生物化学：第16章 DNA的合成及重组

1、 第一节第一节 基因组复制的主要特点基因组复制的主要特点 第二节第二节 DNA复制过程复制过程 第三节第三节 DNA的反转录合成的反转录合成 第四节第四节 DNA损伤修复损伤修复 第五节第五节 DNA重组重组 DNA生物合成生物合成 DNA复制（复制（DNA指导的指导的DNA合成）合成） 逆转录（逆转录病毒逆转录（逆转录病毒RNA指导的指导的DNA合成）合成） 含有一种生物的一整套遗传信息的遗传物质，称为含有一种生物的一整套遗传信息的遗传物质，称为 基因组基因组 (genome)。在真核生物体中，基因组是指一。在真核生物体中，基因组是指一 套完整单倍体套完整单倍体DNA（染色体（染色体DNA）

2、和线粒体）和线粒体DNA的的 全部序列，既包括编码序列，也包括非编码序列。全部序列，既包括编码序列，也包括非编码序列。 （一）基因组（一）基因组DNA都具有都具有固定的复制起始点固定的复制起始点 （二）复制过程中形成复制泡和（二）复制过程中形成复制泡和复制叉复制叉 （三）复制的基本单位称为（三）复制的基本单位称为复制子复制子 （四）（四）半保留复制半保留复制方式保证遗传信息的忠实传递方式保证遗传信息的忠实传递 （五）（五）半不连续复制半不连续复制克服了克服了DNA空间结构对空间结构对DNA 新链合成的制约新链合成的制约 （六）复制起点由（六）复制起点由多个短重复序列多个短重复序列组成组成 （七

3、）（七）DNA复制必须有复制必须有引物引物 复制起始点复制起始点 (origin of replication, ori)： 指指DNA复制所必需的一段特殊的复制所必需的一段特殊的DNA序列。序列。 双螺旋双螺旋DNA复制时，复制区生长点的结构呈复制时，复制区生长点的结构呈Y 形或叉形，称之为形或叉形，称之为复制叉复制叉 (replication fork)。 亲代亲代DNA在复制起始点解链后，就形成一个复制泡，在复制起始点解链后，就形成一个复制泡， 即两个复制叉，分别向相反的方向进行双向复制。即两个复制叉，分别向相反的方向进行双向复制。 真核生物线性真核生物线性 DNA的复制泡的复制泡 复制

4、子复制子 (replicon) 从一个从一个DNA复制起点起始的复制起点起始的DNA复制区域，它是复制区域，它是 一个独立复制单位，包括复制起点和终点。一个独立复制单位，包括复制起点和终点。 1) 全保留式全保留式 (conservative)，即恢复原来的，即恢复原来的DNA 双螺旋，并产生一个新的子代双螺旋，并产生一个新的子代DNA双螺旋；双螺旋； 2) 半保留式半保留式 (semiconservative)，即新老搭配，由，即新老搭配，由 一条新合成的一条新合成的DNA链和一条复制模板链配对产链和一条复制模板链配对产 生子代双螺旋生子代双螺旋DNA； 3) 散布式散布式 (dispers

5、ive)，即复制模板链被分成许多，即复制模板链被分成许多 小片段，散布于子代小片段，散布于子代DNA中。中。 两条新合成的两条新合成的DNA链和两条原来的复制模板链之链和两条原来的复制模板链之 间的结合方式可能性：间的结合方式可能性： 实验结果支持半保留复制方式实验结果支持半保留复制方式 含重氮含重氮-DNA的细菌的细菌 培养于普培养于普 通培养液通培养液 第一代第一代 继续培养于继续培养于 普通培养液普通培养液 第二代第二代 梯度离心结果梯度离心结果 14N-DNA 14N,15N-DNA 14N,15N-DNA 15N-DNA 3 3 5 解链方向解链方向 3 5 3 3 5 前导链前导链

6、 (leading strand) 后随链后随链 (lagging strand) 冈崎片段冈崎片段 5 5 DNA新链合成都是沿新链合成都是沿5 3 方向延伸方向延伸 后随链后随链 (lagging strand)：另一条链的合成方向与复：另一条链的合成方向与复 制叉前进方向相反，不能连续复制，只能分成若干制叉前进方向相反，不能连续复制，只能分成若干 小片段分别合成，然后连接起来形成新链。后随链小片段分别合成，然后连接起来形成新链。后随链 中的小片段称为中的小片段称为冈崎片段冈崎片段 (Okazaki fragments)。 前导链连续复制而后随链不连续复制，即前导链连续复制而后随链不连续复

7、制，即DNA半不半不 连续复制连续复制。 前导链前导链 (leading strand)：DNA复制时，一条链的合复制时，一条链的合 成方向和复制叉前进方向相同，可以连续复制合成成方向和复制叉前进方向相同，可以连续复制合成 的新链。的新链。 复制起点的一般特征复制起点的一般特征: 由多个独特的短重复序列组成。由多个独特的短重复序列组成。 短重复序列被多亚基的复制起始因子所识别并短重复序列被多亚基的复制起始因子所识别并 结合。结合。 一般富含一般富含AT，利于双螺旋，利于双螺旋DNA解旋，以产生解旋，以产生 单链单链DNA复制模板。复制模板。 GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT

8、 GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA 58 66 166 174 201 209 237 245 同向重复序列同向重复序列反向重复序列反向重复序列 5 3 5 3 酵母复制起点为自主复制序列酵母复制起点为自主复制序列 (autonomously replicating sequences, ARS)： 酵母染色体含有多个复制起点。酵母染色体含有多个复制起点。 元件元件A（富含（富含A/T的共有序列）：结合一个特异的的共有序列）：结合一个特异的 蛋白质复合物蛋白质复合物复制起点识别复合物复制

9、起点识别复合物 (ORC)。 3个序列（个序列（B1、B2和和B3）可以增加复制起点的效）可以增加复制起点的效 率，其中率，其中B2的的9个碱基与上述个碱基与上述ARS共有序列相同。共有序列相同。 DNA聚合酶不能从游离的核苷酸开始合成聚合酶不能从游离的核苷酸开始合成DNA链，链， 必须由引物必须由引物 (primer)提供自由的提供自由的3 -OH末端，通过末端，通过 加入核苷酸使之不断延伸。加入核苷酸使之不断延伸。 所有细胞和多数病毒的所有细胞和多数病毒的DNA复制，首先利用模板合复制，首先利用模板合 成一段成一段RNA引物，这一过程为引发引物，这一过程为引发 (priming)。 RNA

10、引物引物5 端的第一个核苷酸通常是端的第一个核苷酸通常是pppA（个别为（个别为 pppG）。）。 174等噬菌体以双链环形等噬菌体以双链环形DNA的一条链上产生切口处的一条链上产生切口处 的的3 -OH为引物；为引物； 腺病毒及某些线性腺病毒及某些线性DNA病毒以结合于病毒病毒以结合于病毒DNA的的5 端磷端磷 酸基团的末端蛋白上的酸基团的末端蛋白上的dCTP的的3 -OH为引物开始复制。为引物开始复制。 3 -OH 5 -P （一）真核生物基因组（一）真核生物基因组DNA复制过程涉及反转录复制过程涉及反转录 （二）基因组单链（二）基因组单链DNA通过复制中间体完成复制通过复制中间体完成复制

11、 （三）有的基因组（三）有的基因组DNA通过通过RNA中间体进行复制中间体进行复制 （四）双链环状（四）双链环状DNA也有不同的复制方式也有不同的复制方式 （一）基因组双链（一）基因组双链RNA复制过程是双链复制复制过程是双链复制 （二）基因组单链正链（二）基因组单链正链RNA以负链为模板进行复制以负链为模板进行复制 （三）基因组单链负链（三）基因组单链负链RNA以正链以正链RNA为模板进行复制为模板进行复制 （四）反转录病毒的基因组（四）反转录病毒的基因组RNA通过通过DNA中间体进行复制中间体进行复制 1E.coli复制起始需要复制起始需要6种蛋白质因子种蛋白质因子 2解螺旋酶激活引发酶形

12、成引发体解螺旋酶激活引发酶形成引发体 3解旋还需要促旋酶和解旋还需要促旋酶和SSB 结合结合oriC的的4个个9bp反向重复序列形成复制起始复反向重复序列形成复制起始复 合物。合物。 作用于作用于oriC的的3个个13bp正向重复序列，正向重复序列，DNA在这在这3 个位点解链，形成开放型复合物个位点解链，形成开放型复合物 (open complex)。 53 解旋酶作用产生两条复制模板链解旋酶作用产生两条复制模板链 激活引发酶激活引发酶DnaG蛋白蛋白 DnaB蛋白与引发酶结合，形成引发体蛋白与引发酶结合，形成引发体 使一条使一条DNA链围绕着另一条旋转，消除解旋链围绕着另一条旋转，消除解旋

13、 产生的张力。产生的张力。 促旋酶促旋酶 SSB蛋白蛋白 HU蛋白蛋白 稳定解旋后的单链稳定解旋后的单链DNA构象，有助于解旋。构象，有助于解旋。 DNA结合蛋白，对复制起促进作用。结合蛋白，对复制起促进作用。 HU蛋白能够使蛋白能够使DNA发生折叠。发生折叠。 E.coli 中中DnaB结合引发酶结合引发酶DnaG，催化合成，催化合成RNA引引 物，其序列始于物，其序列始于pppAG，模板链序列，模板链序列3 -GTC-5 ， 引物长度一般引物长度一般1112个碱基。个碱基。 引物是由引物酶或引发体中引物酶催化合成的短链引物是由引物酶或引发体中引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。 DNA聚

14、合酶在引物聚合酶在引物RNA分子中分子中3 末端末端OH为起点开始与下一脱氧为起点开始与下一脱氧 核苷酸进行连接的。核苷酸进行连接的。 Dna A Dna B、 Dna C DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 引物引物 酶酶 SSB 3 5 3 5 DNA聚合酶聚合酶I负责切除负责切除RNA引物引物 DNA聚合酶聚合酶II 可利用损伤尚未修复的可利用损伤尚未修复的DNA链链 作为模板合成作为模板合成DNA，但不能修，但不能修 复损伤复损伤 DNA聚合酶聚合酶III负责合成负责合成DNA 全酶结构包括：全酶结构包括： 2个核心酶个核心酶 1个个 -复合物复合物 （ 、 、 、 、 、 6种亚基）种亚基）

15、 可滑动的可滑动的DNA夹子夹子 （含（含1对对 -亚基）亚基） 核心酶核心酶 -亚基亚基 柔性连接区柔性连接区 -复合物复合物 （夹子加载者）（夹子加载者） 可滑动的可滑动的 DNA夹子夹子 亚基（亚基（130 000）主要）主要 功能是合成功能是合成DNA 亚基具有亚基具有35 外切酶外切酶 活性（校正功能）活性（校正功能） 亚基可增强其活性亚基可增强其活性 亚基可能起组装作用亚基可能起组装作用 2个个 -亚基分别和亚基分别和1个核心酶相互作用，其柔性连接个核心酶相互作用，其柔性连接 区可以确保在复制叉区可以确保在复制叉1个全酶分子的个全酶分子的2个核心酶能够个核心酶能够 相对独立运动，分

16、别负责合成前导链和后随链。相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链。 功能：功能： -复合物是复合物是DNA夹子加载蛋白，负责将可夹子加载蛋白，负责将可 沿沿DNA链滑动的一对链滑动的一对 -亚基（亚基（DNA夹子）加载于夹子）加载于 DNA，使，使DNA聚合酶聚合酶具有持续合成能力。具有持续合成能力。 -复合物由复合物由6种亚基组成：种亚基组成： 、 、 、 、 、 DNA聚合酶聚合酶I有有3个酶促个酶促 活性结构域：活性结构域： 53 外切酶外切酶：去除：去除RNA引物引物 35 外切酶外切酶：起校正作用：起校正作用 DNA聚合酶活性聚合酶活性：切除引物，：切除引物， 对复制中的错误进行校

17、读，填对复制中的错误进行校读，填 补两个冈崎片段之间的缺口补两个冈崎片段之间的缺口 323个氨基酸个氨基酸 小片段小片段 5核酸外切酶活性核酸外切酶活性 大片段：大片段：Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸 DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 N 端端C 端端 枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶 DNA-pol I 聚合反应的特点：聚合反应的特点：(1) 以单链以单链DNA为模板为模板 (2) 引物提供引物提供3 -OH (3) 以以dNTP为原料为原料 (4) 聚合方向为聚合方向为5 3 复制的延长指在复制的延长指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dN

18、MP 的方式逐个加入引物或延长中的子链的的方式逐个加入引物或延长中的子链的3 端，其化端，其化 学本质是磷酸二酯键的不断生成学本质是磷酸二酯键的不断生成 5 3 5 dATP dGTP dTTP dCTP dTTP dGTPdATP dCTP OH 3 3DNA-pol 5 3 O P G O P A 模 板 链 C T A 3 5 引物 3 3 5 5 OH O P G O P A O OH T P 模 板 链 C T A 3 5 引物 3 3 3 5 5 5 P O OH T PP 3 5 Tus蛋白具有反解旋酶蛋白具有反解旋酶 (contra-helicase)活性，活性， 识别并结合识

19、别并结合ter序列中共有序列，阻止序列中共有序列，阻止Dna B蛋蛋 白的解旋作用，从而抑制复制叉前进。白的解旋作用，从而抑制复制叉前进。 Tus蛋白除了使复制叉停止运动以外，还可能造蛋白除了使复制叉停止运动以外，还可能造 成复制体解体。成复制体解体。 在复制叉汇合点两侧约在复制叉汇合点两侧约100kb处各有一个终止处各有一个终止 区（区（ter D/A和和ter C/B）。）。 当当oriC处于半甲基化状态时，处于半甲基化状态时，SeqA蛋白迅速结合半蛋白迅速结合半 甲基化的甲基化的GATC，阻止，阻止Dam甲基化酶与之结合，使甲基化酶与之结合，使 复制起点不能被完全甲基化，同时阻止复制起点

20、不能被完全甲基化，同时阻止DnaA蛋白蛋白 结合结合oriC。 oriC的的GATC被完全甲基化，被完全甲基化，DnaA蛋白就能与之结蛋白就能与之结 合，开始新的一轮复制。合，开始新的一轮复制。 E.coli复制起点复制起点oriC含有含有11个拷贝个拷贝GATC，这一回文，这一回文 序列中的序列中的A是是Dam甲基化酶的靶位点。甲基化酶的靶位点。 在复制过程中，在复制过程中，DNA每复制每复制10bp，复制叉前方的，复制叉前方的 模板模板DNA双螺旋就要绕其长轴旋转一周，产生正超双螺旋就要绕其长轴旋转一周，产生正超 螺旋。螺旋。 拓扑异构酶是一种可逆的核酸酶。它们可共价结合拓扑异构酶是一种可

21、逆的核酸酶。它们可共价结合 DNA分子上的磷酸基团，切断磷酸二酯键。分子上的磷酸基团，切断磷酸二酯键。 消除正超螺旋，使复制叉能够顺利前进。消除正超螺旋，使复制叉能够顺利前进。 维持维持E.coli、噬菌体和质粒、噬菌体和质粒DNA复制起始模板复制起始模板 DNA负超螺旋状态。负超螺旋状态。 环形染色体复制后产生的两个子染色体连环体环形染色体复制后产生的两个子染色体连环体 解连环。解连环。 E.coIi的的Topo I只作只作 用于负超螺旋用于负超螺旋DNA， 消除负超螺旋。消除负超螺旋。 Topo I E.coli的的Topo II 将前方产生的正将前方产生的正 超螺旋转变为负超螺旋转变为负

22、 超螺旋。超螺旋。 E.coli的的Topo IV功能功能 是将复制产生的两个是将复制产生的两个 子染色体从连环体中子染色体从连环体中 分离出来，催化连环分离出来，催化连环 和去连环过程和去连环过程 。 5 5 5 RNA酶酶 OHP 5 DNA-pol dNTP 5 5 P ATP ADP+Pi 5 5 DNA连接酶连接酶 连接连接DNA链链3 -OH末端和相邻末端和相邻DNA链链5 -P末端，使二者生成磷酸末端，使二者生成磷酸 二酯键，从而把两段相邻的二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。 DNA连接酶连接酶 DNA连接酶在连接酶在DNA的复制、损伤重组

23、的复制、损伤重组中均起中均起缝合缺口缝合缺口作用。作用。 是重要的是重要的工具酶工具酶之一。之一。 5 3 O OPO- HO O- 5 3 5 3 5 3 O OPO O- DNA连接酶连接酶 ATP ADP 真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进 速度慢等；速度慢等； DNA复制从引发进入延伸阶段发生复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶聚合酶 / 转换；转换； 切除冈崎片段切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶引物的是核酸酶RNAse HI和和 FEN1等。等。 真核生物与原核生物真核生物与原核生物DNA复制的差异：复制的差异： A家族与大肠杆菌家族与

24、大肠杆菌Pol同源，包括同源，包括Pol 和和Pol B家族与大肠杆菌家族与大肠杆菌Pol 同源，包括同源，包括Pol 、 、 和和 C家族与大肠杆菌家族与大肠杆菌Pol 同源，仅在真菌中发现同源，仅在真菌中发现 X家族与大肠杆菌家族与大肠杆菌DNA聚合酶并无同源性，却与末聚合酶并无同源性，却与末 端转移酶同源，成员包括端转移酶同源，成员包括Pol 、 、 Y家族（家族（UmuC/DinB超家族），近年发现一个特殊超家族），近年发现一个特殊 的真核及原核的真核及原核DNA聚合酶家族，成员包括聚合酶家族，成员包括Pol 、 、 和和Rev1 Pol 负责合成引物负责合成引物 Pol 负责负责DN

25、A复制、核苷酸切除修复和碱基切除修复复制、核苷酸切除修复和碱基切除修复 Pol 的功能与的功能与Pol 相似（其确切功能尚待定）相似（其确切功能尚待定） Pol 可能和碱基切除修复有关可能和碱基切除修复有关 Pol 负责线粒体负责线粒体DNA复制和损伤修复复制和损伤修复 蛋白质蛋白质功功 能能 RPA单链单链DNA结合蛋白，激活结合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易结合聚合酶，使解旋酶容易结合DNA PCNA激活激活DNA聚合酶和聚合酶和RFC的的ATPase活性活性 RFC 有依赖有依赖DNA的的ATPase活性，结合于引物活性，结合于引物-模板链，激活模板链，激活DNA聚合聚合 酶，促使

26、酶，促使PCNA结合于引物结合于引物-模板链模板链 Pol /引发酶引发酶合成合成RNA-DNA引物引物 Pol / DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复 FEN1核酸酶，切除核酸酶，切除RNA引物引物 RNAse HI核酸酶，切除核酸酶，切除RNA引物引物 DNA连接酶连接酶I连接冈崎片段连接冈崎片段 DNA解旋酶解旋酶DNA双螺旋解链，参与组装引发体双螺旋解链，参与组装引发体 Tol I和和Tol II 拓扑异构酶，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉拓扑异构酶，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉 前方产生的正超螺旋前方产生的正超螺旋

27、 真核真核DNA复制叉主要蛋白质的类型和功能与原核基本相似复制叉主要蛋白质的类型和功能与原核基本相似 DNA聚合酶聚合酶 (Pol )分子含有分子含有4个亚基：个亚基： p180：催化亚基：催化亚基 p48：具有引发酶活性：具有引发酶活性 p58：p48的稳定性和活性所必需的的稳定性和活性所必需的 p70：与组装引发体有关：与组装引发体有关 功能：功能：合成合成RNA引物引物 反应过程：反应过程：首先，合成首先，合成RNA引物；引物； 其次，利用其次，利用DNA聚合酶活性将引物延伸，聚合酶活性将引物延伸， 产生起始产生起始DNA (initiator DNA, iDNA) 短序列，形成短序列，

28、形成RNA-DNA引物；引物； 最后，最后，Pol /引发酶脱离模板链引发酶脱离模板链DNA，发生，发生 DNA聚合酶转换聚合酶转换 (switch)。 调节：调节：磷酸化的调节作用磷酸化的调节作用 结构：结构： p70、p34和和p11组成异源三聚体组成异源三聚体 功能：功能：结合单链结合单链DNA 促使双螺旋促使双螺旋DNA解旋解旋 激活激活Pol /引发酶活性引发酶活性 为为Pol 依赖复制因子依赖复制因子C（RFC）和增殖）和增殖 细胞核抗原（细胞核抗原（PCNA）合成）合成DNA所必需所必需 RPA三聚体与三聚体与SV40 T抗原结合，组装引发体抗原结合，组装引发体 复合物所必需复合

29、物所必需 RPA参与参与DNA重组和修复重组和修复 复制蛋白复制蛋白A (replication protein A, RPA) 功能：功能：p140 结合结合PCNA p40、p37和和p36组成稳定的核心复合物，具有组成稳定的核心复合物，具有 依赖依赖DNA的的ATPase活性活性 p38可能在可能在p140和核心复合物之间起连接作用和核心复合物之间起连接作用 复制因子复制因子C (replication factor C, RFC) 结构：结构：有有p140，p40，p38，p37、p36，5个亚基个亚基 促使可滑动的促使可滑动的DNA夹子夹子PCNA结合于引物结合于引物-模板模板 链，

30、是链，是Pol 在模板在模板DNA链上组装并形成具有持链上组装并形成具有持 续合成能力全酶所必需的。续合成能力全酶所必需的。 RFC的功能：的功能： 功能功能： PCNA是是Pol 的进行性因子，使的进行性因子，使Pol 获得持续合成能力。获得持续合成能力。 PCNA是协调是协调DNA复制、损伤修复、表观遗传和细胞周期复制、损伤修复、表观遗传和细胞周期 调控的核心因子。调控的核心因子。 PCNA水平是检测细胞增殖的重要指标。水平是检测细胞增殖的重要指标。 PCNA能激活能激活Pol 。 增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen, PC

31、NA) 结构结构：同源三聚体，可形成闭合环形的可滑动同源三聚体，可形成闭合环形的可滑动DNA夹子。夹子。 p125：催化亚基，具有：催化亚基，具有DNA聚合酶活性和聚合酶活性和35 核酸核酸 外切酶活性，其外切酶活性，其N端区与端区与PCNA相互作用相互作用 p50：辅助：辅助PCNA激活激活p125 结构结构：DNA聚合酶聚合酶 分子是异源二聚体（分子是异源二聚体（p125和和p50） 功能功能：Pol 合成前导链和后随链合成前导链和后随链 FEN1 (flap endonuclease 1)具有核酸内切酶和具有核酸内切酶和53 核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。 FEN1参与去除冈崎片段参与

32、去除冈崎片段5 端的端的RNA引物。引物。 RNAse HI是核酸内切酶，参与冈崎片段成熟时切是核酸内切酶，参与冈崎片段成熟时切 除除5 端端RNA引物，底物引物，底物RNA连接在连接在DNA链的链的5 端，端， 切割后在切割后在DNA链的链的5 端残留一个核糖核苷酸，这个端残留一个核糖核苷酸，这个 核苷酸再被核苷酸再被FEN1切除。切除。 DNA复制需要复制需要DNA解旋酶打开解旋酶打开DNA双螺旋，双螺旋， 使复制模板链得以暴露。使复制模板链得以暴露。 真核真核DNA复制叉模型复制叉模型 每个复制叉有每个复制叉有1个个Pol /引发酶复合物和引发酶复合物和2个个Pol 复合物复合物 Pol

33、 /引发酶引发酶合成合成RNA-DNA引物引物 Pol 合成前导链和后随链合成前导链和后随链 RFC识别引物识别引物iDNA的的3 端并驱除端并驱除Pol /引发酶引发酶 PCNA结合结合DNA并引入并引入Pol RNAse H I/FEN1切除冈崎片段切除冈崎片段5 端的端的RNA引物引物 Pol （或（或Pol ）填补冈崎片段之间的空隙填补冈崎片段之间的空隙 DNA连接酶连接酶I封口封口 RPA稳定解旋后的单链稳定解旋后的单链DNA 解旋酶解旋酶复制叉的形成和移动必不可少复制叉的形成和移动必不可少 拓扑异构酶拓扑异构酶释放复制叉前进时产生的扭曲应力释放复制叉前进时产生的扭曲应力 识别染色体

34、识别染色体DNA复制起点和复制起点和DNA局部解旋后，局部解旋后， Pol /引发酶复合物结合于复制起点，这一步叫做引发酶复合物结合于复制起点，这一步叫做 引发体组装引发体组装。 引发体组装包括引发体组装包括DNA解旋酶与解旋酶与Pol /引发酶相互作用。引发酶相互作用。 解旋酶与解旋酶与Pol /引发酶相互作用组装引发酶相互作用组装引发体引发体 在前导链：出现在引发后期在前导链：出现在引发后期 在后随链：发生于每个冈崎片段合成之际在后随链：发生于每个冈崎片段合成之际 发生发生DNA聚合酶聚合酶 / 转换的原因是转换的原因是Pol 不具备持不具备持 续合成能力续合成能力 DNA聚合酶聚合酶 /

35、 转换的关键蛋白是转换的关键蛋白是RFC 首先首先RNAse HI利用核酸内切酶活性切割连接在冈崎片段利用核酸内切酶活性切割连接在冈崎片段 5 端的端的RNA片段，在片段，在RNA-DNA引物连接点旁留下引物连接点旁留下1个核个核 糖核苷酸；糖核苷酸； 然后然后FEN1利用利用53 核酸外切酶活性切除这最后一个核核酸外切酶活性切除这最后一个核 糖核苷酸。糖核苷酸。 解旋酶解旋酶Dna2具有依赖具有依赖DNA的的ATPase和和35 解旋酶活性，解旋酶活性， 其解旋作用可以使前一个冈崎片段的其解旋作用可以使前一个冈崎片段的5 端引物形成端引物形成“盖子盖子” 结构，再由结构，再由FEN1的内切酶

36、活性切除引物。的内切酶活性切除引物。 依赖依赖RNAse H I/FEN1切除方式：切除方式： 依赖依赖Dna2/FEN1切除方式：切除方式： RNAse HI/FEN1Dna2/FEN1 真核所有染色体真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞周期复制仅仅出现在细胞周期 的的S期，而且只能复制一次。期，而且只能复制一次。 真核细胞真核细胞DNA复制的起始分两步进行，即复制基复制的起始分两步进行，即复制基 因的选择和复制起点的激活。因的选择和复制起点的激活。 复制基因复制基因 (replicator)是指是指DNA复制起始所必需的复制起始所必需的 全部全部DNA序列。序列。 复制基因的选择出现于复

37、制基因的选择出现于G1期，基因组的每个复制期，基因组的每个复制 基因位点均组装前复制复合物基因位点均组装前复制复合物 (pre-replicative complex, pre-RC)。 复制起点的激活出现于细胞进入复制起点的激活出现于细胞进入S期以后，这一阶期以后，这一阶 段将激活段将激活pre-RC，募集若干复制基因结合蛋白和，募集若干复制基因结合蛋白和 DNA聚合酶，并起始聚合酶，并起始DNA解旋。解旋。 在原核细胞中，复制基因的识别与在原核细胞中，复制基因的识别与DNA解旋、募集解旋、募集 DNA聚合酶偶联进行。而在真核细胞中，这两个阶聚合酶偶联进行。而在真核细胞中，这两个阶 段相分离

38、可以确保每个染色体在每个细胞周期中仅段相分离可以确保每个染色体在每个细胞周期中仅 复制一次。复制一次。 ORC至少募集两种解旋酶加载至少募集两种解旋酶加载 蛋白蛋白Cdc6和和Cdt1。 复制起点识别复合物复制起点识别复合物 (origin recognition complex, ORC)识识 别并结合复制基因。别并结合复制基因。 三种蛋白质一起募集真核细胞三种蛋白质一起募集真核细胞 解旋酶解旋酶Mcm2-7。 复制基因复制基因 pre-RC磷酸化导致在复制起点组装其他复制因子磷酸化导致在复制起点组装其他复制因子 并起始复制，复制因子包括并起始复制，复制因子包括3种种DNA聚合酶。聚合酶。

39、DNA聚合酶在复制起点按一定顺序组装：聚合酶在复制起点按一定顺序组装： 首先首先Pol 和和Pol 结合，然后是结合，然后是Pol /引发酶。引发酶。 在在S期，期，pre-RC被蛋白激酶（被蛋白激酶（Ddk和和Cdk）磷酸化，）磷酸化， 从而被激活。从而被激活。 Cdk功能：功能： 1) 激活激活pre-RC，以起始，以起始DNA复制；复制； 2) 抑制形成新的抑制形成新的pre-RC。 真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶 (cyclin-dependent kinases, CDK)严格控制严格控制pre- RC的形成和激活。的形成和激活。 在每个

40、细胞周期过程中，仅有一次机会形成在每个细胞周期过程中，仅有一次机会形成pre- RC，也仅有一次机会激活，也仅有一次机会激活pre-RC。 pre-RC在被激活后即解体，所暴露的复制基因可在被激活后即解体，所暴露的复制基因可 形成新的形成新的pre-RC并迅速结合并迅速结合ORC。但在。但在S、G2和和 M期，高活性的期，高活性的Cdk抑制抑制pre-RC的其他组分结合的其他组分结合 ORC。只有当染色体分离和细胞分裂完成时，。只有当染色体分离和细胞分裂完成时， Cdk的活性消失，新的的活性消失，新的pre-RC才能形成。才能形成。 前导链产生完整前导链产生完整 的子染色单体。的子染色单体。

41、后随链后随链3 端留下端留下 缩短的未复制的缩短的未复制的 ssDNA区。区。 染色体染色体DNA的半保留复制的半保留复制 3 5 5 5 3 3 染色体染色体DNA复制的复制的5 -末端丢失问题末端丢失问题 端粒端粒 (telomeres)由富含由富含TG的重复序列组成。的重复序列组成。 人的端粒重复序列为人的端粒重复序列为5 -TTAGGG-3 。 这些重复序列多为双链，但每个染色体的这些重复序列多为双链，但每个染色体的3 端比端比5 端长，形成单链端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构可解决染。这一特殊结构可解决染 色体末端复制问题。色体末端复制问题。 高度重复的短序列串联而成，高度重复

42、的短序列串联而成，3 端有单链突出末端端有单链突出末端 端粒上结合有多种蛋白质端粒上结合有多种蛋白质 进化上高度保守进化上高度保守 (TTGGGG)nTTGGGGTTGGGGTTG 3 (AACCCC)nAACCCCAACCCCAAC 5 5 蛋白质蛋白质B (TTGGGG)n 蛋白质蛋白质A 四膜虫：四膜虫： TTGGGG 拟南芥：拟南芥： TTTAGGG 哺乳动物：哺乳动物： TTAGGG 端粒酶端粒酶 (telomerase)是一种核糖核蛋白是一种核糖核蛋白 (RNP)，由，由 RNA和蛋白质组成。和蛋白质组成。 端粒酶以自己的端粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体的组分作为模板，以

43、染色体的3 端端ssDNA（后随链模板）为引物，将端粒序列添加（后随链模板）为引物，将端粒序列添加 于染色体的于染色体的3 端。这些新合成的端。这些新合成的DNA为单链。为单链。 端粒酶的爬行模型端粒酶的爬行模型 端粒端粒 染色体染色体DNA 端粒端粒 端粒是体细胞的端粒是体细胞的“生命时钟生命时钟” 高等真核生物高等真核生物正常体细胞正常体细胞中端粒酶活性被抑制。中端粒酶活性被抑制。 而在而在生殖细胞生殖细胞、胚胎细胞胚胎细胞中则表现出端粒酶活性。中则表现出端粒酶活性。 正常体细胞正常体细胞 多数多数肿瘤细胞肿瘤细胞也表现出端粒酶活性也表现出端粒酶活性 肿瘤部位肿瘤部位/类型类型 肿瘤组织（

44、肿瘤组织（%） 肺肺 肾肾 乳腺乳腺 结肠结肠 前列腺前列腺 白血病白血病 神经母细胞瘤神经母细胞瘤 109/136（80.1%） 40/55（72.7%） 19/24（79.6%） 22/23（95.6%） 23/27（85.1%） 21/23（91.3%） 94/100（94%） DNA聚合酶聚合酶：催化合成：催化合成DNA DNA解旋酶解旋酶 (helicase)：解开：解开DNA双螺旋，暴露双螺旋，暴露 复制模板链复制模板链 引发酶引发酶：引发，即合成：引发，即合成RNA引物，利用引物引物，利用引物3 -OH 开始延伸开始延伸 DNA连接酶连接酶：连结冈崎片段：连结冈崎片段 其他酶和蛋

45、白因子其他酶和蛋白因子 如：起稳定作用的单链如：起稳定作用的单链DNA结合蛋白结合蛋白 (SSB)和改变和改变DNA超超 螺旋状态的螺旋状态的DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 (topoisomerase)等等 DNA聚合酶的合成前误差控制聚合酶的合成前误差控制 (presynthetic error control)和校正控制和校正控制 (proofreading control)功能。功能。 细胞修复系统是细胞修复系统是DNA复制高度忠实性的重要因素。复制高度忠实性的重要因素。 复制起始利用引物也是确保复制起始利用引物也是确保DNA复制忠实性的重要复制忠实性的重要 机制之一。机制之一。 一个起点

46、，两个复制叉，双向复制。一个起点，两个复制叉，双向复制。 两个起点，两个生长点，单向复制。两个起点，两个生长点，单向复制。 一个起点，一个复制叉，单向复制。一个起点，一个复制叉，单向复制。 DNA链的合成链的合成3种方式：种方式： 线粒体线粒体DNA的的D环环 (D-loop)复制复制 噬菌体的滚环噬菌体的滚环 (rolling circle)复制复制 线粒体线粒体DNA分子特点：分子特点： 环形、双螺旋环形、双螺旋DNA分子分子 两条链一条为重链（两条链一条为重链（H链），另一条为轻链（链），另一条为轻链（L链）链） dNTP DNA-pol 有特异的复制起点；有特异的复制起点； 环形线粒体

47、环形线粒体DNA两条链（两条链（H和和L）的复制不同步）的复制不同步D 环或取代环环或取代环 (displacement loop)：线粒体：线粒体DNA复制复制 开始以开始以H链作为模板合成新的链作为模板合成新的L链，取代原来的链，取代原来的L 链并和链并和H链互补，而原来的链互补，而原来的L链则保持单链状态，链则保持单链状态， 形成类似英文字母形成类似英文字母D的区域；的区域； 两条链具有两条链具有不同的复制起点不同的复制起点和相反的合成方向；和相反的合成方向； 线粒体线粒体DNA复制也需要复制也需要RNA引物。引物。 E.coli 噬菌体噬菌体DNA的分子结构特点：的分子结构特点： 环形

48、双螺旋环形双螺旋DNA分子分子 一条为模板链，另一条为非模板链一条为模板链，另一条为非模板链 噬菌体噬菌体DNA复制特点：复制特点： 仅以一条链作为模板合成若干环形仅以一条链作为模板合成若干环形DNA分子拷贝分子拷贝 噬菌体噬菌体DNA复制的方式是滚环复制复制的方式是滚环复制 噬菌体噬菌体DNA复制首先由它自己编码的复制首先由它自己编码的A蛋白在蛋白在 非模板链上造成缺口，再以所产生的游离非模板链上造成缺口，再以所产生的游离3 端端 羟基作为引物（不需羟基作为引物（不需RNA引物），并在宿主细引物），并在宿主细 胞的胞的DNA聚合酶、解旋酶和聚合酶、解旋酶和SSB蛋白等作用下蛋白等作用下 合成

49、新链，只有一个复制叉，新链和模板链互合成新链，只有一个复制叉，新链和模板链互 补并取代了原来的非模板链。这种复制方式称补并取代了原来的非模板链。这种复制方式称 为滚环复制为滚环复制 。 3 -OH 5 -P 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 3 3 5 双螺旋双螺旋DNA在复制起点解链不一定导致两条链在复制起点解链不一定导致两条链 同时复制，也可能利用一条链作为模板起始同时复制，也可能利用一条链作为模板起始 DNA合成。合成。 双螺旋双螺旋DNA的两条的两条DNA链的复制起点也可能链的复制起点也可能 处于不同的位置。处于不同的位置。 滚环复制和滚环复制和D环不对称复制的存在说明：环不对称

50、复制的存在说明： RNA肿瘤病毒肿瘤病毒 DNA原病毒（或前病毒）原病毒（或前病毒） RNA肿瘤病毒肿瘤病毒 Temin等提出，原病毒等提出，原病毒 (provirus)DNA是是RNA肿肿 瘤病毒在复制过程中的中间物。瘤病毒在复制过程中的中间物。 DNA 中间模板分子中间模板分子 (mRNA) 蛋白质蛋白质 反转录酶的发现发展了中心法则反转录酶的发现发展了中心法则 反转录病毒反转录病毒 (retroviruses)：RNA病毒，病毒， 含有反转录酶含有反转录酶 反转录：在反转录酶的作用下以反转录：在反转录酶的作用下以RNA为模板合成为模板合成 DNA的过程。的过程。 反转录酶有反转录酶有3种

51、酶的活性：种酶的活性： RNA指导的指导的DNA聚合酶活性；聚合酶活性； DNA指导的指导的DNA聚合酶活性；聚合酶活性； RNAse H的活性是指它能够从的活性是指它能够从53 和和35 两两 个方向水解个方向水解DNA-RNA杂合分子中的杂合分子中的RNA。 RNA 模板模板 逆转录酶逆转录酶 DNA-RNA 杂杂 化双链化双链 逆转录酶或逆转录酶或 DNA聚合酶聚合酶 双链双链DNA 逆转录酶或逆转录酶或RNase H 单链单链DNA 被水解的被水解的RNA 原病毒或前病毒：存在于真核染色体中和反转原病毒或前病毒：存在于真核染色体中和反转 录病毒录病毒RNA基因组相对应的双链基因组相对应

52、的双链DNA序列。序列。 gag基因编码几种病毒核心蛋白（衣壳蛋白）基因编码几种病毒核心蛋白（衣壳蛋白）; pol基因编码基因编码3种酶：反转录酶、蛋白酶和整合酶种酶：反转录酶、蛋白酶和整合酶; env基因编码插入病毒外膜磷脂双层中的糖蛋白。基因编码插入病毒外膜磷脂双层中的糖蛋白。 具有自我复制能力的反转录病毒基因组含有具有自我复制能力的反转录病毒基因组含有3个基因个基因 直接翻译产生多蛋白直接翻译产生多蛋白Gag和和Gag-Pol。 含有包装信号，因此构成完整的病毒基因组。含有包装信号，因此构成完整的病毒基因组。 大约一半初级转录产物经过剪接加工形成大约一半初级转录产物经过剪接加工形成 ga

53、g-pol mRNA和和env mRNA。 初级转录产物多蛋白初级转录产物多蛋白Gag-Pol，经过蛋白酶水解，经过蛋白酶水解， 可产生反转录酶、蛋白酶和整合酶。可产生反转录酶、蛋白酶和整合酶。 多蛋白多蛋白Gag经过加工，生成经过加工，生成4种病毒衣壳蛋白。种病毒衣壳蛋白。 env基因编码的基因编码的Env蛋白，经过加工以后插入病毒外蛋白，经过加工以后插入病毒外 膜磷脂双层。膜磷脂双层。 这些病毒蛋白和病毒这些病毒蛋白和病毒RNA基因组可以迅速组装成许基因组可以迅速组装成许 多新的反转录病毒颗粒。多新的反转录病毒颗粒。 碱基开环和糖苷键断裂引起碱基丢失碱基开环和糖苷键断裂引起碱基丢失 辐射或

54、氧化损伤等引起碱基改变辐射或氧化损伤等引起碱基改变 化学因素可引起核苷酸插入或缺失化学因素可引起核苷酸插入或缺失 辐射和化学损伤可引起辐射和化学损伤可引起DNA链断裂链断裂 物理和化学因素可引起物理和化学因素可引起DNA链间或链内交联链间或链内交联 DNA损伤的结果：损伤的结果： 其一，导致复制或转录障碍其一，导致复制或转录障碍 其二，导致复制后产生基因突变其二，导致复制后产生基因突变 修复系统的类型修复系统的类型损伤损伤酶酶 错配修复错配修复复制差错复制差错 E.coli：MutS, MutL, MutH 人：人：MSH, MLH, PMS 直接修复直接修复嘧啶二聚体嘧啶二聚体E.coli：

55、DNA光裂合酶等光裂合酶等 碱基切除修复碱基切除修复碱基损伤碱基损伤DNA糖苷酶（即糖苷酶（即DNA糖基水解酶）糖基水解酶） 核苷酸切除修复核苷酸切除修复 嘧啶二聚体，嘧啶二聚体， 碱基烷基化碱基烷基化 E.coli：UvrA, UvrB, UvrC, UvrD 人：人：XPC, XPA, XPD, ERCCI-XPF, XPG 重组修复重组修复双链断裂双链断裂E.coli：RecA和和RecBCD 跨损伤跨损伤DNA合成合成 嘧啶二聚体、嘧啶二聚体、 无嘌呤位点无嘌呤位点 DNA聚合酶（聚合酶（Y-家族），如家族），如E.coli： UmuC UV P H N RN CH3 O O H N

56、RN CH3 O O P H N RN CH3 O O N H RN CH3 O O TT聚合聚合 光修复酶光修复酶 (photolyase) 修复对象：修复对象：将将DNA中因紫外线照射而形成的嘧啶中因紫外线照射而形成的嘧啶 二聚体分解。二聚体分解。 机制：机制：细胞内光裂合酶细胞内光裂合酶 (photolyases)分子中生色分子中生色 基团次甲四氢叶酸吸收光子，并将基团次甲四氢叶酸吸收光子，并将FADH2 激活，生成的激发型激活，生成的激发型FADH2，再将电子转，再将电子转 移给嘧啶二聚体，使其还原。移给嘧啶二聚体，使其还原。 分布：分布：分布广泛，除哺乳动物外均有之。分布广泛，除哺乳

57、动物外均有之。 直接修复：利用修复酶简单地逆转直接修复：利用修复酶简单地逆转DNA损伤损伤 光复活修复系统光复活修复系统 修复对象：修复对象：DNA中被甲基化修饰的鸟嘌呤（中被甲基化修饰的鸟嘌呤（O6-甲甲 基鸟嘌呤，与基鸟嘌呤，与T配对）。配对）。 机制：机制：将甲基转移到酶蛋白活性中心的将甲基转移到酶蛋白活性中心的Cys残基侧残基侧 链上，使鸟嘌呤复原，避免发生突变。链上，使鸟嘌呤复原，避免发生突变。 特点：特点：DNA甲基转移酶一旦接受甲基就不再具有甲基转移酶一旦接受甲基就不再具有 催化活性催化活性 ，修复代价高昂，修复代价高昂 。 E.coli细胞中，细胞中，O6-甲基鸟嘌呤甲基鸟嘌呤

58、DNA甲基转移酶修复甲基转移酶修复 碱基切除修复碱基切除修复 (base excision repair, BER) 对象：对象：受损的碱基受损的碱基 修复系统：修复系统：糖苷酶糖苷酶 (glycosylases)识别、切除受损碱基，识别、切除受损碱基， 产生产生AP位点位点 (apurinic or apyrimidinic site)。 AP内切酶在内切酶在AP位点的位点的5 端切断磷酸二酯键。端切断磷酸二酯键。 AP外切酶再切割外切酶再切割AP位点的位点的3 端。端。 DNA聚合酶填补产生的缺口。聚合酶填补产生的缺口。 最后最后DNA连接酶连接。连接酶连接。 胞嘧啶脱氨基产生的尿嘧啶；胞

59、嘧啶脱氨基产生的尿嘧啶； 氧化的鸟嘌呤氧化的鸟嘌呤 (oxoG)； 脱氨基的腺嘌呤；脱氨基的腺嘌呤； 开环碱基；开环碱基； 碳原子之间双键变成单键的碱基等。碳原子之间双键变成单键的碱基等。 功能：利用功能：利用DNA糖苷酶切除糖苷酶切除DNA复制前复制前 未去除的损伤碱基。未去除的损伤碱基。 自动防故障自动防故障 (fail-safe)系统系统 DNA聚合酶和连接酶以未损伤的聚合酶和连接酶以未损伤的DNA链为模板修链为模板修 补缺口。补缺口。 核苷酸切除修复核苷酸切除修复 (nucleotide excision repair, NER) 系统识别系统识别DNA双螺旋形状的变形。双螺旋形状的变

60、形。 E.coli的的NER主要由主要由4种蛋白质组成：种蛋白质组成： UvrA识别识别DNA双螺旋结构变形双螺旋结构变形 UvrB负责解链，募集核酸内切酶负责解链，募集核酸内切酶UvrC UvrC在损伤部位的两侧切断在损伤部位的两侧切断DNA链链 UvrD去除这两个切点之间的去除这两个切点之间的DNA片段片段 DNA聚合酶聚合酶I和连接酶填补缺口和连接酶填补缺口 XPC蛋白负责发现蛋白负责发现DNA双螺旋中的变形双螺旋中的变形 XPA 和和XPD蛋白具有解旋酶活性蛋白具有解旋酶活性 核酸酶核酸酶ERCC1-XPF切割损伤部位切割损伤部位5 侧，侧， XPG切割切割3 侧侧 DNA聚合酶和连接