肝炎病毒核酸检测及临床诊疗最新进展

1、汇报人： Part 1 肝病PCR检测国内外需求及现状 Part 2 肝病PCR检测最新解决方案 Part 3 肝病PCR检测的发展趋势 Part 1 肝病PCR检测国内外需求及现状 Part 2 肝病PCR检测最新解决方案 Part 3 肝病PCR检测的发展趋势 l 2008年美国肝病协会CHB防治指南：持久消除HBV是乙肝的治疗终点， HBV DNA病毒载量尽可能小于或等于10 IU/ ml。 l 欧洲肝病研究学会EASL2010年指南指出：将HBV DNA病毒载量尽可能控 制在10-15 IU/ ml，能有效防止疾病的复发。 l欧洲肝病研究学会EASL2011指南指出：丙肝患者治疗的目标

2、需HCV RNA病 毒载量低于50 IU/ ml。 （一）（一） 核苷核苷( (酸酸) )类似物治疗慢性乙肝路线图类似物治疗慢性乙肝路线图 治疗第治疗第12周周 评估原发性治疗失败评估原发性治疗失败 HBV-DNA水平较基线水平下降幅度水平较基线水平下降幅度1log/ml 开始治疗开始治疗 HBV-DNA基线水平监测基线水平监测 病毒学完全应答病毒学完全应答 HBV-DNA2000 IU/ml 增加增加/更换有效的药物治疗更换有效的药物治疗 监测监测HBV-DNA/6个月个月 治疗第治疗第24周周 评估抗病毒疗效的早期预测因子评估抗病毒疗效的早期预测因子 60IU/ml如何检测？ * * 由美

3、国坦福大学医学中心由美国坦福大学医学中心KeeffeKeeffe教授（专家组）提供教授（专家组）提供 n国家SFDA技术审评中心“863”课题 HBV DNA定量试剂 技术审评指导原则中指出： l HBV DNA建议最低检测限应30 IU/mL。 l DNA提取纯化方法不建议采用煮沸法进行DNA提取。 内标全程参与！ 核酸上样量20 ul！ 加热煮加热煮 沸沸 高速离高速离 心心 过柱吸过柱吸 附附 n 陈旧的技术 n 繁琐的过程 国内HBV DNA检测方法多为煮沸法，试剂灵敏度 均为500IU/ml或1000IU/ml。 国内大部分HCV RNA检测方法多为柱提法，试剂 灵敏度1000IU/

4、ml。 n 令人揪心的性能 五种乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测试剂盒的比较,中华传染病杂志， 2009年 第3期吴星,黄维金, 周诚 ,庄辉 等(中国药品生物制品检定所, 北京大学医学部) 国家“十一五”科技重大专项 “乙型和丙型病毒性肝炎诊断及临床监 测的研究” 鲁凤民教授 北京大学肝炎试剂研究中心 n 专家呼吁：高精度，超敏感的核酸诊断试剂的开 发是目前肝炎诊疗中的关键步骤！ 面对当前肝病毒 核酸检测技术的 现状，我们真没 有办法了吗？ Part 1 肝病PCR检测国内外需求及现状 Part 2 肝病PCR检测最新解决方案 Part 3 肝病PCR检测的发展趋势 临床核酸提取技术的发展：临床

5、核酸提取技术的发展： 煮沸法煮沸法 酚氯仿法酚氯仿法 旋转离心柱法旋转离心柱法 玻璃粉吸附法玻璃粉吸附法 二氧化硅吸附法二氧化硅吸附法 磁珠法磁珠法 国内主流方法国内主流方法 国际主流方法国际主流方法 p 高精度高精度 p 高品质高品质 p 高科技高科技 磁珠（电子显微镜） 磁珠分离器 p 磁珠法磁珠法 -核酸诊断领域新方向。核酸诊断领域新方向。 DNA 磁珠与DNA的结合 -通过超顺磁性颗粒富集通过超顺磁性颗粒富集 核酸，实现样品高纯度、高核酸，实现样品高纯度、高 灵敏度的检测。灵敏度的检测。 p 原理原理 l磁珠法提取核酸效率高，纯度高，特异性好。 l采用最新一代的磁珠提取核酸技术，无需加

6、热、无 需高速离心、灵敏度极高，能够很好的满足临床诊疗 的需求。 l抗干扰能力强，能胜任高血脂、强溶血以及药物治 疗标本的检测，是临床疾病检测的有力手段。 l极易实现自动化。 灵敏度可达灵敏度可达10IU/ml，是国产主流试剂的，是国产主流试剂的50-100倍；倍； 准确定量线性范围为准确定量线性范围为20IU/ml2.0109IU/ml 可检测可检测HBV A、B、C、D、E、F、G、H共共8个基因型。个基因型。 设置了监控内标设置了监控内标IC,有效避免假阴性。有效避免假阴性。 设置内参比荧光设置内参比荧光ROX，定量更准确。，定量更准确。 u以湖南圣湘乙肝磁珠法为例 u以湖南圣湘乙肝磁珠

7、法为例 * 9例定值在12 50 IU/ml之间 圣湘磁珠法技术在灵敏度方面存在明显优势，与进口试剂具有很好的一致圣湘磁珠法技术在灵敏度方面存在明显优势，与进口试剂具有很好的一致 性，能够很好的胜任临床药物疗效的观察和治疗终点的确定。性，能够很好的胜任临床药物疗效的观察和治疗终点的确定。 Sansure-HBV ：圣湘HBV磁珠法 Roche-HBV ：罗氏 AmpliPrep-Cobas TaqMan HBV Test X-HBV：国内一家上市公司的HBV产品（浓缩煮沸法） Part 1 肝病PCR检测国内外需求及现状 Part 2 肝病PCR检测最新解决方案 Part 3 肝病PCR检测的

8、发展趋势 （2533+2883）15=？ n简单化的要求 一步法技术：最简便的PCR技术 一步操作即可实现核酸提取。 一步法技术优势： l快速，处理96个样本仅需 30min。 l成本低，仅需一套移液器即可实现病毒检测。 l操作步骤少，减少误差发生率，提高准确性。 l极易掌握，对操作人员要求低，方便科室的人 员安排。 n准确化的要求 -内标监测系统， 假阴性的克星。 内标参与核酸提取与扩增，通过检测内标是否正常来监 测核酸提取和核酸扩增的有效性，试验结果是否有效， 避免PCR假阴性。 FAM:525nm HEX:555nm 目的基因目的基因 内标内标 真阴性真阴性 HEX曲线曲线 FAM曲线曲线 设置了参比荧光ROX，用于校正枪的误差、