谷丙转氨酶活性测定课件

1、谷丙转氨酶活性测定1 实验十七实验十七 谷丙转氨酶活性测定谷丙转氨酶活性测定 Exp.17 Activity Determination of Glutamic Pyruvic Transaminase 谷丙转氨酶活性测定2 一、实验原理一、实验原理 氨基移换酶也称转氨酶氨基移换酶也称转氨酶, ,为广泛存在于生物为广泛存在于生物 机体内的酶，其作用为催化机体内的酶，其作用为催化-氨基酸的氨基酸的- - 氨基氨基 与与- - 酮酸的酮酸的- - 酮基互换。因此在氨基酸的合酮基互换。因此在氨基酸的合 成和分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中成和分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中 有重要作用。

2、转氨酶的种类甚多。有重要作用。转氨酶的种类甚多。 任何一种氨基任何一种氨基 酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化，酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化， 它们的最适它们的最适pHpH接近接近7.47.4。 谷丙转氨酶活性测定3 在各种转氨酶中，谷氨酸在各种转氨酶中，谷氨酸- -草酰乙酸转氨酶草酰乙酸转氨酶 （简称谷草转氨酶）及谷氨酸（简称谷草转氨酶）及谷氨酸- -丙酮酸转氨酶（简丙酮酸转氨酶（简 称谷丙转氨酶）活力最强。称谷丙转氨酶）活力最强。 上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内，上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内， 在正常人血清中也有少量，机体发生肝炎。心肌在正常人血清中也有少量

3、，机体发生肝炎。心肌 梗塞等病变时，血清中转氨酶活力显著增加，所梗塞等病变时，血清中转氨酶活力显著增加，所 以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。 它们的催化反应如下：它们的催化反应如下： 谷丙转氨酶活性测定4 COOH COOH COOH COOH CHNH2+ C=O C=O + CHNH2 CH3 (CH2)2 CH3 (CH2)2 COOH COOH 转氨酶 丙氨酸 -酮戊二酸 丙酮酸 谷氨酸 谷丙转氨酶活性测定5 测定转氨酶活力的方法很多，如分光光度法，纸测定转氨酶活力的方法很多，如分光光度法，纸 上层析法等。在本方法中，谷丙转氨酶作用于

4、丙氨上层析法等。在本方法中，谷丙转氨酶作用于丙氨 酸和酸和酮戊二酸后，生成的丙酮酸与酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2,42,4 二硝二硝 基苯肼作用生成丙酮酸基苯肼作用生成丙酮酸2,42,4 二硝基苯腙。二硝基苯腙。 本方法中用分光光度法，根据硝基苯腙的生成本方法中用分光光度法，根据硝基苯腙的生成 量可以计算酶的活力。量可以计算酶的活力。 谷丙转氨酶活性测定6 二、实验用品二、实验用品 1、材料、材料 新鲜动物肝匀浆。新鲜动物肝匀浆。 2、试剂、试剂 （1）0.1M磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH=7.4） 取取0.1M KH2PO4液液50ml，0.1N NaOH液液39.3ml， 再加蒸馏水再加蒸

5、馏水10.7ml，混匀即得。混匀即得。 （2）丙酮酸钠标准液（）丙酮酸钠标准液（2.0微克分子微克分子/ml）：）： 取取AR丙酮酸钠丙酮酸钠11mg溶解于溶解于50ml 0.1M磷酸缓冲液磷酸缓冲液 内（宜当日新配）。内（宜当日新配）。 谷丙转氨酶活性测定7 （3）谷丙转氨酶底物：）谷丙转氨酶底物： 取分析纯取分析纯酮戊二酸酮戊二酸29.2mg，DL丙氨酸丙氨酸1.79g置于小置于小 烧杯内，加烧杯内，加1N NaOH约约10ml至完全溶解。用至完全溶解。用1N NaOH或或1N HCl校正其校正其pH=7.4，加加0.1M磷酸缓冲液稀释至磷酸缓冲液稀释至100ml，然后加然后加 氯仿数滴防

6、腐，在冰箱内可保存一周。此溶液每氯仿数滴防腐，在冰箱内可保存一周。此溶液每1.0ml含含 酮戊二酸酮戊二酸2.0微克分子，丙氨酸微克分子，丙氨酸200微克分子。微克分子。 （4）2，4二硝基苯肼溶液：二硝基苯肼溶液： 将将AR纯纯2，4二硝基苯肼二硝基苯肼19.8mg加入加入200ml锥形瓶内，锥形瓶内， 加加100ml 1N HCl液。液。2，4二硝基苯肼溶解较慢，把锥形瓶二硝基苯肼溶解较慢，把锥形瓶 放在暗处不时摇动，全部溶解后，滤入褐色玻璃瓶。并置于放在暗处不时摇动，全部溶解后，滤入褐色玻璃瓶。并置于 冰箱中保存。冰箱中保存。 （5）0.4N氢氧化钠液。氢氧化钠液。 3、仪器设备、仪器设

7、备 试管、吸量管、恒温水浴锅、分光光度计试管、吸量管、恒温水浴锅、分光光度计 谷丙转氨酶活性测定8 三、方法和步骤三、方法和步骤 1 1、肝匀浆制备：、肝匀浆制备： 取新鲜动物肝脏，用生理盐水冲洗，滤纸吸取新鲜动物肝脏，用生理盐水冲洗，滤纸吸 干，称取肝脏干，称取肝脏0.50.5g g，剪成小块，置于玻璃匀浆管剪成小块，置于玻璃匀浆管 内，加入内，加入4.54.5mlml预冷的预冷的pH 7.4 0.1 mol/LpH 7.4 0.1 mol/L磷酸缓磷酸缓 冲液，制成冲液，制成10%10%肝匀浆，冰冻保存。肝匀浆，冰冻保存。 谷丙转氨酶活性测定9 2 2、标准曲线的绘制、标准曲线的绘制 取取

8、6 6支试管分别用支试管分别用0 0、1 1、2 2、3 3、5 5标号，按下标号，按下 表所列次序添加各试剂。表所列次序添加各试剂。 将试管于将试管于3737水浴中保温，平衡管内外温度水浴中保温，平衡管内外温度, , 向各管内加向各管内加0.50.5ml 2ml 2，4 4二硝基苯肼后再保二硝基苯肼后再保 温温2020分钟，分钟， 最后分别向各管内加入最后分别向各管内加入0.40.4N NaOH 5N NaOH 5毫升，毫升， 在室温下静置在室温下静置3030分钟后，分钟后， 以以0 0号管做号管做“空白空白”用用520520nmnm进行比色，读出进行比色，读出 光吸收值，以丙酮酸的微摩数为

9、横坐标，光吸收光吸收值，以丙酮酸的微摩数为横坐标，光吸收 值为纵坐标，画出标准曲线。值为纵坐标，画出标准曲线。 谷丙转氨酶活性测定10 管号管号 试试 剂剂 012345 丙酮酸钠标准液丙酮酸钠标准液/ml0.000.050.100.150.200.25 谷丙转氨酶底物谷丙转氨酶底物/ml0.500.450.400.350.300.25 磷酸缓冲溶液磷酸缓冲溶液 (0.1M pH7.4) /ml 0.100.100.100.100.100.10 37水浴中保温，水浴中保温， 平衡管平衡管内外温内外温度度 2，4-二硝基苯肼二硝基苯肼/ ml0.500.500.50 0.50 0.50 0.50

10、 保温保温20分钟分钟 NaOH (0.4N)/ml555555 静置静置30分钟分钟 A520nm 表表1.1.丙酮酸钠标准曲线的绘制丙酮酸钠标准曲线的绘制 谷丙转氨酶活性测定11 1 测定管测定管2 “空白空白”对照管对照管 谷丙转氨酶底物谷丙转氨酶底物/ml0.500.50 37水浴保温水浴保温10min，使管内外温度平衡，使管内外温度平衡 稀释肝匀浆稀释肝匀浆/ml0.10 37水浴保温水浴保温30分钟分钟 2,4二硝基苯肼试剂二硝基苯肼试剂/ml0.500.50 稀释肝匀浆稀释肝匀浆/ml0.10 保温保温20分钟，冷却分钟，冷却 NaOH (0.4N) /ml5.05.0 室温下静置室温下静置30分钟分钟 A520nm 表表2.2.谷丙转氨酶酶活力的测定谷丙转氨酶酶活力的测定 2 2、谷丙转氨酶酶活力的测定、谷丙转氨酶酶活力的测定 谷丙转氨酶活性测定12 四、实验结果四、实验结果 用光吸收值读数在操作曲线上查出转氨酶活力单位用光吸收值读数在操作曲线上查出转氨酶活