海洋生物毒素的提取

1、海洋生物毒素的提取、分离和鉴定 -以麻痹性贝毒、河豚毒素为例 一、麻痹性贝毒 1、来源 有害赤潮特别是有毒赤潮对人类生命健康和海洋生态系统的 威胁日益严重，已引起人们的广泛关注。有毒赤潮藻类可产 生多种毒素，这些毒素可通过食物链在贝类或鱼类等生物体 内累积放大，当人们误食这些染毒的海产品时，就会发生中 毒死亡，因此，这些毒素又常被称为贝毒素或鱼毒素。 2、作用机理 麻痹性贝毒(paralytic shellfish poisoning, PSP)是一类阻 断神经细胞钠离子通道，对人体神经系统产生麻痹作用的 海洋生物毒素。该毒素对人体毒性极强，且无特效解救药 物，对人类健康影响很大。我国近海多种

2、可食用贝类中均 含有麻痹性贝毒，福建省东山县广东省大亚湾及台湾省近 年都发生因食用染毒贝类而引起多人中毒死亡事件! 3、物理化学性质 a、通常情况下，PSP毒素化学性质比较稳定，但在碱性水 溶液中容易发生分解; b、在强酸性水溶液中，部分毒素容易发生转化，例如N一 磺酞氨甲酞基类毒素在加热、强酸性条件下会脱掉磺酞基， 生成相应的胺基甲酸醋类毒素。 c、在pH为2-4，尤其pH=3时毒素最为稳定，在一18以下 能够较长时间保存; d、麻痹性贝毒本身紫外吸收很弱，且不能产生荧光，但其 在碱性条件下氧化再酸化能生成荧光物质，这种性质成为 PSP荧光检测的主要依据。 4、提取、分离和检测技术 样品采集

3、 扇贝采集，样品采集后现场用水冲净外壳，并用不锈钢刀打 开，将贝肉、性腺和消化腺分离，用纱布吸除多余水分，然 后冰块保存运至实验室，- 20 度贮存。 提取 贝类PSP的提取方法主要采用AOAC法，该方法简单描述 为: a、在称重的烧杯中称取100g均质的样品，加0. lmol/L HCl 溶液100mL充分搅拌，检查pH (pH应为2. 0-4. 0，以3最佳)。 需要时，可逐滴加入5mol/L HCl溶液或0. lmol/L NaOH溶液 调整pH，加碱时速度要慢，同时需不断搅拌，防止局部碱 化破坏毒素。 b、将混合物加热，并徐徐煮沸5min，冷却至室温，调节 pH至 2. 0-4. 0(

4、勿4. 5)。 分离 将混合物移至量筒中并稀释至200mL。将混合物倒回烧杯， 搅拌至均质状，使其沉降至上清液呈半透明状。利用超速离 心机，将混合物或上清液以3 000r/min离心5min。或者用滤 纸过滤。 鉴定方法 a、小白鼠生物检测法 PSP的小鼠生物法检测程序已由美国分析化学家协会 (AOAC)标准化(AOAC,1990)，并在世界范围内被广泛接受。 虽然小鼠生物法操作简单、能反应样品总的毒性，但也有很 多不足的地方，如只能检测毒性大小，而无法确定毒素的种 类和含量;小鼠的不同品系、批次、大小对毒素的测定的灵敏 度有很大的影响;实验结果可重复性、可比性差。 b、高效液相色谱法(HPL

5、C)分析 高 效 液 相 色 谱 法 ( H P L C) 又 称 高 压 液 相 色 谱 、 高 速 液 相 色 谱 、 高 分 离 度 液 相 色 谱 、 近 代 柱 色 谱 等。 高 效 液 相 色 谱 是 色 谱 法 的 一 个 重 要 分 支， 以 液 体 为 流 动 相， 采 用 高 压 输 液 系 统， 将 具 有 不 同 极 性 的 单 一 溶 剂 或 不 同 比 例 的 混 合 溶 剂、 缓 冲 液 等 流 动 相 泵 入 装 有 固 定 相 的 色 谱 柱， 在 柱 内 各 成 分 被 分 离 后， 进 入 检 测 器 进 行 检 测， 从 而 实 现 对 试 样 的 分

6、析。 c、细胞毒性检测法 根据离子通道类毒素可以专一性地作用于细胞膜离子通 道的特点建立起来的细胞毒性检测技术，可以快速敏感的检 测毒素。它是利用毒素对细胞的毒性作用来检测毒素存在与 否以及毒性大小的一种技术，可以直接体现所测样品的毒性 状况。 麻痹性贝毒（PSP)可以作用于Na+通道的1位点，阻断 Na+内流，当在培养的细胞中加入Na+通道活化剂，细胞会由 于Na+内流过多而造成肿胀，甚至死亡，但如果同时加入具 Na+通道阻断作用的毒素PSP, Na+内流会因拮抗作用而受到 限制，使得细胞成活，由此可以确定毒素的存在，并根据细 胞的成活率对毒素进行定量分析。 针对PSP的仪器检测方法还有液相

7、色谱一质谱联用，毛细 管电泳法，流动注射法等，但都因灵敏度低或毒素组分分离 度差等原因而未能得到广泛使用。 二、河豚毒素 1、河豚简介 河豚鱼(Balloonfish )，属硬骨鱼纲、鱿形目。世界上有200 多种，可引起中毒的有9种。河豚主要分布在渤海、东海、 黄海及江河下游，为近海与河川底层肉食性海产有毒鱼类。 河豚鱼肉质细嫩、鲜美，曾有“拼死吃河豚”之说，吃河豚 中毒死亡者，在国内外屡见不鲜，就是食用河豚经验比较丰 富的日本人，据说每年中毒死亡者也有几百人之多。 2、河豚毒素简介 70年代成功的从河豚鱼体内有毒部位(卵巢、精巢、肝脏、 脾、胃、肠等)分离提纯河豚毒素(Tetrodotoxi

8、n, TTX)。 TTX是一种结构为笼形原酸脂类的非蛋白神经毒素，其分 子式为C11H17O8N3，分子量为319。 河豚毒素呈白色结晶状，无臭，易潮解，在镇痛、降压、 抗心率失常、局麻、戒毒、抑瘤等方面发挥着不可替代的 医疗作用，因此具有极高的经济价值和医疗价值。由于河 豚毒素能特异性阻断钠离子通道，在生理研究上，已成为 机制研究的工具药，为神经细胞膜研究必不可少的标准药 物. 3、提取、分离和检测技术 材料：棕斑腹刺豚。 TTX的提取 取河豚鱼的内脏捣碎后，分为四份，分别加入5倍量的甲 醇、乙醇、乙酸、水，然后将装有四种不同溶剂的提取瓶 置于60恒温水浴锅中8h，使TTX充分溶解于溶剂中。

9、 分离 取出三角瓶，3500 rpm离心10min，分别收集上清液和固 体物，将固体物再重复以上步骤2次，合并上清液。若脂 肪过多可用乙醚进行脱脂处理。将上述粗提液减压蒸馏。 得到的少量液体按照溶剂的不同编号为1号(乙酸提取),2号 (甲醇提取),3号(乙醇提取),4号(水提取)处于冰箱中备用。 TTX的鉴定与检测 a、小白鼠生物检测法 选择体重为25士2g左右的小白鼠，随机分为两组，分别腹 腔注射0.8 m1,1.0 ml上述提取液，观察小鼠症状。 小白鼠生物检测法结果与讨论 结果 小白鼠经腹腔注射四种溶剂提取的河豚内脏提取液后，均 呈现中毒症状，观察症状如下:注射0.8 ml样品液的小鼠最

10、 初表现平静，过30 min左右开始浑身打颤，最后身体上的 毛都湿了。但经过5-6 h后，又恢复平静。随着时间的延 长，小鼠也恢复正常，大约一天的时间，小鼠完全恢复正 常。而注射1 ml样品液的小鼠最初也是表现为平静，继而 出现不安，突然旋转，大呼吸，最后突然跳起，翻身，四 肢痉挛，腹部朝上死亡。该死亡症状与文献报道的河豚毒 素中毒死亡症状一致。小白鼠的死亡时间却不一致，2,3,4 号提取液致死时间几乎相同，且时间较长为6-8 h，而1号 提取液对小白鼠的致死时间相对较短为4一5 h。 讨论 本实验中采用的两组小鼠实验因为注射的样品量不同，直 接导致了小鼠的不同行为症状，注射0.8 ml样品液

11、的小鼠 大量出汗、打颤、但没有死亡，2天后恢复正常。通过对 注射lmL样品液的小白鼠中毒实验死亡症状的观察，验证 了甲醇、乙醇、乙酸、水这四种溶剂均能提取出河豚毒素， 但死亡时间不一致可证明其提取的毒量的差异，因均取材 于同一河豚鱼故可抵消毒素的不同和毒力强弱这些因素带 来的影响，所以小白鼠从注射到死亡的时间越长，说明其 含毒量越低。即2,3,4号的含毒量较1号乙酸提取的河豚毒 素含量低。从此实验可初步得出河豚毒素经乙酸提取的效 果要好于甲醇、乙醇、水三种溶剂。 b、薄层层析法 硅胶板的制作：称取硅胶H 50g于研钵中，加入25 ml 0.5%的CMC，在研钵中研磨混匀至糊状无颗粒将其倒在 层

12、析板上，平铺均匀，(这样可铺三块长17 cm、宽12 cm 的层析板)于110活化半小时后取出备用。 点样:20川样品液点于活化好的硅胶板上，点样点距离板 底1.5 cm，点样斑点直径控制在2左右，样品间距约1.5 cmo 展层:首先将展开剂置于层析缸中5 min预平衡，再将点好 样的层析板放人层析缸中室温展开(展开剂为正丁醇:醋酸: 水=2:1:1)，待展开剂前沿走至距板顶1. 0 cm时取出，自 然晾干。 显色:用喉头喷雾器将3 mol /1 KOH溶液均匀喷至层析板 上，吹风机吹干，于160下烘15一20min，取出10 min 后立即扫描。 瑞士卡玛TLC scamner-3 全自动薄

13、层层析仪 薄层层析结果与讨论 结果: 肉眼观察1,2,3,4号提取液经薄层层析后在层析板上分别呈 现四个黄褐色斑点，这些斑点直径不等，但展距(Rr值)相 近，差别可能是溶剂的极性不同引起的。经复日成像系统 扫描后这四个斑点清晰可见:1号所得的主斑点的直径相对 较大。 讨论 上述提取的1,2,3,4号提取液经薄层层析后在层析板上均 可见四个黄褐色斑点，这与文献报道的河豚鱼体内含有河豚 毒素、河豚酸、卵巢毒素和肝脏毒素相吻合，且各自的Rf值 相近，其中一个斑点特别明显，推测可能为河豚毒素。从扫 描结果分析对比平行斑点的直径之间存在显著差异:1号提取 展开的四个斑点直径均比2,3,4号的斑点直径大，

14、尤其是河豚 毒素的斑点直径更为明显。也就是说，1号乙酸提取的河豚 毒素含量高于其他三种，这与小白鼠中毒实验得出的结论一 致。 参 考 文 献： 杨 春, 苏 秀 榕, 李 太 武 等. 低 毒 河 豚 鱼 毒 素 的 提 取 和 检 测 J . 天 然 产 物 研 究 与 开 发 , 2 0 0 3 - 1 0 - 3 0 岳 亚 军; 张 律; 游 杰 等 免 疫 亲 和 柱 净 化 - 高 效 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 测 定 鱼 肉 和 肝 脏 中 河 鲀 毒 素 J ， 中 国 食 品 卫 生 杂 志， 2 0 1 6 - 0 3 - 3 0 扇 贝 中 麻 痹 性 毒 素 的 提 取 与 分 离 纯 化 林 华 娟 “， 秦 小 明 ， 章 超 桦 李 政 菊; 胡 蓉; 吴 霓; 海 南 岛 近 岸 海 域 贝 类 中 的 麻 痹 性 贝 类 毒 素 J ， 海 洋 环 境 科 学, 2 0 1 6 - 0 4 - 2 0 江 涛, 双 壳 贝 类 中 麻 痹 性 贝 类 毒 素 的 提 取