实时直接分析―质谱法快速检测饮料和尿液中的γ―羟基丁酸

1、实时直接分析质谱法快速检测饮料和尿液中的 羟基丁酸摘要建立了一种实时直接分析-质谱法（ DART-MS）用于饮料（水、碳酸饮料、啤酒）和尿液中 -羟基丁酸（ GHB）快速检测。样品经甲醇 -水（ 1 1， V/V）溶液稀释后，在负离子模式下，以选择离子扫描 （SIR）模式进行直接定量分析。离子化气体温度为 350，进样速率为 0.5 mm/s 。针对水样、碳酸饮料、 啤酒、尿液样品， 本方法的检出限 （ S/N=3）为 12 g/mL，定量限（ S/N=10）为 3 5 g/mL 。标准曲线线性相关系数为 0.9899 0.9980，加标回收率为 80.8%115.2%，相对标准偏差为 1.9

2、% 12.8%。本方法具有样品前处理简单、分析速度快、成本低等优点，有望在大批量饮料和尿液样品的快速筛查分析中发挥作用。关键词实时直接分析-质谱法； -?u 基丁酸；快速筛查1 引言 -羟基丁酸 （ -Hydroxybutyric acid ，GHB）是一种常见的滥用药物，被用作镇静剂和麻醉剂，过度使用会造成暂时性失忆，甚至导致死亡。我国和美国都将其列为管制药物。GHB具有强烈的镇静及健忘效应，易溶于大多数液体基质中，且无色无味，因此常作迷药用于药物辅助性犯罪1 。对于服用 GHB 者，尿液中GHB 浓度明显高于内生浓度水平（低于10 g/mL），因此尿液是检测 GHB 极具参考价值的生物样本

3、，有必要建立快速灵敏的检测饮料和尿液中GHB 的方法。目前， GHB 的检测方法有显色法、红外光谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱 -质谱联用法、离子色谱法及核磁共振法等。 Alston 等 2 用化学显色法作为初步筛选药物的方法，但该方法检出限高，且易受干扰；Witkowski 等 3 采用傅里叶变换红外法（FTIR）用于 GHB的快速筛查，但定量分析存在不足；色谱-质谱联用是使用最广泛的方法之一，Lenz等4 在酸性条件下将 -羟基丁酸（ GHB）转变为 -丁内酯（GBL），浓缩后采用顶空进样方式的气相色谱 -质谱联用法（GC-MS）分析；孟品佳等 5 用五氟卞基溴烷基化衍生后，对衍生物

4、进行了质谱解析，然而提取和衍生化的过程复杂且耗时； Busardo 等 6 采用 HPLC-MS/MS 法检测血浆、尿液、脑脊髓液和头发中的 GHB，尽管避免了 GC-MS中将 GHB 进行内酯化或者衍生化的样品前处理问题，但仍然需要耗时的色谱分离，且使用的串联质谱价格昂贵，不利于推广。Liu等7 采用二维离子色谱法测定了人尿样品中 GHB 含量，通过离子排斥色谱柱消除尿液基质干扰，再利用柱切换技术，采用离子交换色谱柱测定 GHB，由于需要对仪器进行改装，且使用实验室自制离子交换色谱柱，不利于推广。Palomino-Schtzlein 等 8 利用核磁共振对尿液和血清中的GHB进行定性和定量检

5、测，在 NMR 分析中，体液中大分子重叠共振，严重干扰了 GHB的检测。 Saar-Reismaa等9 利用毛细管电泳法测定人唾液样本中的 GHB，但毛细管电泳中电渗流的不稳定性经常引起迁移时间的变化。实时直接分析离子源 （ DART）是一种新型的敞开式非表面接触型解析 / 离子化分析技术， 可分析各形态样品， 无需繁杂的前处理和冗长的色谱分离过程，分析速度为秒级，可实现对目标物的实时定性与定量分析 10 。 Bennett 等 11 将DART与飞行时间质谱仪 （ TOF）联用，检测饮料中 GHB； Chen等12 将 DART与四极杆 -轨道离子阱质谱 （ Q-Orbitrap ）联用，用

6、于检测包括 GHB 在内的多种街头药物。 但上述工作均未进行 GHB 的准确定量分析，且未涉及尿液样本的检测；同时，飞行时间质谱和四极杆 -离子阱质谱比单四极杆质谱价格昂贵，测试成本高，不利于普及使用。本研究采用实时直接分析 -单四极杆质谱法， 建立了快速检测饮料及尿液中的 GHB 的方法。本方法无需复杂的样品前处理过程，分析速度快，且单重四极杆质谱成本相对较低，体积小，更易于推广，饮料及尿液样本的同时测定更利于刑事案件的侦查。2 实验部分2.1 仪器与试剂实时直接分析离子源 DART SVP（美国 Ion Sense 公司）；ACQUITY QDa质谱检测器（美国Waters 公司）； 3K

7、15 离心机（德国 Sigma 公司）、 UPR-II-5T超纯水仪（四川优普超纯科技有限公司） 、 VX-200 涡旋搅拌器（美国Labnet 公司）、AR223CN电子天平 （美国 Ohaus 公司）、KH7200DB 型超声仪（昆山禾创超声仪器有限公司）。甲醇（色谱纯，德国Merck 公司），实验用水为经UPR-II-5T超纯水仪制备的超纯水；-羟基丁酸（美国Cerilliant 公司）。3 种饮料样品购于当地超市，分别为水、无色碳酸饮料和啤酒；尿液样品由志愿者提供。2.2 溶液配制称取 GHB 标准品 0.01 g （精确到 0.001 g），以超纯水溶解并定容至10 mL，配制成 1

8、000 g/mL 的单标储备液，于4保存。使用前以甲醇 -水（ 11， V/V）稀释成不同浓度的标准溶液。碳酸饮料、啤酒的标准溶液： 取碳酸饮料和啤酒各 10 L，加入适量标准储备液， 用 990 L 甲醇 -水（1 1， V/V）稀释成不同浓度的标准溶液。模拟样品的配制：在空白样品中添加适量的标准溶液，制得不同浓度的阳性样品。配制的模拟水样中GHB 浓度约为20、40 和 80 g/mL ，以甲醇稀释1 倍后进样；碳酸饮料和啤酒中 GHB 浓度约为 1000、2000 和 4000 g/mL ，以甲醇 - 水（ 1 1， V/V）稀释 100 倍后进样；尿液中 GHB 浓度约为200 g/m

9、L ，以甲醇 -水（ 1 1， V/V）稀释 10 倍后进样。 2.3 样品前处理饮料：水样取500 L，加入500L甲醇，过0.22 m 滤膜后进样；对于碳酸饮料和啤酒，取10 L 样品，加入 990 L 甲醇 -水（ 1 1， V/V）稀释，经 0.22 m 滤膜过滤后检测。尿样：取尿样100 L，加900L 甲醇 -水（ 11，V/V），涡旋混匀，以10000 r/min离心5 min，取上清液，经0.22 m滤膜过滤后检测。2.4 实时直接分析离子源条件和质谱条件负离子模式采集数据，离子化气体为高纯氦气，氦气的流速为 3 L/min ，气体离子化温度为350；采用12 Dip-itSa

10、mplers 模式进样， 用玻璃棒蘸取适量溶液置于自动进样架上，待溶液挥干后进样，进样速率为0.5 mm/s ，栅极电压为200 V，离子源出口距质谱进口约2.4 cm。在负离子模式下，选择离子扫描模式（SIR）采集数据，锥孔电压为8 V，母离子 m/z 103.3 。3 结果与讨论3.1 ?| 谱条件的优化在选择离子扫描模式下，分别采用正离子模式和负离子模式对 GHB 进行一级质谱分析，得到其分子离子峰。如图1所示， GHB 在正负离子模式下均有响应，但在负离子模式下GHB的信号强度明显优于正离子模式，因此本研究选择负离子模式进样。在此条件下，优化锥孔电压，使分子离子峰达到最大响应值，最终确

11、定锥孔电压为8 V。3.2 DART条件的优化3.2.1 离子化温度DART利用高温激发态的等离子体对待测样品进行解吸离子化，因此离子化温度是需要优化的重要参数。温度过高或过低，都会影响DART的离子化效率和背景噪音。高温会加速待测样品的热解吸率，使更多的待测样品进入质谱检测器，进而增强响应。然而，过高的温度会导致待测样品在热解吸过程中降解，降低灵敏度13 。本研究考察了离子化气体温度在300 450范围内对GHB 离子化效率的影响， 发现离子化温度为350时，信号响应最高，如图 2 所示。3.2.2 样品传输速度DART软件能控制线性轨道上dip-it玻璃棒的移动速度，玻璃棒蘸取待测样品后引

12、入质谱仪分析。玻璃棒通过电离区域的速度对样品信号响应强度有较大的影响。本研究考察了样品传输速度为0.2、 0.5 和 0.8 mm/s时 GHB 的峰形和离子响应强度。 如图 3 所示，当样品传输速度较慢时，有利于离子化气体与样品充分接触，从而提高离子化效率，但峰形变宽。综合考虑峰形、分析速度及离子响应强度等因素，最终确定以 0.5 mm/s 的速度进行样品传输。 3.3 方法学考察水样的基质较为简单，用甲醇 -水（ 1 1， V/V）稀释 1倍后直接进行分析。碳酸饮料和啤酒的基质成分较复杂，在制作标准曲线时应考虑基质效应。基质效应的评价公式为：基质效应 =（ 1-基质空白溶液的加标信号强度

13、/ 空白溶剂的加标信号强度） 100%14。经计算碳酸饮料和啤酒的基质效应15%，故以空白碳酸饮料和啤酒为溶剂配制一系列不同浓度的 GHB 标准溶液。 由于碳酸饮料中含有较多的糖类， 样品黏度大，而啤酒中的成分较为复杂，基质浓度过高时，样品液膜太厚，可能无法实现目标分析物的瞬间气化，直接进样后得到的选择离子流图出现了裂峰现象。本实验采用甲醇 - 水（ 11， V/V）稀释碳酸饮料和啤酒样品，考察稀释倍数（ 10、20、50 和 100 倍）对峰形及信号响应的影响。结果表明，稀释 100 倍后直接进样可以消除选择离子流图的裂峰现象。尿液样品通过甲醇 -水（1 1， V/V）稀释 10 倍后进样，

14、结果表明，尿液的基质效应小于 15%，属于低基质效应影响，故在实际定量分析过程中采用与水样相同的标准曲线。饮料（水、碳酸饮料、啤酒）和尿液的工作曲线方程如表 1 所示，其线性范围均为 5100 g/mL ，线性相关系数R0.98，方法的相对标准偏差为4.1% 5.7%，检出限（ S/N=3）为 1.02.0 g/mL ，定量限（ S/N=10）为 3.05.0 g/mL 。 3.4 模拟样品分析在实际的刑事案件中，饮料中GHB 的浓度范围在 1.721.1 mg/mL 之间 11 。由于阳性的实际样品难以获取，本实验通过加标的方式配制模拟阳性样品。在适量饮料样品中添加 GHB 标准品，使饮料中

15、GHB 的含量分别约为1000、 2000和 4000 g/mL 。对于刑事案件中的尿液样品， Bosman 等 15报道在疑似药物服用的不同案件中尿液样品中GHB 浓度范围为 14 2000 g/mL 。LeBeau 等16 也报道了一例疑似药物辅助性犯罪 （ DFSA）案件中， 尿液中 GHB 的浓度为 308 g/mL 。采用在阴性尿液中添加GHB 标准品的方式配制模拟阳性尿液样品，使尿液中GHB 的含量约为200 g/mL 。按照2.3 节的方法对上述配制的模拟样品进行简单前处理后，进行检测。稀释后的模拟阳性样品测得的质谱图见图4，测得的GHB浓度如表2 所示。加标回收率在80.8%

16、115.2%之间，相对标准偏差为1.9% 12.8%，表明本方法具有较好的准确度和重现性。4 结论本研究建立了一种饮料和尿液中快速筛查GHB 的DART-MS方法，样品前处理过程简单快速，操作方便，可对实际饮料样品（水、碳酸饮料、啤酒）以及尿液中的GHB 进行快速筛查，且DART-MS仪器成本低， 体积小。本方法可应用于现场快速检测， 可为司法鉴定中涉及GHB的案件提供技术支持。References1 Drasbek K R， Christensen J， Jensen K. Acta Neurol.Scand.， 2006， 114（ 3）： 145-1562 Alston W C， Ng

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18、ardo F P， Kyriakou C， Marchei E， Pacifici R，Pedersen D S， Pichini S. J. Pharmaceut. Biomed.， 2017， 137（ 1）： 123-1317 Liu J， Deng Z， Zhu Z， Wang Y， Wang G， Sun Y，Zhu Y. J. Chromatogr. A， 2017， 1528（1）： 35-408 Palomino-Schtzlein M ， Wang Y，Brailsford A D， Parella T， Cowan D A， Legido-Quigley C， Prez-Trujillo M. Anal.Chem.， 2017， 89（ 1）： 8343-83509 Saar-Reismaa P， Vaher M， Kaljurand M ， Kulp M ， Mazina-Sinkar J. Anal. Methods， 2017， 9（ 21）： 3128-313310 Cody B R， Larame J A， Durst. Anal. Chem.， 2