类病毒检测技术培训

1、二、类病毒种类 已知序列类病毒种类及其分类 The variants of viroid known sequence and their classification 中名 Chinese names 英名 English names 缩写 Abbrevia-tion 大小 Length (nt) 中央保守区 Central conserved 马铃薯纺锤块茎类病毒Potato spindle tuberPSTVd356-360PSTVd 柑桔裂皮类病毒Citrus exocortisCEVd370-375PSTVd 菊花矮化类病毒Chrysanthemum stuntCSVd354-356

2、PSTVd 番茄顶矮化类病毒Tomato apical stuntTASVd360-363PSTVd 番茄雄性株类病毒Tomato planta machoTPMVd360PSTVd 唇膏蔓蔷薇隐性类病毒Columnea latentCLVd370-372PSTVd 啤酒矮化类病毒Hop sturtHSVd297-303PSTVd 椰子死亡类病毒Coconut cadang-cadangCCCVd246-247CCCVd 椰子tinangaja类病毒Coconut tinangajaCTiVd254CCCVd 啤酒花隐潜类病毒Hop lalentHLVd256CCCVd 柑桔IV类病毒Citr

3、us IVCVdiV284CCCVd 苹果锈果类病毒Apple scar skinASSVd329-330ASSVd 葡萄黄斑类病毒1Grapevine yellow speckle 1GYSCd1366-368ASSVd 葡萄黄斑类病毒2Grapevine yellow speckle 2GYSCd2363ASSVd 澳洲葡萄类病毒Australian grapevineAGVd369ASSVd 柑桔硬叶类病毒Citrus bent leafCBLVd318ASSVd 梨疱溃疡类病毒Pear blister cankerPBCVd325ASSVd 鳄梨白斑类病毒Avocado sunblot

4、chASBVd245-250ASBVd 桃潜花叶类病毒Peach latent mosaicPLMVd336-337ASBVd 锦学苏类病毒Coleus blumei ICbVd1248CbVd1 类病毒结构示意图 The structure of viroid 马铃薯纺锤块茎类病毒热变性过程 Heat-denatured process diagram of PSTVd 三、类病毒结构 马铃薯纺锤块茎类病毒的五个功能区 The five functional domains of PSTVd 马铃薯类病毒中国分离株核苷酸序列 l 25 11 1 359 l1 CCTGCACGTC GACGA

5、TTGGA GCTC ACAGGA ACCACGAGTT TAGTTCCGAG l Sac P(25-11) l51 GAACCAACTG CGGTTCCAAG GGCTAAACAC CCTCGCCCCG AAGCAAAGAA l101 AGATAGAGAA AAAGCGGTTC TCGGGAGCTT CAGTTGTTTC CACCGGGTAG l151 TAGCCGAAGC GACAGCGCAA AGGGGGCGAG GGGTGGTCCT GCGGGCGCGA l201 GGAAGGACAC CCGAAGAAAG GAAGGGTGAA AACCCTGTTT CGGCGGGAAT l251 T

6、ACTCCTGTC GGCCGCTGGG CACTCCCCAC CGTCCTTATT GCCAGTTCGC l301 TCCAGGTTTC CCCGGGGATC CCTGAAGCGC TCCTCCGAGC CGCCTTCTTT 35 26 l351 TTTCTTTTCT GCTCAGGAGG TCAGGTGTGA ACGGGTACCC GATCTCTAGA l P(26-35) Kpn l401 GGATCCCCGG GTACCGAGCT CGAATTCGTA ATCATGGTCA TAGCTGTTTC l451 CTGTGTGAAA TTGTTATCCG CTCACAATTC CACACAA

7、CAT ACGAGCCGGA l501 AGCATAAAGT GTAAAGCCTG GGGTGCCTAA TGAGTGAGCT AACTCACATT l551 AATTGCGTTG CGCTCACTGC CCGCTTTCCA GTCGGGAAAC CTGTCGTGCC l601 AGCTGCATTA ATGAATCGGC CAACGCGCCG GGAGAGGCGG GTTGCGTATT l651 T l l PSTVd致病区的位置和结构。图解表示PSTVd-Intermediate的完整结构，包括左未端区（TL,1-46/315-359 ），致病区（47-73/286-314），中央保守区（7

8、4-120/240-285），可变区（121-148/212-239）和右未端 区（TR, 149-211）(Keese and symons, 1985),premelting(PM)区1-3（Steger等，1984）和二级发夹结构 1-111。下面为三个自然发生的PSTVd分离株系。水平箭头指出PM1和VM区域（Schnlzer等，1985），“星 号”表示中间株系和强、弱系序列差异。此图引自Owens et al (1996)。 TL Path 1(M) CGGAACUAAA CUCGUGGUUC CUGUGGUUCA CACCUGACCU CCUGAGCA GA AAAGAAAAAA

9、 2(M) CGGAACUAAA CUCGUGGUUC CUGUGGUUCA CACCUGACCU CCUGAGCA GA AAAGAAAAAA 3(M) CGGAACUAAA CUCGUGGUUC CUGUGGUUCA CACCUGACCU CCUGAGCA GA AAAGAAAAAA 4(I) CGGAACUAAA CUCGUGGUUC CUGUGGUUCA CACCUGACCU CCUGAGCA GA AAAGAAAAAA 5(S) CGGAACUAAA CUCGUGGUUC CUGUGGUUCA CACCUGACCU CCUGAGCA GA AAAGAAAAAA 6(S) CGGAAC

10、UAAA CUCGUGGUUC CUGUGGUUCA CACCUGACCU CCUGAGCA GA AAAGAAAAAA CCR 1(M) GAAGGCGGCU CGGAGGAGCG CUUCAGGGAU CCCCCGGGAA ACCUGGAGCG AACUGGCAAU 2(M) GAAGGCGGCU CGGAGGAGCG CUUCAGGGAU CCCCCGGGAA ACCUGGAGCG AACUGGCAAU 3(M) GAAGGCGGCU CGGAGGAGCG CUUCAGGGAU CCCCCGGGAA ACCUGGAGCG AACUGGCAAU 4(I) GAAGGCGGCU CGGAGG

11、AGCG CUUCAGGGAU CCCCCGGGAA ACCUGGAGCG AACUGGCAAAA 5(S) GAAGGCGGCU CGGAGGAGCG CUUCAGGGAU CCCCCGGGAA ACCUGGAGCG AACUGGCAAU 6(S) GAAGGCGGCU CGGAGGAGCG CUUCAGGGAU CCCCCGGGAA ACCUGGAGCG AACUGGCAAAA Var TR 1(M) AAGGACGGUG GGGAGUGCCC A GCGGCCGAC AGGAGUAAUU CCCGCCGAAA CAGGGUUUUC 2(M) AAGGACGGUG GGGAGUGCCC A

12、 GCGGCCGAC AGGAGUAAUU CCCGCCGAAA CAGGGUUUUC 3(M) AAGGACGGUG GGGAGUGCCC A GCGGCCGAC AGGAGUAAUU CCCGCCGAAA CAGGGUUUUC 4(I) AAGGACGGUG GGGAGUGCCC A GCGGCCGAC AGGAGUAAUU CCCGCCGAAA CAGGGUUUUC 5(S) A GGACGGUG GGGAGUGCCC AUGCGGCCGAC AGGAGUAAUU CCCGCCGAAA CAGGGUUUUC 6(S) AAGGACGGUG GGGAGUGCCC A GCGGCCGAC A

13、GGAGUAAUU CCCGCCGAAA CAGGGUUUUC Var 1(M) ACCCUUCCUU UCUUCGGGUG UCCUUCCUCG CGCCCGCAGG ACCACCCCUC GCCCCCUUUG 2(M) ACCCUUCCUU UCUUCGGGUG UCCUUCCUCG CGCCCGCAGG ACCACCCCUC GCCCCCUUUG 3(M) ACCCUUCCUU UCUUCGGGUG UCCUUCCUCG CGCCCGCAGG ACCACCCCUC GCCCCCUUUG 4(I) ACCCUUCCUU UCUUCGGGUG UCCUUCCUCG CGCCCGCAGG AC

14、CACCCCUC GCCCCCUUUG 5(S) ACCCUUCCUU UCUUCGGGUG UCCUUCCUCG CGCCCGCAGG ACCACCCCUC G-CCCCUUUG 6(S) ACCCUUCCUU UCUUCGGGUG UCCUUCCUCG CGCCCGCAGG ACCACCCCUC GCCCCCUUUG CCR Path 1(M) CGGUGUCGCU UCGGCUACUA CCCGGUGGAA ACAACUGAAG CUCCCGAGAA CCGCUUUUUC 2(M) CGGUGUCGCU UCAGCUACUA CCCGGUGGAA ACAACUGAAG CUCCCGAGA

15、A CCGCUUUUUC 3(M) CGGUGUCGCU UCGGAUAUUA CCCGGUGGAA ACAACUGAAG CUCCCGAGAA CCGCUUUUUC 4(I) CGGUGUCGCU UCGGCUACUA CCCGGUGGAA ACAACUGAAG CUCCCGAGAA CCGCUUUUUC 5(S) CGGUGUCGCU UCGGCUACUA CCCGGUGGAA ACAACUGAAG CUCCCGAGAA CCGCUUUUUC 6(S) CGGUGUCGCU UCGACUACUA CCCGGUGGAA ACAACUGAAG CUCCCGAGAA CCGCUUUUUC TL

16、1(M) UCUAUCUUUC UUUGCUUCGG GGCGAGGGUG UUUAGCCCUU GGAACCGCAG UUGGUUCCU 2(M) UCUAUCUUUC UUUGCUUCGG GGCGAGGGUG UUUAGCCCUU GGAACCGCAG UUGGUUCCU 3(M) UCUAUCUUUC UUUGCUUCGG GGCGAGGGUG UUUAGCCCUU GGAACCGCAG UUGGUUCCU 4(I) UCUAUCUUAC -UUGCUUCGG GGCGAGGGUG UUUAGCCCUU GGAACCGCAG UUGGUUCCU 5(S) UCUAUCUUUA UUUG

17、CUUCGGC GGCGAGGGUG UUUAGCCCUU GGAACCGCAG UUGGUUCCU 6(S) UCUAUCUU -A UGUGCUUCAG GGCGAGGGUG UUUAGCCCUU GGAACCGCAG UUGGUUCCU PSTVdPSTVd中国分离株与已报道序列在一级结构上的差异中国分离株与已报道序列在一级结构上的差异 PSTVd强、弱系及中间株系的核苷酸序列差异比较 Comparison with mild strain from China in nucleotide sequence of the isolates of the mild, intermediat

18、e and severe strain of potato spindle tuber viroid(PSTVd)PSTVd分离株系 PSTVd isolates 类病毒核酸长度 Viroid-nucleotide Chain length 同中国弱株系相比核酸 差异 Differences from “the mild strain”of China in sequence 变化位置 Position of the changed nuoleotide Mild: PSTVd-WA(未例出) PSTVd-F(未例出) PSTVd-India PSTVd-WB 359 nt 358 nt 35

19、9 nt 359 nt UA UCUGA CA CU GA 309(致病区) 309(致病区) 255(中央保守区) 258(中央保守区) 253(中央保守区) PSTVd KF-6 mild type 359 ntNoneNone Severe: PSTVd-F-SL PSTVd S17-I-8 359 nt 359 nt Ainsertion Adeletion Uinsertion Cdeletion GA CA Udeletion C insertion UAA U deletion CA UG GA 48-49（致病区） 122(可变区) 140-141(可变区) 232 (可变区)

20、 254(中央保守守区) 310(致病区） 311（致病区） 320-321(左未端区) 120(中央保守区) 309（致病区） 310（致病区） 312（致病区） 319(左未端区) Intermediate: PSTVd-I-India 359 nt UAA UA Udeletion 120(中央保守区) 309(致病区) 311(致病区) 注：From Herold et al.(1992); From Owens et al.(1992); From Singh et al.(1993); From Gross et al.(1981); and From Gora-Sochacka

21、(1997). 四、类病毒鉴定 1、指示植物接种鉴定 1）鲁特格番茄 2）新莨菪 2、电泳 1）垂直双向丙烯酰胺电泳（2-D-PAGE） 2）往返丙烯酰胺电泳（R-PAGE） 3、反转录PCR（RT-PCR） 4、核酸斑点杂交（NASH） 往返丙烯酰胺电泳（R-PAGE）检测流程图 核酸提取 第一项电泳反向电泳 固定 银染色 显色 结果判读 PSTVd 上样量：8 g,1.6 g,0.32 g,64 ng, 13 ng,2.6 ng, 520 pg,104 pg 最低检出率：13ng 双向电泳检测双向电泳检测PSTVd PSTVd 检测结果：检测结果：样品含有PSTVd，箭头所指为类病毒核酸带

22、 RT-PCR检测类病毒流程 引物设计 扩增产物分析 （） 以cDN为模板 扩增 制备cDN第一链 （反转录） 样品核酸提取 检测结果：检测结果：PCR反应退火温度分别设定为55 和 57 ，在57 下特异性好，可用来检测 PSTVd 434bp 328bp 1 2 3 4 5 资料检索、收集 、样品采集 类病毒病原鉴定: 三种方法： （R-PAGE、 2-D-PAGE、 RT-PCR） 含PSTVd pGEM- 7Z质粒 利用HaeIII对重组 质粒进行酶切验证 鉴定结果：含 PSTVd 设计引物、对含 PSTVd的pGEM- 7Z质粒进行PCR 扩增 利用生物素biotin- 11-dUT

23、P代替dUTP 制备探针 进行核酸斑点 杂交反应 NBT/BCIP 化学颜色反应 Flu荧光素 发光反应 试剂盒组装生 产 应 用 核酸斑点杂交（）检测技术流程 探针制备 终止反应 预杂交 封闭孵育信号产生 杂交漂洗 点样尼龙膜的处理 500 ng 50 ng 5 ng 500 pg 50 pg 5 pg 1 2 3 4 200 pg 50 pg 200 pg 50 pg NASH方法检测方法检测PSTVd专化性专化性测试（颜色反应）测试（颜色反应） 结果显示：阳性样品有斑点，阴性样品不产生斑点。 反应专化性强。 n 核酸斑点杂交（）检测反应原理图 核酸斑点杂交（核酸斑点杂交（NASH）技术的

24、研究技术的研究 探针的制备 1、HaeHae单酶切含单酶切含PSTVdPSTVd单体的单体的pGEM-7ZpGEM-7Z质粒质粒 1 2 3 328bp Hae/7Z空 Hae/7Z-PSTVd (bp) 正向插入 反向插入 1 657 657 657 2 458 458 561* 3 434 434 458 4328* 369* 434 5289 320 * 289 6267 289 267 7174 267 174 8142 174 142 9102 142 125* 1080 102 102 11 80 80 结果显示： pGEM-7Z重组质粒含有PSTVd单体，且为正向插入 2、引物筛

25、选 n 根据已报导的PSTVd基因序列（Genebank登陆号 AY372400）设计两对引物对7Z质粒上的PSTVd单体目 的片段进行PCR扩增 n引物引物(Primer):片段大小为154 bp nP(c):5 CGA AGC CGA TGA TGGA ATA ACGTGG AGG ACT CG TGGA ATA ACG 3 与124-116同源 10 mM dNTP 2 l 引物(60 pM) 2 l 模板(P7z-PSTVd单体) 2 l DEPC H2O 80.5 l 10PCR buffer 10 l Taq酶(Promega公司) 2.5 l Total 100 l 94 5分钟 94 2分钟 40 1.5分钟 5个循环 72 2分钟 55 1.5分钟 72 2分钟 72 10分钟 PCR反应体系: 热循环程序: 5个循环 往返丙烯酰胺电泳（R-PAGE）检测流程图 核酸提取 第一项电泳反向电泳 固定 银染色 显色 结果判读 PS