Western-blot实验操作步骤

1、一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）1 倒掉细胞培养液，加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS 后将细胞培养瓶置于冰上。2裂解液RIPA （强）1ml +PMSF10UI （100:1）,两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动。3. 裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后 续实 验（-80保存）常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再 加入1 ml PBS用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中

2、， 12000rpm,离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。融化蛋白样品，加入RIPA+PMS细胞裂解液（200ul/ep管），充分混 匀，冰上裂解20min, 4度离心，5min , 12000rpm,小心吸取上清至新 的ep管中。二、蛋白浓度测定（BCA法）BCA碧云天）蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。在50- 2000ug/ml浓度范围内有较好的线性矢系。标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存),完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml (

3、ug/ul)。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可以用0.9%NaC或PBSA释标准品。1. 配置BCA工作液A液：B液二50 : 1 ，混匀A液+B液=200ul （每个样本）样本数量：7个标准品+ N个待测蛋白样本2. 先将每孔加入200ul BCAT作液，再加入蛋白样本。（96孔板）总体积为10uL待测蛋白样本先10倍稀释96孔编号#1#2#3#4#5#6#7BSA标准Oul1ul2ul4ul6ul8ul10ul蛋白ddH2O10ul9ul8ul6ul4ul2ulOul96孔待测蛋 白样本1待测蛋 白样本2待测蛋 白样本 3待测蛋 白样本N10ul/ we

4、ll3.37度，温箱中孵育30min。562nm波长，测ODf直。待测蛋白样品浓 度在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性尖系。4. 根据所测样品的0D直，绘制标准曲线。根据标准曲线即可计算样本 相应的蛋白含量，除以样本稀释液总体积（10ul）,再乘以样本稀释倍 数，即为样本的实际浓度（ug/ul）5. 蛋白定量后，以最小蛋白浓度为标准，将各组蛋白样本调至相同浓度（ddH2O补齐）绘制标准曲线：X轴为蛋白质量，丫为0D直插入一 XY散点图，选中图上一点，右键，添加趋势线一选项（显示公式，显示R2，R20.99有意义）三、蛋白变性1 室温融解SDS-PAG蛋白上样缓冲液（漠酚蓝染料）（

5、2x或5x ）2 将适量蛋白样本与SDS-PAG上样缓冲液混合，使其终浓度为1x3.100 度或沸水煮3-5min，充分变性蛋白。冷却至室温后，直接上样到SDS- PAG胶加样孔内即可。或冷却后-80保存用于后续实验。四、蛋白电泳1 -配胶：根据配胶试剂盒操作步骤，按照目的蛋白分子量大小，选择 相应浓度的分离胶。配胶时最后加10%士硫酸鞍和TEMED每板分离胶 5ml，浓缩胶3ml.短板在内侧。配好后如暂时不用，可将胶板取下，电 泳液中浸泡，4度保存。2. 配电泳液1x甘氨酸-Tris电泳缓冲液1LTris 3.03g甘氨酸14.4gSDS 1g3. 蛋白上样：样本10-30ul （保证蛋白质

6、量最少为30ug） 20-25ul蛋白 Marker 5ul选择较好的孔加样，并记录加样位置4. 连接电极，跑电泳:电泳条件80V,30min （蓝色条带到达浓缩胶底 部）-1 1 0V,90min （参考Marker的位置蓝色条带跑到胶底部即可）五、转膜1 配转膜液:1L Tris 3.03g甘氨酸I4.4g,加水至800ml,最后加甲醇200ml,调至总体积为1L.2. 切胶：起胶时将胶留在长玻璃板上，将裁减好的膜做好标记后浸泡在 转膜液中。确定目的蛋白的位置（根据Marker条带），切胶，保 留目的 蛋白位置,将膜置于胶上，膜数字面在上,背面与胶相贴，数字标记端贴在 Marker 上。3. 准备转膜：按如下顺序阳极（红）滤纟氏膜胶滤纸阴极（黑）4. 连接电极，转膜：90V,90min六、封闭1 配封闭液:0.5g脱脂奶粉+ 10ml PBS2取下膜，注意蛋白在膜与胶贴合的一面，取下后将膜有蛋白面朝下，封 闭1小时七、抗体孵育配抗体稀释液：0.5g脫脂奶粉，10ul Tween, 10ml PBS配洗膜液：100ul Tween + 100ml PBS一抗孵育，4度过夜次日，洗膜液洗