G蛋白信号的多个表面

1、G蛋白信号的多个表面海蒂-E-哈姆（来自美国芝加哥西北大学神经科学、医学学校，分子药理学与物理化学系） 大量的激素，神经递质，趋化因子，局部介质与感官刺激通过与偶联的G蛋白受体结合，来对细胞与器官产生影响。现在，已经有超过1000种这样的受体为人所知，并且，越来越多的的受体正在随着时间的推移陆续被发现。异源三聚体G蛋白转换配位体使之与受体结合进入细胞进行反应，这成为组织与器官生理应答的基础。在决定细胞对信号反应的专一性和暂时性方面，G蛋白扮演了重要的角色。G蛋白由、三种亚基构成，并且尽管编码每个亚基的基因产物有很多（编码、的基因产物已知。），但四种主要类别的G蛋白是可以被区分的：Gs，用来激活

2、腺苷酸环化酶，Gi,用来抑制腺苷酸环化酶，Gq, 用来激活磷脂酶C，G12和 G13的功能还未知。与GDP偶联的G蛋白是未被激活的，异源三聚体状态，它可以通过鸟嘌呤核苷酸的催化受体交换使GTP偶联到亚基上而被激活。GTP的偶联导致GGTP从G亚基上分离，并通过偶联的GGTP和自由亚基G来激活下游的效应器。当G亚基水解GTP形成GDP时，G蛋白的钝化作用对细胞反应的关闭和开启起限速作用。最近，异源三聚体G蛋白在非活性构象和活性构象方面晶体结构得到解决，这为我们理解其在信号传递途经中作为构象开关的角色提供了结构依据。随着越来越多新颖的途经用于G蛋白的暴露，我们对G蛋白信号调控机制的多样性的认识也在

3、不断增加。介绍G蛋白的结构，作用机制以及G蛋白信号通路的作用规则的研究进展是本文的主题。由于空间有限，我只重点介绍近期的研究结果，所以读者可以直接看到之前研究中的一些优秀的观点。G蛋白的结构G亚基包含两个域，其中一个域参与GTP的偶联与水解（G域），它与GTP酶总科结构上完全相同，包括小G蛋白，伸长因子与用来携带GTP进入核心的蛋白质一种独特螺旋形域。异源三聚体G蛋白的亚基有一个分为7部分的螺旋桨结构，该结构是基于其7WD-40的重复序列。亚基与亚基通过N端螺旋线圈相互作用，并一直以亚基为基础进行广泛接触。这种由亚基和亚基形成的功能单元是不可分离的，除非变性。通过受体引导GTP耦合在G亚基，可

4、以激活G蛋白。这种在G亚基上的GTP调节开关的结构性质是一种改变，一种在三个用来指定开关1,2,3顺序的灵活区域的构象的改变，由偶联的GTP激活，是一种对G低亲和力的构象。这将导致感受器对GGTP亲和力的增加，加速亚基的分离，增加自由的G子代，而这些子代又可以激活大量的效应器。激活G蛋白的受体机制共轭G蛋白的受体们都有一个共同的横剖面图，那是带有7个跨膜螺旋的横剖面图；连接这些螺旋的细胞内循环形成了G蛋白链接域。尽管没有高分辨率的共轭G蛋白受体的结构被确定，但是，最近一种低分辨率的电子衍射视紫红质，共轭G蛋白的受体结构被展示，它显示了7种横跨膜的螺旋线的位置和方向。这些关于共轭G蛋白受体的生化

5、试验与诱变反映了受体的激活是由于配体结合引起跨膜螺旋3和6相对取向的变化。然后这些改变影响了受体的构象，这些受体是细胞内循环时相互作用的G蛋白。并将之前被覆盖的G蛋白的结合位点暴露出来。当一个激活的受体与异源三聚体G蛋白进行反应时，它诱导GDP从G蛋白释放。人们认为与G蛋白上结合位点接触的受体距离耦合GDP的口袋较远，因此得出受体必须在特定的距离工作才能改变蛋白的构象。因为GDP包埋在细胞内部，G的两个域之间，所以改变一些域间的相互作用是必要的。在GDP被释放和GTP缺乏的情况下，在激活的受体和异源三聚体之间，一种稳定的络合物形成了。这种叫“空口袋”的构象引起了人们极大的兴趣，但它的结构现在还

6、是未知的。 在G蛋白上连接受体的区域是什么？它们是怎样激活G蛋白的呢?GDP偶联异源三聚体G蛋白Gt和Gi的构象显示了GDP偶联异源三聚体和表面能与其他蛋白相互作用的剩余物的整体形状，并且为G蛋白受体反应区域生化性质多样性的理解和突变形成的研究提供了结构环境。亚基的N端和亚基的C端都是脂修饰的位点。在异源三聚体内，这些脂修饰区是相互靠近的，表明是膜附着的位点。有证据表明受体与表面的三个亚基全部连接。 在亚基上，最主要的受体接受区是在C末端。在异源三聚体晶体结构中，亚基上最后7个亚基酸是无序的，并且从组合肽库中对受体结合肽的选择分析表明这7个残基是最关键的。利用嵌合G蛋白亚基的研究证实，事实上对

7、受体G蛋白相互作用的特异性来说，最后的5个残基最为重要。简练的诱变研究已经证实，受体细胞内第三循环的C末端连接在G亚基上的C末端区域。就M2毒蕈碱受体耦合Gi来说，对于认识Gi/o的C末端由决定作用的确切受体残留物已经被清楚的解释阐明了。一个更大的区域的G亚基的C-末端区域，以及N-末端的螺旋，在受体接触中已经被密切联系起来了。 Gt丙氨酸扫描突变和G蛋白亚基残留分析都表明Gt的C端50个氨基酸残基是可以接触视紫红质的。Arg-310位于Gt的4- 6环上，是完全阻止胰蛋白酶的蛋白在光激活的视紫红质下水解，这表明4 - 6环区的贡献是与感受器连接。4 - 6环在5HT1B 羟色胺受体与Gi1特

8、异性反应和受体催化激活Gi方面密切相关。显然，异源三聚体G蛋白的亚基增强了与亚基的相互作用能力。在亚基接触残基的单丙氨酸突变是接触亚基块受体介导的GTP / GDP的交换。这表明当GDP的释放发生时，亚基必须让亚基严格到位。在受体与亚基直接进行相互作用的情况已经有报道。交联的研究表明，G的C-末端的60个氨基酸的区域能与2 -肾上腺素能受体的肽交联，从而进入受体细胞内的第三循环。此外，G蛋白的亚基的C末端区已经被证实与受体的耦合和特异性有关。异三聚体G蛋白与视紫红质和膜脂双层的相互作用。视紫红质的螺旋的结构来自于Schertler和Baldwin的研究。在视紫红质前，跨膜螺旋1、5、6、7是亮

9、绿色的，而跨膜螺旋2、3、4是在视紫红质之后，暗绿色的。11-顺维生素A醛辅基由一个Lys-296希夫碱联动形成，是洋红色的。双分子层是绿色的。细胞内的结构和外循环是未知的，并且由手绘表现出螺旋的连通性。与异源三聚体相互作用的胞内循环是橘黄色的和棕色的。（内循环3和推定的细胞内的第四循环的连接跨膜螺旋7的棕榈酰化站点）。G亚基是深蓝色的，G亚基是粉红色的，G亚基是蓝色的。GDP是紫红色的。G蛋白的表面受体是旋转20度面向读者。在文章中讨论的，在异源三聚体G蛋白上连接的受体是红色的，并且包括G亚基上123号和299350号氨基酸残基，一个在G亚基上的连接位点，那是包含在280-340氨基酸残基中

10、和G亚基的6071氨基酸残基。在C末端，视紫红质是可以移动的，G亚基在其N末端是肉豆蔻酰化或棕榈酰化的。G亚基在C末端是白色的。在视紫红质，G，G上的酰基组显示与膜作用。激活的效应机制在GDP与亚基结合后，.GDP与亚基发生解离。这种耦合GDP是一种活性构象，一种新的表面能在G*亚基上形成，并且它可以与效应器反应，与效应器的亲和力可以比它和GDP耦合时的亲和力高20100倍。研究表明，不同的G*s相互作用时所用方式具有相当高的特异性，不同的效应器有不同的酶穿过其表面。G*s激活腺苷酸环化酶，G*t激活感光细胞的cGMP二酯酶，G*p激活磷脂酶C。然而，这种在G亚基表面的保守开关不能解释G蛋白上

11、亚基与效应器作用时精致的特异性。有一种Gt/Gi的嵌合方法可以识别以Gt为基础的特异性相互作用，用磷酸二酯酶。类似的区域参与了带有PLC2的Gq与带有腺苷酸环化酶的Gs的相互作用。新奇的目标Gs主要分为Gs,Gi,和 Gq，是已知的靶细胞。最近，酵母双杂交筛选发现了新的靶细胞。GAIP，是相互作用蛋白的GTPase RGS家族的一个成员- 激活蛋白，是第一个用这种方法确定的蛋白。并且最近两个目标，无约束力的和一种新的LGN重复蛋白，已经由同事描述出来了。到目前为止，无生理作用的后两个G蛋白已经确定。G蛋白亚基的其他效应正在被发现。例如，Gq直接刺激布鲁顿络氨酸激酶的活性，无论淋巴瘤细胞在体外还

12、是在体内。含有未知效应器的两个G亚基是G12和G13。报告显示，它们可以与凝血酶，血栓素和血管紧缩素结合。这些G蛋白的突变激活形式对细胞的影响已经被研究出来了，并且已经确定它们可以调节Na/H的交换。通过Rac和Cdc42的活化技术，它们参与了电压依赖性Ca的缓激肽的激活。为了了解G13的生物学作用，产生了基因敲除小鼠。纯合的G13没有被找到，并且尽管在胚胎期8.5天时胚胎是正常的，但是在10.5天之前它会被胚胎吸收。结果显示，G13的缺乏会降低内皮细胞的血管生成并且没有能力发展成有组织的血管系统。另外，G13的胚胎成纤维细胞显示了受损的迁徙对凝血酶的影响，这表明了趋化受损。有趣的是，虽然G1

13、2与G13有67%的地方完全相同，但G12并不能取代G13。的目标一旦G.GDP从G上解离，自由的是很多蛋白的催化剂，随着时间的推移，能被催化的蛋白的种类在不断增加。很明显，自由的G的构象与其在异源三聚体里时是一样的，G通过与G上位点的结合来抑制G和感受器的相互作用。这方面的证据来自Iyengar实验室的同事，他发现了来自ACII的一种肽，用来连接G和封锁各种效应激活，表明了效应器的一部分结合位点是与ACII，GIRK和PLC共享的。跨膜连接与对接试验局限于G连接区的部分结合位点。除了G连接区，其他G与效应器紧密作用的区域包含了N末端的卷曲螺旋和G的螺旋桨1,7叶片。G很好的定义的经典第二信使

14、酶的亚基的影响-PLC2，-3和AC。它也吸收肾上腺素受体激酶来使膜激酶磷酸化从而激活受体。它也可以结合磷酸化光导蛋白，这种蛋白是用来隔绝并且因此控制通过cAMP依赖的蛋白激酶调节机制的可用性生理机能。近光感因子蛋白也显示与G结合。对光感因子G复合物的晶体结构解析显示G的顶部有一个共享表面是用来让G和光感因子进行相互作用的，但是内部反应的第二位点在光感因子C端和G的螺旋的1和7叶片之间。有趣的是，光感因子上的磷酸化位点，用来调整G的紧密关系的，距离蛋白质蛋白质界面十分遥远。另外，G是一种直接催化剂，来催化K+, Ca2+，可能还有Na+的通道发生G蛋白应答反应。IKACh是用来向内修正K离子通

15、道使得心脏跳动减慢从而与副交感神经乙酰胆碱反应。这是一个同质或异质多聚体的GIRK，是在心脏和大脑发现的单体。G亚基连接GIRK的细胞内结构域的N端或C端并直接激活它们。似乎在确定的突触前的Ca离子通道，G亚基扮演了重要的调节角色，尤其是对1A,1B和较短长度的1E，但并不针对1C, 1D, 1S亚型。现已经有研究表明，G通过连接1亚基Ca离子通道的两个区域来抑制Ca离子通道，这两个区域分别为细胞内的12循环和C末端。G也可以直接激活一个以上的磷脂酰肌醇-3-激酶亚型。有一种独特的G -敏感的磷脂基化磷脂酰肌醇3激酶，P110,没有p85或N-末端的p85结合区域上的催化亚单位。也有报道称，G

16、也可以激活蛋白激酶，例如，该Raf1的蛋白激酶和布鲁顿和TSK 酪氨酸激酶。在酵母中，G是一个刺激信息素激酶途径的激活剂。已知它是的绑定到酵母中的脚手架蛋白Ste5的N-末端区域。最近，索纳和协同工作者实验表明，STE5含有一个二聚体域，这是需要进行绑定的。他们证明了G相互作用引导在STE5域的齐聚。有趣的是，大多数通过谷胱甘肽二聚域 Ste5 S-转移酶的融合蛋白导致MAP激酶级联激活了G独立交流。最近，酵母G也显示激活Rho CDC24，这是一种GTPase Cdc42类型的交换因子。也有报道称G绑定到其他 的Rho GTP酶家族的成员，Rho和Rac，以及小G蛋白ARF（ADP-核糖基化

17、因子），这是用来参与涂层的形成和囊泡运输。鉴于这个G效应器和执行器的激活机制非常丰富和扩展，对未来研究提出了一些关键问题。什么生理情况下是各种效应器能够被激活和什么条件是让所有这些效应器同时保持活性，是否不超过一个G蛋白偶联的信号转导通路需要足够的G产生活性使这些效应器激活？G效应特异性是什么，发生相互作用和活化的效应机制是什么？最后断路机制是什么？G效应相互作用的决定因素身体内有多个基因与G和G有关，并且大部分与G有关的碱基对能形成有功能的G。第一个问题是是否不同的G能调节是不同的效应器。从大量的生化实验中我们得出的结果是：并非如此。G11在感光细胞的视紫红质和光传感因子相互作用方面比其他更

18、优秀，但在与所有其他的G对效应器相互作用方面比较，其表现很糟。一系列的研究表明，在G与受体和效应器相互作用方面的选择性很高，使用的研究方法是使用反义寡核苷酸抑制PAR的翻译特定的蛋白质。特异性的其他证据是慢慢出现的，使用不同的研究技术。G5，最近发现的在中枢神经系统中的G亚基，差异于两个MAP激酶通路。由于G可抑制G的所有行动，G的结合残留是效应激活决定因素的候选者。我们想测试这个想法通过单突变15个G的G的结合残留对丙氨酸，和所有已被检查的效应器，部分不再激活效应器的突变体。然而，在每个效应的相互作用下，不同的氨基酸残基聚集在G的表面是至关重要的，建议一种机制，通过G独特的接触面能与许多不同

19、的效应器进行特定的相互作用。有趣的是，在某些情况下，去除侧链能增加该突变体的G的激活效应器的效力。通过分子间的相互作用确定信号的特异性 细胞信号转导事件的复杂性，即接收和处理多个信号是研究的重点。一些关键的问题是：1）在直接的蛋白质-蛋白质相互作用的编码过程中有多大程度的特异性；2）有其他水平的细胞组织具有特异性吗?和3) 集成的细胞反应交叉调节导致最终的机制是什么？众所周知，多聚体受体可以聚集在一个单一的 G蛋白上，在许多情况下，一个单一的受体能比一个G蛋白激活得更多，从而调节多种细胞内信号。在其他情况下，一个单一的受体与一个给定的G蛋白的相互作用似乎是被调节的通过特定基因的高度选择性。一些

20、描述的特定受体-G蛋白相互作用的影响因素的优秀的评论最近已经出现了。早在体外研究受体-G蛋白相互作用的特点往往是通过高度杂交的受体-G蛋白的相互作用关系，但一些最近的研究表明，一些受体区别于甚至在相关的G蛋白之间的同一个家庭。原位有时具有很高的特异性，它是怎样实现的呢？受体耦合的最精美的特异性 是在体内通过G蛋白的胞内信号通路，已经被证实开始使用反义寡核苷酸抑制翻译特定的G蛋白亚基。该技术允许的抑制不同的组成部分包括信号转导途径和任何后续的受损细胞的反应检查。结果表明，钙通道的抑制作用在生长激素生长抑素受体GH3细胞介导的Go213，而抑制M4毒蕈碱受体介导的 GO114。G的消除 通过反义技

21、术废除生长抑素，在大鼠垂体GH钙离子的抑制作用是由4C1细胞M4M，D2多巴胺受体介导的。相反，通过消耗的GI2受体介导的选择性损害在该系统中抑制cAMP的积累。另一个反义的研究表明，M 1 毒蕈碱受体的利用一个特定的G蛋白组成的复杂的GQ/111/44激活磷脂酶C。最近的一项研究显示，耦合血管紧缩素IIAT1A受体对于调节钙 2 通道，钙诱导的钙释放通道，Na+/H+ 交换是通过1313。这一水平的特异性在体外不能看到，或者可以使用过表达蛋白转染研究。这就提出了如何针对蛋白质或其他细胞机制问题可以获得高的特异性。限制信令结果的曲目一些组织和靶蛋白和细胞结构,我们是在G中指定的蛋白质相互作用的作用的候选人-蛋白信号转导通路。另一个潜在的G蛋白调节剂，