血红蛋白的提取与分离I

1、一、一、基础知识基础知识蛋白质提取和分离原理蛋白质提取和分离原理 蛋白质提取与分离的依据蛋白质的物化理性质：蛋白质提取与分离的依据蛋白质的物化理性质： 形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、 亲和力等千差万别。亲和力等千差万别。 提取提取 分离分离 方法方法 凝胶色谱法凝胶色谱法 凝胶电泳法凝胶电泳法 1.1.凝胶色谱法凝胶色谱法 （1）原理：）原理： （2 2）材料）材料 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部

2、，路程长，流动慢。 多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 1.1.凝胶色谱法凝胶色谱法 （3）分离过程分离过程 混合物混合物 上上 柱柱 洗洗 脱脱 大分子流动快大分子流动快 小分子流动慢小分子流动慢 收收 集集 大分子大分子 收收 集集 小分子小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。促使蛋白质分子的差速流动。 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 如如H2CO3/NaHCO3，HC/NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等等 1.1.凝胶色谱法凝胶色谱法 （4）

3、缓冲溶液洗脱剂缓冲溶液洗脱剂 组成：组成： 配制：配制： 作用：作用： 调节酸和盐的用量，可配制不同调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。的缓冲液。 抵制外界酸碱对溶液抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持的干扰而保持 pH稳定。稳定。 2凝胶电泳法：凝胶电泳法： （1）原理：）原理： 不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同， 在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同， 导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质

4、分子运动速度的因素 在一定在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；下，使蛋白质基团带上正电或负电； 加入带负电荷多的加入带负电荷多的SDS，形成，形成“蛋白质蛋白质SDS复合复合 物物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 2凝胶电泳法：凝胶电泳法： （2）分离方法：）分离方法： （3）分离过程：）分离过程： 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 二、实验操作实验步骤二、实验操作实验步骤 样品处理样品处理 粗粗 分分 离离 纯纯 化化 纯度鉴定纯度鉴定 血液组成成分血液组成成分 1.洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞 2.

5、释放释放血红蛋白血红蛋白 3.分离分离血红蛋白血红蛋白 4.透析透析血红蛋白血红蛋白 血液组成成分血液组成成分 阅读思考：阅读思考： 1. 血液由血液由_和和_两部分组成。两部分组成。 2. 血细胞中血细胞中_细胞数量最多，细胞的含量细胞数量最多，细胞的含量 最高的化合物是最高的化合物是_。 3. 该化合物是由该化合物是由 _和和_构构 成的，其中每个亚基中都含有一个能与成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和和 CO2结合的结合的_基团。基团。 血浆血浆血细胞血细胞 红细胞红细胞 血红蛋白血红蛋白 2条条-肽链肽链2条条-肽链肽链 亚铁血红素亚铁血红素 1.洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞 阅读

6、思考：阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的目的是什么？ 洗涤过程：洗涤过程： 血液血液 100mL 3g柠檬酸钠柠檬酸钠 低速离心低速离心 2 min 红细胞红细胞 血血 浆浆 吸出血浆吸出血浆 红细胞红细胞 5倍体积生理盐水倍体积生理盐水 搅拌搅拌10min 重复洗涤重复洗涤3次，直至上清液没有黄色次，直至上清液没有黄色 2.释放释放血红蛋白血红蛋白 阅读思考：阅读思考： 1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了 哪些物质？哪些物质？ 2. 为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速释放过程，采取了什么措施？ 目的分析：目的分析： 1. 蒸馏水

7、的作用是蒸馏水的作用是_。 2. 加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。 3. 充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。 使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂 3.分离分离血红蛋白血红蛋白 分离过程分离过程 红细胞红细胞 混合液混合液 高速离心高速离心 10min 离心管离心管 滤纸滤纸 过滤过滤 脂类物质脂类物质 烧杯烧杯 4.透析透析血红蛋白血红蛋白 20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液 1mL 1mL 粗分离粗分离凝胶色谱操作凝胶色谱操作 1.凝胶色谱柱的制作：凝胶色谱柱的制作： 2.凝胶色谱柱的装填：凝胶色谱柱的装填

8、： 教材图教材图519 3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱 材料：材料：交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液 装填装填: 2.凝胶色谱柱的装填：凝胶色谱柱的装填： 步骤步骤操作要求操作要求 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡洗涤平衡 一次性缓慢倒入；轻轻敲打一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液装填悬浮液 凝胶颗粒洗脱液凝胶颗粒洗脱液沸水浴沸水浴 凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀 根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量 色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上 配制悬浮液配制悬浮液 计算称量凝胶计算称

9、量凝胶 固定色谱柱固定色谱柱 3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱 注意事项注意事项 1. 红细胞的洗涤：红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2. 凝胶的预处理：凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡 3. 色谱柱的装填：色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 4. 色谱柱成功标志：色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。红色区带均匀一致地移动。 为什么？为什么？ 知识总结知识总结 血血 红红 蛋蛋 白白 的的 提

10、提 取取 和和 分分 离离 蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性 凝胶色谱法凝胶色谱法 原原 理理分离过程分离过程 凝胶电泳法凝胶电泳法 缓冲溶液缓冲溶液 组组 成成作作 用用 蛋白质的蛋白质的 提取分离提取分离 样品处理样品处理粗粗 分分 离离 纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定 影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素 决定决定 运动方向运动方向 形成形成 库仑力库仑力 形成形成 阻力阻力 决定决定 运动速率运动速率 电荷性质电荷性质 电荷量电荷量 分子形状分子形状 分子大小分子大小 1.1.凝胶色谱法凝胶色谱法 （1）原理：）原理： （2 2）材料）材料 大分子通过多孔凝胶颗粒的

11、间隙，路程短，流动快；大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 如如H2CO3/NaHCO3，HC/NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等等 1.1.凝胶色谱法凝胶色谱法 （4）缓冲溶液洗脱剂缓冲溶液洗脱剂 组成：组成： 配制：配制： 作用：作用： 调节酸和盐的用量，可配制不同调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。的缓冲液。 抵制外界酸碱对溶液抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持的干扰而保持 pH稳定。稳定。 在一定在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；下，使蛋