生物工业下游技术双水相萃取技术

1、双水相萃取技术双水相萃取技术 o 概述概述 o双水相分离理论双水相分离理论 o 双水相萃取技术的应用双水相萃取技术的应用 o 双水相萃取技术的发展双水相萃取技术的发展 概述概述 o 双水相萃取技术的诞生和简双水相萃取技术的诞生和简 介：介：1896年年Beijerinck观察到当把观察到当把 明胶与琼脂或把明胶和可溶性淀粉的水明胶与琼脂或把明胶和可溶性淀粉的水 溶液混合时，先得到一混浊不透明的溶溶液混合时，先得到一混浊不透明的溶 液，随后分成两相，上相含有大部分明液，随后分成两相，上相含有大部分明 胶，下相含有大部分琼脂胶，下相含有大部分琼脂(或可溶性淀或可溶性淀 粉粉)。 o再如图再如图7-

2、1中，中，2.2的葡聚糖水溶液与的葡聚糖水溶液与 等体积的等体积的0.72甲基纤维素钠的水溶液甲基纤维素钠的水溶液 相混合并静置后，可得到两个粘稠的液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液 层，下层含有大部分葡聚糖上层含有层，下层含有大部分葡聚糖上层含有 大部分甲基纤维素纳，两相中大部分甲基纤维素纳，两相中98以上以上 的成分是水。此现象称为聚合物的不相的成分是水。此现象称为聚合物的不相 溶性。溶性。 有机溶剂萃取法存在的问题：有机溶剂萃取法存在的问题： (1)许多蛋白质都有极强的亲水性，不许多蛋白质都有极强的亲水性，不 溶于有机溶剂：溶于有机溶剂：(2)蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。蛋白质在有

3、机溶剂相中易变性失活。 o 原因：聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法 渗透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成 单一的水相，所以具有强烈的相分离倾向。 o 另外，某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混 合时，只要浓度达到一定值，也会形成两相，即聚 合物-盐双水相体系。 o 应用：应用： 主要应用于酶、核酸、生长激素、病毒等各种物质主要应用于酶、核酸、生长激素、病毒等各种物质 的分离和提纯的分离和提纯 概述概述 双水相分离理论双水相分离理论 一、双水相的形成一、双水相的形成 o 当两种聚合物互相混合时，究竟是否分层或混合成一当两种聚合物互相混合时，究竟是否分层或混合成一 相，取决于两种因素

4、：相，取决于两种因素： o 一为一为体系嫡的增加体系嫡的增加， o 二为二为分子间作用力分子间作用力。 o 熵的增加涉及到分子数量熵的增加涉及到分子数量(聚合物的浓度聚合物的浓度)，与分子大，与分子大 小无关。分子间的作用力可看作分子中小无关。分子间的作用力可看作分子中各基团间相互各基团间相互 作用力之和作用力之和。 o 分子量越大，分子间的作用力也越大。因此，两种被分子量越大，分子间的作用力也越大。因此，两种被 混合分子间如存在混合分子间如存在空间排斥力空间排斥力，它们的线团结构无法，它们的线团结构无法 互相渗透，则在达到平衡后就有可能分成两相，形成互相渗透，则在达到平衡后就有可能分成两相，

5、形成 双水相。双水相。 v广泛应用的双水相体系：广泛应用的双水相体系：(1) 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）/葡聚糖葡聚糖 （Dex）体系：易于与后续处理连接；）体系：易于与后续处理连接； (2) PEG/盐体系：盐浓度高，蛋白质易盐析，废水处理困难盐体系：盐浓度高，蛋白质易盐析，废水处理困难 二、相图二、相图 o双水相的形成条件和定量关系常用相图表示。它是一条双水相的形成条件和定量关系常用相图表示。它是一条双节线双节线。双节线下方。双节线下方 为一相区，双节线上方即为两相区，两相分别有不同的组成和密度。为一相区，双节线上方即为两相区，两相分别有不同的组成和密度。上相上相组成组成 用用T(Top

6、)表示，表示，下相下相组成用组成用B(Bottom)表示。表示。 如点如点M为整个系统的组成，该为整个系统的组成，该 系统实际上由系统实际上由T、B所代表的两所代表的两 相组成，相组成，TB为为系线系线。两相平衡。两相平衡 时，符合杠杆规则，时，符合杠杆规则，VT表示上表示上 相体，相体，VB表示下相体积，表示下相体积， VT/VB=BM/TM 当点当点M向下移动时，系线长度向下移动时，系线长度 缩短，两相差别减小，到达缩短，两相差别减小，到达K 点时，系线长度为点时，系线长度为0，两相间，两相间 差别消失而成为一相，因此差别消失而成为一相，因此K 点为系统点为系统临界点临界点。 双水相分离理

7、论双水相分离理论 双节线的位置和形状与聚合双节线的位置和形状与聚合 物的相对分子质量有关。物的相对分子质量有关。 聚合物聚合物Dex的相对分子质的相对分子质 量越高，相分离所需的浓度量越高，相分离所需的浓度 越低；越低； 两种聚合物相对分子质量相两种聚合物相对分子质量相 差越大，双节线的形状越不差越大，双节线的形状越不 对称。对称。 三、物质在两相中的分配三、物质在两相中的分配 o 分配定律：分配定律：和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用 分配系数分配系数K表示。表示。 K=cT/cB cT、cB分别代表上相、下相中溶质的浓度分别代表上相、下相中溶质

8、的浓度 K与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度 无关无关 o 分配系数影响因素：分配系数影响因素：影响因素很多，加上各因素间又相影响因素很多，加上各因素间又相 互影响，因此定量地将蛋白质的一些分子性质与分配系数关互影响，因此定量地将蛋白质的一些分子性质与分配系数关 联起来是困难的，最佳的双水相操作条件还得依靠实验来获联起来是困难的，最佳的双水相操作条件还得依靠实验来获 得。得。 双水相分离理论双水相分离理论 双水相分离理论双水相分离理论 物质在两相中的分配物质在两相中的分配 o 双水相体系中聚合物的分子量和浓度双水相体系中聚合物的

9、分子量和浓度 o 体系中盐的种类和浓度体系中盐的种类和浓度 o 体系的体系的pH o 体系温度体系温度 o 体系中菌体或细胞的种类和浓度体系中菌体或细胞的种类和浓度 影响分配平衡的参数影响分配平衡的参数 双水相分离理论双水相分离理论 影响分配平衡的参数影响分配平衡的参数 双水相体系中聚合物的影响双水相体系中聚合物的影响 双水相分离理论双水相分离理论 影响分配平衡的参数影响分配平衡的参数 例如，在例如，在PEG/Dex 体系中加入体系中加入NaCl，对卵，对卵 蛋白和溶菌酶分配系数的影响如图蛋白和溶菌酶分配系数的影响如图7-7所示。所示。 当当pH6.9时，时，溶菌酶带正电溶菌酶带正电，卵蛋白带

10、负卵蛋白带负 电，电，对照表对照表7-2和式（和式（7-6），），Kcl-KNa+， 产生电位差，产生电位差， U2 U1 0，相，相1电位小电位小 于相于相2电位，导致带正电荷的溶菌酶大量电位，导致带正电荷的溶菌酶大量 迁移到迁移到1相，相，其其K值增大值增大，而带负电荷的卵，而带负电荷的卵 蛋白迁移到蛋白迁移到2相，相，其其K值减少值减少，从而使溶菌，从而使溶菌 酶和卵蛋白得以较好地分离。可见酶和卵蛋白得以较好地分离。可见,在体在体 系中加入适当的盐类，会大大促进带相反系中加入适当的盐类，会大大促进带相反 电荷的两种蛋白质的分离。电荷的两种蛋白质的分离。 体系中体系中无机盐无机盐离子的影响

11、离子的影响 在在PEG/Dex体系中，无机盐离子在两相中也有不同的分配（见教材体系中，无机盐离子在两相中也有不同的分配（见教材表表7-2），）， 因此在两相间形成电位差。由于各相要保持电中性，这对带电生物大分子，因此在两相间形成电位差。由于各相要保持电中性，这对带电生物大分子， 如蛋白质和核酸等的分配，产生很大的影响。如蛋白质和核酸等的分配，产生很大的影响。 双水相分离理论双水相分离理论 影响分配平衡的参数影响分配平衡的参数 opH会会影响蛋白质中可离解基团的离解度影响蛋白质中可离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分，因而改变蛋白质所带电荷和分 配系数；另外，配系数；另外，pH还还影响系

12、统缓冲液磷酸盐的离解程度影响系统缓冲液磷酸盐的离解程度，影响，影响H2PO4- HPO42-的比例，影响相间电位差的比例，影响相间电位差U2 U1 ，从而影响分配系数。，从而影响分配系数。 对一种特定的蛋白质，在不同的盐对一种特定的蛋白质，在不同的盐 体系中，体系中，pH和其分配系数之间的关和其分配系数之间的关 系不同，但在等电点处，得到的均为系不同，但在等电点处，得到的均为 不带电时分子的分配系数。对不同的不带电时分子的分配系数。对不同的 盐系统，其等电点时的分配系数应相盐系统，其等电点时的分配系数应相 等，两条等，两条pH和分配系数关系的曲线和分配系数关系的曲线 必交于一点，该点对应的必交

13、于一点，该点对应的pH值即为值即为 该特定蛋白质的等电点。根据这一原该特定蛋白质的等电点。根据这一原 则可测定蛋白质的等电点，称为交错则可测定蛋白质的等电点，称为交错 分配法。分配法。 体系体系pH的影响的影响 双水相分离理论双水相分离理论 影响分配平衡的参数影响分配平衡的参数 o 温度影响相图，同时影响分配率温度影响相图，同时影响分配率 和蛋白质的生物活性。一般地，和蛋白质的生物活性。一般地， 临界点附近，温度对分配率的影临界点附近，温度对分配率的影 响较大，远离临界点时，影响较响较大，远离临界点时，影响较 小。小。 o 图图7-9为省掉冷却系统的室温操作为省掉冷却系统的室温操作 过程中各相

14、前后温度的变化。由过程中各相前后温度的变化。由 图图7-9可知，分离后上、下相的温可知，分离后上、下相的温 度上升不多，说明无冷却系统的度上升不多，说明无冷却系统的 室温操作是可行的。室温操作是可行的。 体系温度的影响体系温度的影响 双水相分离理论双水相分离理论 影响分配平衡的参数影响分配平衡的参数 对于同一种双水相体系，微生物也会影响体系上下相的比例以及胞内对于同一种双水相体系，微生物也会影响体系上下相的比例以及胞内 蛋白质在体系的分配系数。这种分配的差异主要是由蛋白质在体系的分配系数。这种分配的差异主要是由细胞破碎程度细胞破碎程度引引 起的，细胞壁和细胞膜不同的化学结构会导致体系上下比例的

15、改变。起的，细胞壁和细胞膜不同的化学结构会导致体系上下比例的改变。 体系中微生物的影响体系中微生物的影响 双水相萃取技术的应用双水相萃取技术的应用 o 双水相萃取分离的必要条件双水相萃取分离的必要条件 （1） 目标物目标物(酶酶)与细胞碎片应分配在与细胞碎片应分配在不同的相中。不同的相中。 （2） 分配系数分配系数应足够大，在一定的相体积比时，应足够大，在一定的相体积比时， 经过一次萃取，就能得到较高的收率。经过一次萃取，就能得到较高的收率。 （3） 两相用两相用离心离心/沉降法沉降法容易分离容易分离 o 萃取操作时的重要参数：萃取操作时的重要参数：单位重量相体系中细胞单位重量相体系中细胞 破

16、碎液的加入量破碎液的加入量（200400g/1kg萃取相体萃取相体 系系） 双水相萃取技术的应用双水相萃取技术的应用 胞内酶的提取和精制胞内酶的提取和精制 1. 双水相体系的组成主要为双水相体系的组成主要为PEG/盐；盐； 2. 酶主要分配在上相，菌体在下相或界面上酶主要分配在上相，菌体在下相或界面上 3. 料液中湿细胞含量可高达料液中湿细胞含量可高达30%，酶的提取率达，酶的提取率达90%以上以上 双水相萃取技术的应用双水相萃取技术的应用 胞内酶的提取和精制胞内酶的提取和精制 萃取流程萃取流程 萃取过程萃取过程： （1）萃取和平衡（在）萃取和平衡（在 混合混合-沉降罐沉降罐中进行）中进行）

17、（2）上下相的分离）上下相的分离 （离心分离离心分离/重力沉降重力沉降） （3）目标物与多聚物）目标物与多聚物 的分离（的分离（加盐加盐/调节调节pH） 可从发酵液提取酶，实可从发酵液提取酶，实 现现酶与菌体的分离酶与菌体的分离 还可将还可将酶与杂质及组成酶与杂质及组成 双水相的聚合物分开。双水相的聚合物分开。 或调节或调节pH 循环使用循环使用 双水相萃取技术的发展双水相萃取技术的发展 o双水相萃取的缺陷：双水相萃取的缺陷：目标物中含有少量的核酸和多糖。目标物中含有少量的核酸和多糖。 o双水相体系的改进：双水相体系的改进：在在PEG上引入上引入亲合基团或离子基团亲合基团或离子基团，得到，得到

18、 PEG衍生物。可以提高目的蛋白的衍生物。可以提高目的蛋白的纯度和收率纯度和收率。 例如例如 -干扰干扰 素素( -IFN)的提取：的提取：用一般的用一般的PEGDex体系，不能将体系，不能将 -干扰素干扰素 与主要杂蛋白分开，必须是具有带电基团或亲和基团的与主要杂蛋白分开，必须是具有带电基团或亲和基团的PEG衍生物衍生物 如如PEG-磷酸酯与盐的系统磷酸酯与盐的系统才能使才能使 -干扰素分配在上相，杂蛋白完全干扰素分配在上相，杂蛋白完全 分配在下相而得到分离。并且分配在下相而得到分离。并且 -干扰素的浓度越高，分配系数越大，干扰素的浓度越高，分配系数越大， 纯化系数甚至可高达纯化系数甚至可高

19、达350。这一技术已用于干扰素的回收，收率达。这一技术已用于干扰素的回收，收率达 90%， o萃取操作方式的改进：萃取操作方式的改进：采用多级萃取的方法。例如采用多级萃取的方法。例如 人生长激素人生长激素 的提取的提取 双水相萃取技术的发展双水相萃取技术的发展 人生长激素的提取人生长激素的提取 用用PEG4000 6.6磷酸盐磷酸盐14 体系从体系从E.co1i碎片中提取人生长碎片中提取人生长 激素激素(hGH)，当，当pH值值=7及菌体及菌体 含量为含量为1.35(wv)干细胞，混干细胞，混 合合5-10秒钟后，即可达到萃取秒钟后，即可达到萃取 平衡平衡hGH分配在上相，其分分配在上相，其分

20、 配系数高达配系数高达6.4，相比为，相比为0.2，收，收 率大于率大于60，对蛋白的纯化系，对蛋白的纯化系 数为数为7.80。如若进行三级错流萃。如若进行三级错流萃 取，见图取，见图4-4，总收率可达，总收率可达81， 各种萃取方法的比较各种萃取方法的比较 o 1、共同点 o 萃取的实质是通过溶质在两相中的竞争性溶解而实 现的； o 操作步骤主要是混合萃取、分离、萃取剂回收； o 萃取剂的选择原则是“相似相溶”，萃取剂应满足 的要求是有很大的萃取容量、有良好的选择性、分 离程度高、与被萃取相互溶度小、萃取剂回收和再 生容易、经济安全等。 各种萃取方法的比较各种萃取方法的比较 项目溶剂萃取超临

21、界流体萃取双水相萃取 常用萃取剂酯类、酮类、醇类SC-CO2PEG/DEX，PEG/盐 影响因素pH、温度、盐析、带 溶剂等 超临界流体的临界温度、压力， 与溶质分子的相似性等 聚合物，无机盐离子， pH，温度，体系中的微 生物等 乳化现象有无无 优缺点比化学沉淀法分离程 度高，比离子交换法 选择性好、传质快， 比蒸馏法能耗低，生 产能力大、周期短、 便于连续操作。 兼有蒸馏和溶剂萃取优点，能 自由的改变萃取剂对物质的溶 解能力，混合、分离、萃取剂 回收都能在低温下进行等 可直接从细胞破碎匀浆 液中萃取蛋白质而无需 将细胞碎片分离，改变 pH和电解质浓度可进行 反萃取，重复性好，易 于放大等 应用大多数物质的提取主要用于生物活性物质和生物 制品的提取，超临界状态下的 酶促反应，细胞破壁等 主要用于胞内酶的提取 双水相萃取技术双水相萃取技术 概述概述 双水相分离理论双水相分离理论 双水相萃取技术的应用双水相萃取技术的应用 双水相萃取技术的发展双水相萃取技术的发展 双水相分离理论双水相分离理论 影响分配平衡的参数影响分配平衡的参数 pH会会影响蛋白质中可离解基团的离解度影响蛋白质中可离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分，因而改变蛋白质所带电荷和分 配系