法活细胞的观察检测方法 1.4 1.4 体外活体染色观察与活体染料体外活体染色观察与活体染料 1.4.3 1.4.3 染色步骤染色步骤 1) 1) 吸去培养液，将培养物用平衡盐溶液吸去培养液，将培养物用平衡盐溶液,PBS,PBS或生理盐水稍事洗涤。或生理盐水稍事洗涤。 2) 2) 加入活体染料溶液，在培养箱内静置染色加入活

18、体染料溶液，在培养箱内静置染色0.5h0.5h或者或者1 12h2h。 3) 3) 在显微镜下观察（细胞将被淡染）或作其它处理在显微镜下观察（细胞将被淡染）或作其它处理 （作选择性标记等）。（作选择性标记等）。 4) 4) 倾去染液。用平衡盐溶液、倾去染液。用平衡盐溶液、PBSPBS或生理盐水洗涤。或生理盐水洗涤。 5) 5) 加入培养液，继续培养。加入培养液，继续培养。 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 1.1.活细胞的观察检测方法活细胞的观察检测方法 1.1. 活细胞的染料排除检测法活细胞的染料排除检测法 由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进由于死细胞的细胞膜通透性发

19、生改变，某些染料可大量进 入却不被排出，因而细胞呈色。而活细胞反之，能排出进入细入却不被排出，因而细胞呈色。而活细胞反之，能排出进入细 胞内的染料，因而不易着色。胞内的染料，因而不易着色。 此法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应而区分此法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应而区分 开两种细胞。开两种细胞。 1 15.1 5.1 台盼蓝排除检测法：台盼蓝排除检测法： （1 1）2 2台盼蓝溶液的配制：称取台盼蓝溶液的配制：称取2g2g台盼蓝台盼蓝(trypan blue(trypan blue），加少量双），加少量双 蒸水研磨粉碎后，再加水至蒸水研磨粉碎后，再加水至50ml50ml，离

20、心后取上清液，再加入，离心后取上清液，再加入1.81.8 NaCINaCI溶液至溶液至100ml100ml，即成工作液。，即成工作液。 （2 2）活体染色与细胞计数）活体染色与细胞计数 1)1)将将1 1滴细胞悬液（贴壁细胞可经滴细胞悬液（贴壁细胞可经0.25%0.25%胰蛋白酶溶液消化后，吹打胰蛋白酶溶液消化后，吹打 制成细胞悬液）与制成细胞悬液）与2 2滴台盼蓝液混合后，滴入细胞计数板。滴台盼蓝液混合后，滴入细胞计数板。 2)2)2 min2 min后，在显微镜下计数至少后，在显微镜下计数至少200200个细胞。个细胞。未着色未着色的为活细胞，的为活细胞， 呈蓝色呈蓝色的为死细胞。计算活细

21、胞的百分比。的为死细胞。计算活细胞的百分比。 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 1.1.活细胞的观察检测方法活细胞的观察检测方法 1.1. 活细胞的染料排除检测法活细胞的染料排除检测法 1 15.2 5.2 溴比乙锭和碘化丙锭排除检测法：溴比乙锭和碘化丙锭排除检测法： 溴比乙锭（溴比乙锭（ethidium bromide, EB)ethidium bromide, EB)和碘化丙锭（和碘化丙锭（propidiumpropidium iodine, PI iodine, PI）均为荧光染料，可与）均为荧光染料，可与DNADNA特异性结合。特异性结合。 （1 1）染液配制：取）染液配制：取

22、EBEB或或PI 5mg , PI 5mg , 枸橼酸钠枸橼酸钠0.1g , NP-40 0.3 ml,0.1g , NP-40 0.3 ml, 共溶于共溶于100 ml100 ml蒸馏水中。避光保存。蒸馏水中。避光保存。 （2 2）荧光染色与计数：取细胞悬液和）荧光染色与计数：取细胞悬液和EBEB或或PIPI染液各染液各0.5 ml0.5 ml，混匀。，混匀。 静置静置101030 min30 min后在荧光显微镜下计数。发橙红色荧光者为死细后在荧光显微镜下计数。发橙红色荧光者为死细 胞。也可用流式细胞仪测定，激发光波长为胞。也可用流式细胞仪测定，激发光波长为488 nm488 nm。 2

23、h 2 h内荧光内荧光 保持稳定。保持稳定。 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 1.1.活细胞的观察检测方法活细胞的观察检测方法 1.1. 活细胞的染料排除检测法活细胞的染料排除检测法 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 1.1.活细胞的观察检测方法活细胞的观察检测方法 1.6 1.6 细胞增殖活性测定的细胞增殖活性测定的3 3H-TdRH-TdR掺入法掺入法 细胞增殖前必须复制细胞增殖前必须复制DNADNA，而胸腺嘧啶是，而胸腺嘧啶是DNADNA的特异碱基。的特异碱基。 用用3 3H H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（TdRTdR）掺入到新合成的）掺入到新合成的

24、DNADNA中后，中后， 会均匀地分布于子细胞中。此时只要测定会均匀地分布于子细胞中。此时只要测定3 3H H的放射性脉冲数便可的放射性脉冲数便可 比较不同细胞的增殖活性。比较不同细胞的增殖活性。 1.7 1.7 细胞活力测定的细胞活力测定的MTTMTT比色法比色法 此法的原理是活细胞的线粒体脱氢酶能将染料此法的原理是活细胞的线粒体脱氢酶能将染料MTTMTT（二甲基（二甲基 噻唑二苯基四唑溴盐）转变为不可溶性的紫色甲鐟噻唑二苯基四唑溴盐）转变为不可溶性的紫色甲鐟(formazan )(formazan ) 颗粒，后者被酸性异丙醇溶解后所呈现的色度（用颗粒，后者被酸性异丙醇溶解后所呈现的色度（用

25、ODOD值表示）反值表示）反 映出活细胞的代谢水平。死亡细胞则无此酶活性。映出活细胞的代谢水平。死亡细胞则无此酶活性。 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 2.2.普通染色观察普通染色观察 苏木精苏木精伊红伊红（hematoxylin-eosin, hematoxylin-eosin, HEHE）染色染色和和GiemsaGiemsa染色染色 是观察培养细胞一般形态的最常用方法，也是把细胞作为标本保是观察培养细胞一般形态的最常用方法，也是把细胞作为标本保 存的主要方法。存的主要方法。 对于贴壁培养的细胞，以生长于盖玻片和塑料培养瓶壁者便于对于贴壁培养的细胞，以生长于盖玻片和塑料培养瓶壁者便

26、于 操作。固定前先用操作。固定前先用HanksHanks液、液、PBS, BSSPBS, BSS或生理盐水清洗培养物或生理盐水清洗培养物2 2次，次， 去除妨碍染色的血清。固定后可将盖玻片用树胶贴于载玻片上，以去除妨碍染色的血清。固定后可将盖玻片用树胶贴于载玻片上，以 利操作。利操作。 对于悬浮培养细胞，须先经离心沉淀对于悬浮培养细胞，须先经离心沉淀(1000 r/min, 10 min),(1000 r/min, 10 min), 弃上清液后（留少量液体），将细胞悬液滴于玻片上做成涂片，冷弃上清液后（留少量液体），将细胞悬液滴于玻片上做成涂片，冷 风吹干。风吹干。 培养物的观察检测方法培养物

27、的观察检测方法 3.3.细胞化学技术细胞化学技术 细胞化学技术（细胞化学技术（cytochemistrycytochemistry）可特异性地显示细胞内的）可特异性地显示细胞内的 细胞器和化学成分，其技术成熟，效果稳定，费用较低，即使细胞器和化学成分，其技术成熟，效果稳定，费用较低，即使 在免疫细胞化学畅行的今天，也仍不失为有效的研究技术。在免疫细胞化学畅行的今天，也仍不失为有效的研究技术。 3.1 3.1 酸性磷酸酶酸性磷酸酶 3.2 3.2 葡萄糖葡萄糖66磷酸酶磷酸酶 3.3 3.3 琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶 3.4 DNA3.4 DNA与与RNARNA的吖啶橙荧光染色法的吖啶橙荧光染色

28、法 3.5 DNA3.5 DNA的富尔根（的富尔根（Feulgen )Feulgen )染色法染色法 几种最常用的方法：几种最常用的方法： 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 3.3.细胞化学技术细胞化学技术 3.1 3.1 酸性磷酸酶酸性磷酸酶 酸性磷酸酶（酸性磷酸酶（acid phosphataseacid phosphatase）是溶酶体的特征性酶，故常用此）是溶酶体的特征性酶，故常用此 法作为研究溶酶体的指标。法作为研究溶酶体的指标。其原理是该酶在酸性条件下分解甘油磷酸钠，其原理是该酶在酸性条件下分解甘油磷酸钠， 释放出的磷酸根与醋酸铅的醋酸根置换，形成磷酸铅，后者与硫化胺作释放

29、出的磷酸根与醋酸铅的醋酸根置换，形成磷酸铅，后者与硫化胺作 用，最终形成棕黑色的硫化铅沉淀物，于镜下清晰可辨。用，最终形成棕黑色的硫化铅沉淀物，于镜下清晰可辨。 3.2 3.2 葡萄糖葡萄糖66磷酸酶磷酸酶 葡萄糖葡萄糖-6-6一磷酸酶（一磷酸酶（glucose-6-phosphatase )glucose-6-phosphatase )为滑面内质网的标志酶。为滑面内质网的标志酶。 琥珀酸脱氢酶（琥珀酸脱氢酶（succinodehydrogenasesuccinodehydrogenase）是线粒体的标志酶，参与）是线粒体的标志酶，参与 细胞有氧呼吸，其活性与线粒体活性平行，在癌细胞中其活性常

30、减弱。细胞有氧呼吸，其活性与线粒体活性平行，在癌细胞中其活性常减弱。 3.3 3.3 琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 3.3.细胞化学技术细胞化学技术 3.4 DNA3.4 DNA与与RNARNA的吖啶橙荧光染色法的吖啶橙荧光染色法 3.5 DNA3.5 DNA的富尔根（的富尔根（Feulgen )Feulgen )染色法染色法 吖啶橙（吖啶橙（acridine orange, AOacridine orange, AO）与细胞内的）与细胞内的DNA, RNADNA, RNA都有亲都有亲 和力，但结合后却发不同颜色的荧光，和力，但结合后却发不同颜色的荧光，D

31、NADNA呈亮绿色呈亮绿色，而，而RNARNA呈橘黄呈橘黄 色至火红色色至火红色。此法极简便快捷，并可染活细胞与固定细胞。此法极简便快捷，并可染活细胞与固定细胞。 此法原理是：在此法原理是：在6060条件下条件下DNADNA分子中的嘌呤碱和脱氧核糖的连分子中的嘌呤碱和脱氧核糖的连 键可被键可被1 mol/L1 mol/L盐酸水解打开，游离出的脱氧核糖醛基能与希夫盐酸水解打开，游离出的脱氧核糖醛基能与希夫 （Schiff )Schiff )试剂结合，形成试剂结合，形成紫红色复合物紫红色复合物。在此过程中。在此过程中RNARNA不受影响，不受影响， 故染色具故染色具DNADNA特异性。特异性。 准

32、确的温度和盐酸浓度，适宜的水解时间是成功的关键。水解过准确的温度和盐酸浓度，适宜的水解时间是成功的关键。水解过 度或不足均降低染色强度。度或不足均降低染色强度。 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 4.4.免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术 免疫细胞化学（免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICCimmunocytochemistry, ICC）是利用抗原与抗）是利用抗原与抗 体特异性结合的原理，以标记抗体作为探针来显示细胞内抗原成分，体特异性结合的原理，以标记抗体作为探针来显示细胞内抗原成分， 主要是多肽与蛋白质（包括受体、酶、分泌物前体等各种基因表达主要是多肽与蛋白

33、质（包括受体、酶、分泌物前体等各种基因表达 产物），对其进行定位、定性及定量的研究。在体外培养技术方面，产物），对其进行定位、定性及定量的研究。在体外培养技术方面， ICCICC是鉴定细胞类型的可靠手段是鉴定细胞类型的可靠手段。 4.1 4.1 常用免疫细胞化学技术原理常用免疫细胞化学技术原理 4.2 4.2 常用的显色标记物常用的显色标记物 4.3 4.3 免疫细胞化学方法及标记物的选择免疫细胞化学方法及标记物的选择 4.4 4.4 免疫细胞化学的一般问题免疫细胞化学的一般问题 4.5 4.5 免疫细胞化学染色的典型程序免疫细胞化学染色的典型程序 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 4

34、.4.免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术 4.1 4.1 常用免疫细胞化学技术原理常用免疫细胞化学技术原理 标记物标记物 二抗二抗 一抗一抗 抗原抗原 标记物标记物 SPA 一抗一抗 抗原抗原 标记链亲和素标记链亲和素 生物素生物素 二抗二抗 一抗一抗 抗原抗原 PAP复合物复合物 二抗二抗 一抗一抗 抗原抗原 间接法间接法 SPASPA法法 LSABLSAB法法PAPPAP法法 常用免疫细胞化学技术原理示意图常用免疫细胞化学技术原理示意图 4.1.1 4.1.1 间接法间接法 indirect methodindirect method 4.1.2 4.1.2 过氧化物酶过氧化物酶 抗过氧化物

35、酶法抗过氧化物酶法 peroxidase-anti peroxidase, peroxidase-anti peroxidase, PAPPAP法法 4.1.3 4.1.3 标记链亲和素标记链亲和素 生物素法生物素法 labeled streptoavidin labeled streptoavidin biotin,biotin, LSAB LSAB法法 4.1.4 4.1.4 葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A A法法 staphylococal protein A, staphylococal protein A, SPASPA法法 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 4.4.免疫细胞化学

36、技术免疫细胞化学技术 4.1 4.1 常用免疫细胞化学技术原理常用免疫细胞化学技术原理 4.1.1 4.1.1 间接法间接法 最原始的最原始的ICCICC技术是在获得针对某抗原的特异性抗体后，各实验室自技术是在获得针对某抗原的特异性抗体后，各实验室自 行对该抗体进行标记，然后用标记抗体直接进行免疫染色。这种方法虽然行对该抗体进行标记，然后用标记抗体直接进行免疫染色。这种方法虽然 步骤不多，然而标记抗体操作复杂，质量也不易保持稳定。步骤不多，然而标记抗体操作复杂，质量也不易保持稳定。 由于种间的免疫球蛋白互具抗原性，这样可以制备如抗小鼠由于种间的免疫球蛋白互具抗原性，这样可以制备如抗小鼠IgUI

37、gU的兔的兔 抗体，前者简称一抗，后者简称二抗。二抗可以与所有特异性不同的小鼠抗体，前者简称一抗，后者简称二抗。二抗可以与所有特异性不同的小鼠 一抗结合，只需要标记二抗便解决了标记不同一抗的麻烦。一抗结合，只需要标记二抗便解决了标记不同一抗的麻烦。目前，标记的二目前，标记的二 抗已完全商品化。这样，用二抗间接显示抗原的方法便取代了原始的直接法。抗已完全商品化。这样，用二抗间接显示抗原的方法便取代了原始的直接法。 间接法（间接法（indirect methodindirect method）的另一优点是）的另一优点是1 1个一抗分子上可以结合个一抗分子上可以结合3-3- -5-5个二抗分子，因此

38、该方法的敏感度提高。个二抗分子，因此该方法的敏感度提高。 标记物标记物 二抗二抗 一抗一抗 抗原抗原 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 4.4.免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术 4.1 4.1 常用免疫细胞化学技术原理常用免疫细胞化学技术原理 4.1.2 4.1.2 过氧化物酶过氧化物酶抗过氧化物酶法抗过氧化物酶法 （peroxidase-antiperoxidase, PAPperoxidase-antiperoxidase, PAP法）法） 这里的这里的过氧化物酶过氧化物酶特指特指辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, (horseradish

39、 peroxidase, HRPHRP）。）。 该酶经细胞化学反应而呈色。该酶经细胞化学反应而呈色。HRPHRP作为一种蛋白质可制备出相应抗体。作为一种蛋白质可制备出相应抗体。 PAPPAP复合物即为复合物即为3 3个酶分子与个酶分子与2 2个抗酶抗体结合形成的稳定的环状结构。个抗酶抗体结合形成的稳定的环状结构。 此法的前提是抗酶抗体与一抗同源，即可与二抗结合。这样，此法的前提是抗酶抗体与一抗同源，即可与二抗结合。这样，1 1个二抗个二抗 分子上间接地标记了分子上间接地标记了3 3个酶分子。个酶分子。 因此，因此，PAPPAP法的敏感度从理论上讲比间接法（酶标）提高了两倍法的敏感度从理论上讲比

40、间接法（酶标）提高了两倍。但由。但由 于于PAPPAP复合物分子大，穿透性差，其敏感度增强的实际效果可能要打折扣。复合物分子大，穿透性差，其敏感度增强的实际效果可能要打折扣。 PAPPAP 复合物复合物 二抗二抗 一抗一抗 抗原抗原 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 4.4.免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术 4.1 4.1 常用免疫细胞化学技术原理常用免疫细胞化学技术原理 4.1.3 4.1.3 标记链亲和素标记链亲和素生物素法生物素法 （labeled streptoavidin biotin, LSABlabeled streptoavidin biotin, LSAB法）法） 链

41、亲和素是从链球菌提取的一种糖蛋白。生物素即维生素链亲和素是从链球菌提取的一种糖蛋白。生物素即维生素H H。这两种物。这两种物 质有极强的亲和力，并且质有极强的亲和力，并且1 1分子链亲和素可结合多分子生物素。分子链亲和素可结合多分子生物素。 此法即利用生物素标记二抗，然后再加有不同标记物的链亲和素。对此法即利用生物素标记二抗，然后再加有不同标记物的链亲和素。对 链亲和素的标记方法有多种，简单者如将链亲和素标记上链亲和素的标记方法有多种，简单者如将链亲和素标记上HRPHRP或荧光素，复或荧光素，复 杂者则制备出链亲和素（或亲合素）杂者则制备出链亲和素（或亲合素）生物素生物素PAPPAP复合物（复

42、合物（avidin-avidin- biotin PAP complex)biotin PAP complex)，后者即，后者即ABCABC法。法。由于由于1 1个抗体分子上可结合多至个抗体分子上可结合多至150150 个生物素分子，于是，这类方法的敏感度便大大增强，一抗的稀释度得以提个生物素分子，于是，这类方法的敏感度便大大增强，一抗的稀释度得以提 高。高。 标记链亲和素标记链亲和素 生物素生物素 二抗二抗 一抗一抗 抗原抗原 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 4.4.免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术 4.1 4.1 常用免疫细胞化学技术原理常用免疫细胞化学技术原理 4.1.4 4.

43、1.4 葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A A法（法（staphylococal protein A, SPAstaphylococal protein A, SPA法）法） SPASPA具有与人、小鼠、猪以及猴等动物的抗体具有与人、小鼠、猪以及猴等动物的抗体FcFc段结合的能段结合的能 力。因此，利用力。因此，利用HRPHRP、荧光素或胶体金标记的、荧光素或胶体金标记的SPASPA可以完成标记二可以完成标记二 抗的功能，堪称抗的功能，堪称“广谱二抗广谱二抗”。 SPASPA的分子量小，穿透细胞的能力强于抗体，这样可提高方的分子量小，穿透细胞的能力强于抗体，这样可提高方 法的敏感度。法的敏感度。 培养

44、物的观察检测方法培养物的观察检测方法 4.4.免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术 4.2 4.2 常用的显色标记物常用的显色标记物 4.2.1 4.2.1 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 4.2.2 4.2.2 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 用用辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, horseradish peroxidase, HRPHRP）及其）及其 它酶（如碱性磷酸酶）作标记物的它酶（如碱性磷酸酶）作标记物的ICCICC常称为常称为免疫酶方法免疫酶方法。HRPHRP经经 细胞化学反应后于标记部位形成稳定的有色终产物。细胞化学反应后于标记部位形成稳定的有色终产物

45、。 用用碱性磷酸酶碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, alkaline phosphatase, ALPALP）代替）代替HRPHRP作作 标记物进行免疫酶染色，主要用于内源性过氧化物酶含量高的标记物进行免疫酶染色，主要用于内源性过氧化物酶含量高的 细胞，以避免非特异性染色。细胞，以避免非特异性染色。 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 4.4.免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术 4.2 4.2 常用的显色标记物常用的显色标记物 4.2.3 4.2.3 荧光素荧光素 用荧光素（用荧光素（(luorescein)(luorescein)作标记物的作标记物的ICCICC常称

46、为免疫荧光技术。异硫常称为免疫荧光技术。异硫 氰酸荧光素（氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC)fluorescein isothiocyanate, FITC)和四甲基异硫氰酸罗和四甲基异硫氰酸罗 达明达明( tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC( tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC）是最常用的荧）是最常用的荧 光素。光素。 用荧光素作标记物无需呈色反应，因而省时简便。但由于荧光会逐用荧光素作标记物无需呈色反应，因而省时简便。但由于荧光会逐 渐减退，故

47、染色后应尽早观察和摄影。渐减退，故染色后应尽早观察和摄影。 近年启用的抗褪色剂近年启用的抗褪色剂DABCO1-4diaza-bicyclo(2-2-2) octaneDABCO1-4diaza-bicyclo(2-2-2) octane封封 固能有效延长染色后标本的可观察期至一周或更长。如封固后盖玻片四固能有效延长染色后标本的可观察期至一周或更长。如封固后盖玻片四 周用指甲油（非丙酮溶剂）密封，效果则更好。封固后的标本不观察时周用指甲油（非丙酮溶剂）密封，效果则更好。封固后的标本不观察时 均应置于避光、均应置于避光、44或低温处。或低温处。 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 4.4.免

48、疫细胞化学技术免疫细胞化学技术 4.2 4.2 常用的显色标记物常用的显色标记物 4.2.4 4.2.4 胶体金与免疫金银技术胶体金与免疫金银技术 胶体金胶体金(colloid gold)(colloid gold)即金的水溶液，为最常用的金属标记即金的水溶液，为最常用的金属标记 物。用胶体金作标记物的物。用胶体金作标记物的ICCICC称称免疫金技术免疫金技术。 免疫金技术和免疫荧光技术一样，免疫染色后即可于镜下观免疫金技术和免疫荧光技术一样，免疫染色后即可于镜下观 察，无需标记物的显示程序。察，无需标记物的显示程序。 供光镜观察的免疫金染色使用的胶体金颗粒直径通常较大，供光镜观察的免疫金染色

49、使用的胶体金颗粒直径通常较大， 为为20nm20nm，镜下呈粉红色。体积大的金颗粒与抗体的结合不十分稳，镜下呈粉红色。体积大的金颗粒与抗体的结合不十分稳 定，这便降低了免疫金方法的敏感度。定，这便降低了免疫金方法的敏感度。 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 4.4.免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术 4.2 4.2 常用的显色标记物常用的显色标记物 4.2.4 4.2.4 胶体金与免疫金银技术胶体金与免疫金银技术 尔后发明的尔后发明的免疫金银技术免疫金银技术则有效地避免了这一缺陷。则有效地避免了这一缺陷。 其原理是：其原理是：使已在抗原位置沉积的金颗粒发挥催化作用，促使已在抗原位置沉积的

50、金颗粒发挥催化作用，促 进银离子被氢醌（进银离子被氢醌（hydroquinonehydroquinone）还原为银原子，后者围绕金颗）还原为银原子，后者围绕金颗 粒形成一层银壳；银壳本身也具有催化作用，使更多的银离子还粒形成一层银壳；银壳本身也具有催化作用，使更多的银离子还 原沉积，银壳便增大，镜下呈黑色颗粒。这样抗原的存在部位便原沉积，银壳便增大，镜下呈黑色颗粒。这样抗原的存在部位便 显著放大。因而免疫金银技术可以使用与抗体结合牢固的显著放大。因而免疫金银技术可以使用与抗体结合牢固的5 510 10 nmnm胶体金。胶体金。 据认为，免疫金银技术敏感度高于据认为，免疫金银技术敏感度高于PAP

51、PAP法。法。 4.3 4.3 免疫细胞化学方法及标记物的选择免疫细胞化学方法及标记物的选择 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 4.4.免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术 理想的方法应是敏感、简便、快速以及经济，但主要取决于所理想的方法应是敏感、简便、快速以及经济，但主要取决于所 研究的标本及其抗原的分布与含量。研究的标本及其抗原的分布与含量。 一般来讲，估计抗原含量中等以上的标本可应用一般来讲，估计抗原含量中等以上的标本可应用间接法间接法或或SPASPA法法。 如果有如果有荧光显微镜荧光显微镜则可采用便捷的则可采用便捷的免疫荧光技术免疫荧光技术。估计抗原含量中。估计抗原含量中 等以下宜

52、采用等以下宜采用LSABLSAB法法、PAPPAP法法或者或者免疫金银技术免疫金银技术。 4.3 4.3 免疫细胞化学方法及标记物的选择免疫细胞化学方法及标记物的选择 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 4.4.免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术 ICCICC与与免疫组织化学免疫组织化学（immunohistochemistryimmunohistochemistry）的不同之处在于后）的不同之处在于后 者要做组织切片，细胞被切开后，核与胞质内的抗原暴露于抗体，二者者要做组织切片，细胞被切开后，核与胞质内的抗原暴露于抗体，二者 极易结合。而极易结合。而ICCICC技术的染色对象一般为完整的

53、细胞。技术的染色对象一般为完整的细胞。 细胞膜在固定后其通透性虽有所增强，但对于抗体这样的大分子仍细胞膜在固定后其通透性虽有所增强，但对于抗体这样的大分子仍 嫌不够，需进一步提高。常用方法为以去垢剂嫌不够，需进一步提高。常用方法为以去垢剂Triton XTriton X脱去细胞膜中最脱去细胞膜中最 主要的成分脂质。另一方面是要选择分子量较小因而穿透性较大的探针。主要的成分脂质。另一方面是要选择分子量较小因而穿透性较大的探针。 用小分子量的荧光素或生物素标记的二抗均比酶标者穿透性大，用用小分子量的荧光素或生物素标记的二抗均比酶标者穿透性大，用 SPASPA代替二抗也是一种明智的选择。而用代替二抗

54、也是一种明智的选择。而用PAPPAP与胶体金一般较适用于细胞与胶体金一般较适用于细胞 表面抗原的染色。表面抗原的染色。 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 4.4.免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术 4.4 4.4 免疫细胞化学的一般问题免疫细胞化学的一般问题 4.5 4.5 免疫细胞化学染色的典型程序免疫细胞化学染色的典型程序 （略）（略） （略）（略） 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 5.5.原位杂交技术原位杂交技术 免疫细胞化学免疫细胞化学是在是在翻译水平翻译水平检测基因的表达结果（蛋白质），检测基因的表达结果（蛋白质），原位杂原位杂 交交（in situ hybridiz

55、ation, in situ hybridization, ISHISH) )技术技术则是检测基因的有无及在则是检测基因的有无及在转录水平转录水平 检测基因的活性检测基因的活性(mRNA)(mRNA)。 ISHISH的原理是：的原理是：应用带有标记物的已知碱基顺序的应用带有标记物的已知碱基顺序的核酸探针核酸探针与细胞内与细胞内 待测的核酸（待测的核酸（DNADNA或或RNARNA）按碱基配对的原则进行特异性原位结合，此即为）按碱基配对的原则进行特异性原位结合，此即为 杂交杂交，然后通过对标记物的检测而获知待测核酸的有无及相对量。，然后通过对标记物的检测而获知待测核酸的有无及相对量。 5.1 5

56、.1 探针与标记物的选择探针与标记物的选择 5.2 5.2 原位杂交技术主要实验材料原位杂交技术主要实验材料 5.3 5.3 杂交杂交 5.4 5.4 显示标记物显示标记物 5.5 5.5 设立对照设立对照 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 5.5.原位杂交技术原位杂交技术 5.1 5.1 探针与标记物的选择探针与标记物的选择 5.1.1 5.1.1 常用的探针常用的探针 常用的探针有三种：常用的探针有三种： 5.1.1.1 cRNA5.1.1.1 cRNA探针：探针： 5.1.1.2 DNA5.1.1.2 DNA探针：探针： 5.1.1.3 5.1.1.3 寡核苷酸探针：寡核苷酸探针

57、： 前两者的理想长度是前两者的理想长度是100100个左右的碱基或碱基对。个左右的碱基或碱基对。 目前，目前，cRNAcRNA探针探针应用最为广泛。应用最为广泛。 一般认为，一般认为，RNA-RNARNA-RNA杂交体的稳定性强于杂交体的稳定性强于RNA-DNARNA-DNA杂交体，后者杂交体，后者 又强于又强于DNA-DNADNA-DNA杂交体。杂交体。 但是，但是，RNARNA易于被环境中普遍存在的易于被环境中普遍存在的RNARNA酶所降解而造成假阴性酶所降解而造成假阴性 结果，因此操作要求十分严格。结果，因此操作要求十分严格。 单链单链DNADNA探针由于探针由于PCRPCR技术的推广，

58、其合成与操作均比技术的推广，其合成与操作均比RNARNA探针简探针简 易，应用日渐增多。易，应用日渐增多。 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 5.5.原位杂交技术原位杂交技术 5.1 5.1 探针与标记物的选择探针与标记物的选择 5.1.1 5.1.1 常用的探针常用的探针 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 5.5.原位杂交技术原位杂交技术 5.1 5.1 探针与标记物的选择探针与标记物的选择 5.1.2 5.1.2 探针标记物探针标记物 在上述探针的合成中，均要加入带有标记物的核苷酸。在上述探针的合成中，均要加入带有标记物的核苷酸。合合 成成RNARNA探针探针用标记的用标记

59、的三磷酸尿嘧啶（三磷酸尿嘧啶（UTPUTP），合成合成DNADNA探针探针用标用标 记的记的三磷酸胸腺嘧啶（三磷酸胸腺嘧啶（TTPTTP）。应用的标记物有。应用的标记物有放射性核素放射性核素以以 及及半抗原半抗原等。等。 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 5.5.原位杂交技术原位杂交技术 5.2 5.2 原位杂交技术主要实验材料原位杂交技术主要实验材料 （1 1） 标本的制备标本的制备 （略）（略） （2 2） 实验所用器具实验所用器具 （略）（略） （3 3） 溶液配制溶液配制 （略）（略） 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 5.5.原位杂交技术原位杂交技术 5.3 5.3

60、杂交杂交 （1 1）杂交前处理）杂交前处理 （略）（略） （2 2）杂交过程）杂交过程 （略）（略） （3 3）杂交后清洗）杂交后清洗 （略）（略） （4 4）使用）使用RNARNA探针杂交的一般程序探针杂交的一般程序 （略）（略） （5 5）使用）使用DNADNA探针进行杂交的特点探针进行杂交的特点 （略）（略） （6 6）使用）使用DNADNA探针杂交的一般程序探针杂交的一般程序 （略）（略） 培养物的观察检测方法培养物的观察检测方法 5.5.原位杂交技术原位杂交技术 5.4 5.4 显示标记物显示标记物 半抗原标记物的显示：可按试剂盒说明进行。半抗原标记物的显示：可按试剂盒说明进行。 放