第一章 酶学与酶工程 (6~7节)

1、Enzyme Engineering 酶工程 第一章第一章 酶学与酶工程酶学与酶工程 n第六节第六节 影响酶活力的因素影响酶活力的因素 n第七节第七节 酶的分离纯化酶的分离纯化 第六节第六节 影响酶活力的因素影响酶活力的因素 一、一、 酶活力的测定酶活力的测定 酶活力（enzyme activity）也称为酶活性， 是指酶催化一定化学反应的能力。 1. 酶活力与酶反应速度 酶活力的大小可以用一定条件下所催化的 某一化学反应的反应速度（reaction velocity）来 表示，两者呈线性关系。 酶反应速度可用单位时间内底物的减少量 或产物的增加量来表示。 Time 2. 酶的活力单位（U，a

2、ctivity unit） 酶活力的大小及酶含量的多少，用酶活力单位表 示，即酶单位（U）。酶单位的定义是：在一定条件 下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶 量。这样酶的含量就可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂 含有多少酶单位来表示（U/g或U/ml）。 1961年国际酶学委员会规定“国际单位”表示酶活力； 一个国际单位（IU）是指在最适反应条件下，1每分钟催 化1 moL底物转化为产物所需要的酶量。 1972年又推荐一种新的酶活力单位Katal（简 称Kat）单位。一个katal单位是指在最适反应条件下， 1每秒钟催化1moL底物转化为产物所需要的酶量。 1Kat6107IU，1IU

3、=16.7nKat 3. 酶的比活力（specific activity） 酶的比活力代表酶的纯度，国际酶学委员会规定 比活力用每mg蛋白质所含有的酶活力单位数表示。对 同一种酶比活力愈大，纯度愈高。 4. 酶的转换数：Kcat值 Kcat值以一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的 分子数来表示酶的催化效率。 5. 酶活力的测定方法 （1）分光光度法（spectrophotometry） （2）荧光法（fluorometry） （3）同位素测定方法 （4）电化学方法（electrochemical method） 二、影响酶活力的因素二、影响酶活力的因素 1.底物浓度底物浓度 随着酶反应的进行，

4、底物浓度逐渐下降，产物逐渐积 累，酶反应速度也会逐渐变小。为了排除底物和产物浓 度变化对酶反应速度的影响，人们采用酶反应的初速度 作为衡量的指标。 2、酶浓度、酶浓度 在底物浓度饱和的情况下，酶浓度的加倍将导 致V0 的加倍，即V0与酶浓度的关系图为直线图形。 3、温度、温度 温度对酶反应速率的影响表现在两个方面， 一方面是当温度升高时，与一般化学反应一样， 反应速率加快。反应温度提高10，其反应速率 与原来反应速率之比称为反应的温度系数，用 Q10表示，对大多数酶来讲温度系数Q10多为2 ， 也就是说，即温度每升高10 ，酶反应速率为 原反应速率的2倍。另一方面由于酶是蛋白质， 随着温度升高

5、，使酶蛋白逐渐变性而失活，引起 酶反应速率下降。 在较低的温度范围内，酶反应速率随温度升 高 而增大，但超过一定温度后，反应速率反而下降， 因此只有在某一温度下，反应速率达到最大值，这 个温度就称为酶反应的最适温度（opptimum temperature)。每种酶在一定条件下都有其最适 温度。 v t/0C 最适温度 4 、 pH 酶的活力受环境p的影响，在一定p下， 酶表现最大活力，高于或低于此p，酶活力降低， 通常把表现出酶最大活力的p称为该酶的最适p （optimum pH) 各种酶在一定条件下都有其最特定的最适pH， 因此最适pH是酶的特性之一。但酶的最适pH不是 一个常数，受许多因

6、素影响，随底物种类和浓度、 缓冲液种类和浓度的不同而改变，因此最适pH只 有在一定条件下才有意义。 pH影响酶活力的原因可能有以下几个方面： （1） 过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，引起 酶构象的改变，酶活性丧失。 （2） 当pH改变不很剧烈时，酶虽未变性，但活 力受到影响。 （3）pH影响维持酶分子空间结构的有关基团解离， 从而影响了酶活性部位的构象，进而影响酶的活性。 5、 激活剂对酶反应的影响激活剂对酶反应的影响 凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂 (activator)，其中大部分是无机离子或简单的有机 化合物。作为激活剂的金属离子有K+、Na2+ 、 Ca2+ 、 Mg2+ 、 Z

7、n2+ 及 Fe3等离子，无机阴离子如：Cl- 、 Br- 、 I- 、 CN- 、 PO43- ，氢离子，中等大小的有机 分子以及具有蛋白质性质的大分子物质等都可作为 激活剂。 激活剂对酶的作用具有一定的选择性，即一种 激活剂对某种酶起激活作用，而对另一种酶可能起 抑制作用；有时离子之间有拮抗作用；有时金属离 子间也可互相替代。 第七节 酶的分离纯化 一.分离纯化酶的原则 设计酶的纯化方案时要考虑到应用，下 列各点是应认真遵循的原则： 第一，要注意防止酶变性失效，这一点在 纯化的后期更为突出。 第二，从理论上说，凡是用于蛋白质分离 纯化的一切方法都同样适用于酶。 第三，酶具有催化活性，检测酶

8、活性可以 跟踪酶的来龙去脉，为酶的抽提、纯化以及 制剂过程中选择适当的方法与条件提供直接 的依据。 二二. .防止酶变性失效的方法防止酶变性失效的方法 (1)除了少数例外，所有操作都应在低温条件下 进行，尤其是在有机溶剂存在的情况下更应特别小 心。 (2)大多数酶在pH10的情况下不稳定， 故必须控制整个系统不要过酸过碱；同时要避免在 调整pH时产生局部酸碱过量的现象。 (3)酶和其它蛋白一样，常易在溶液表面或界面 处形成薄膜而变性，故操作中应尽量减少泡沫形成。 (4)重金属等能引起酶失效，有机溶剂能使酶变 性,微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破 坏，所有这些也都应予以足够的重视。 n

9、整个纯化工作包括三个基本环节：抽提、纯 化和精制。 n常用的抽提方法除细胞自溶外，还有有机溶 剂或表面活性剂处理等化学方法；近年来为 适应日益增多的胞内酶分离提纯的需要，发 展和设计了不少细胞或菌体的破碎设备，如 超声波振荡器、高压喷挤设备、匀浆装置及 振动球磨。 三、纯化方法 酶分离纯化工作是酶学研究的重要组成部分，亦 是酶制剂工业生产的主要内容。要研究或使用一个 酶，就得采用分离纯化方法去得到它。酶的化学本 质是蛋白质，所以用于蛋白质的分离纯化方法一般 都适用于酶的分离纯化。此外根据酶与底物、底物 结构类似物、辅助因子、抑制剂等的特异亲和力， 可发展酶独特的亲和色谱技术。 整个纯化工作包括

10、三个基本环节：抽提、纯化和 精制。如果欲分离的目标分子是细胞内产物，首先 涉及的是细胞的破碎，接下来的分离过程可分成粗 分离和精制分离。 n（一）酶的抽提 n抽提的要求是将尽可能多的酶、尽量少的杂质从 原料引入溶液。 1. 预处理 过去多用动物或植物的器官组织作为酶的来 源，近年来则主要采用微生物作材料。但是不管 什么原料，通常都需要先进行适当的预处理。例 如，动物材料要剔除结缔组织、脂肪组织；油质 种子最好先用乙醚等脱脂；种子研磨前应去壳， 以免丹宁等物质着色污染；微生物材料则应将菌 体和发酵介质分离。经过这些处理后，材料须尽 可能以非常新鲜的状态直接应用，否则就应将完 整材料立即冰冻起来。

11、 2. 破碎细胞 酶根据它的分布可分为细胞内酶和细胞外酶， 根据它的存在状态，即是否与细胞内的颗粒体或 膜结合，细胞内酶又可分为结酶与溶酶。细胞外 酶没有破细胞问题；但是细胞内酶却只有在细胞 破裂后才能释放出来，而且抽提效果也往往与细 胞破碎程度有关。至于结酶，还有一个切断它与 颗粒体或膜的连结问题。 破碎细胞的手段： 动、植物材料： 通常用绞肉机作成组织糜，如果需要破碎得更彻底 些，可用高速组织捣碎器捣碎，或者加砂研磨。高 速捣碎器操作简便、破碎效果好，但易引起局部温 度过高，导致酶失效，故必须考虑酶的特点谨慎使 用。加砂研磨，特别是用玻璃粉或氧化铝代替砂时， 要注意有时可能发生吸附变性。在

12、上述机械处理后， 为了有利于下一步抽提，还可进一步作成丙酮干粉， 或者进行反复冰冻融解处理，量少时，某些组织还 可采用匀浆器将细胞研磨破碎。 微生物材料： 不同的微生物材料处理的方法与难易程度也各有 差异。 霉菌材料比较容易，可通过机械剪切、研磨或加 细胞壁溶解酶解决。 细菌，少量材料常用超声波破碎器和溶菌酶等处 理；大量材料通常采用丙酮干粉法，或采用自溶 法。 酵母细胞壁厚较难对付，过去多用自溶法，现在 可采用的办法有： (1)细胞壁溶解酶处理法； (2)盐振荡法； (3)冷热破壁法。 3. 抽提 细胞破碎后，可采用两种方式进行抽提： 一是“普遍”抽提； 二是先后用不同溶剂进行选择性抽提。

13、抽提条件的选择： 由于大多数酶属于球蛋白类，因此一般部可 以用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液进行抽提。但抽 提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶 解性、稳定性以及有利于切断酶和其它物质的联 系。需要考虑的因素有： pH；盐；温度；其它。 a. pHa. pH 首先应考虑酶的酸碱稳定性，选择的pH不应超出酶 的稳定范围； 其次从最佳的抽提效果着眼，最好远离待抽提酶的 等电点。也就是说，酸性蛋白质宜用碱性溶液抽提， 碱性蛋白质宜用酸性溶液。例如，肌肉甘油醛 3磷酸脱氢酶以稀碱抽提时产量较高，胰蛋白酶 选用0.25N硫酸。 第三，在某些情况下抽提还要兼顾到有利于切断酶 和细胞内其它成分间可能的联系，

14、从这点考虑以选 用pH46为佳。 b. b. 盐盐 大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解 度，所以抽提液一被采用等渗盐溶液。最普通的 加0.0200.050M的磷酸缓冲液、0.15MNaCl等。 焦磷酸钠和柠檬酸钠的缓冲有助于切断酶和其它 物质的连系，并有络合某些金属的作用，因此用 得也很多。 少数情况用水抽提效果亦佳，如霉菌脂肪酶的抽 提，这可能与低渗可破坏细胞结构有关. c. 其它 在破细胞后，某些亚细胞结构也往往受到损伤，这 样就可能给抽提系统带来各种不稳定因素。为此， 有时还需要在抽提液中加入某些物质。 例如，为防止蛋白酶的破坏性水解作用可加入苯甲 基磺酰氟；为防止氧化等因素的影

15、响可加入半胱氨 酸、惰性蛋白和底物等。 抽提液的用量： 通常采用原料量的l5倍，有时为了抽提效果好些， 要反复抽提，液量可能大些。 4. 固体成份除去： 抽提后的细胞残渣或发酵液的固体成份多可 用离心法或压滤法除去。植物原料的抽提液在 冷室中放置过夜往往就会自动澄清。某些情况 下，在抽提液离心时加入氢氧化铝凝胶或磷酸 钙胶等物质 , 有助于除去悬浮的胶体物质。 （二）（二） 浓缩浓缩 抽提液和发酵液中酶的浓度一般都很低,所 以在进行纯化前须先加以浓缩。常用的浓缩方 法有： 1. 蒸发； 2. 超过滤； 3. 胶过滤；4. 冰冻浓缩； 5. 其它 1 蒸发 减压蒸发浓缩除了效率低、费时外，有时还

16、 要加热，同时也可能产生泡沫，因此对稳定性 差的酶不适宜。另外，蒸发过程可能产生增色 现象，达也影响产品质量。 超蒸发法，即让暖空气流通过冷的酶溶液表 面,或让暖空气流通过装有酶液的透析袋使之 加速蒸发，但此法效率不佳。 薄膜蒸发浓缩法（现在多采用的方式），即 使待浓缩的酶溶液在高度真空条件下变成极薄 的液膜，同时使之与大面积热空气接触，其中 水分就能瞬时蒸发而达到浓缩的目的。 由于水分蒸发时能带走部分热量，所以只要 真空条件好，酶在浓缩过程中实际受到的热作 用并不太强，可用于热敏性酶类的浓缩。薄膜 蒸发浓缩器有三种形式：升膜、降膜和刮板。 对于较粘稠的样品，后一种形式似乎更为适合， 不过薄膜

17、浓缩也往往会带来增色现象。 2 超过滤 在加压情况下，将待浓缩溶液通过一层只容 许水分子和小分子选择性地透过的微孔超滤膜, 而酶等大分子被滞留,从而达到浓缩目的的一种 有效方法。 优点：没有热破坏，没有相变化，保持原来 的离子强度和pH。只要膜选择适当,浓缩过程还 可能同时进行粗分,此外成本也不高,已渐渐为 人们所采用。超过滤可用于小量样品,也可用于 工业生产规模。 注意：超滤膜有干型和湿型两种，后者必须 保持于溶液中。 3 胶过滤 这是利用葡聚糖凝胶sephdex G25或G 50等能吸水膨润、而酶等大分子被排阻于胶 外的原理进行的浓缩。通常采用“静态”方 式，即将干胶直接加入样品溶液（干胶

18、用量 可根据胶的吸水量计算），胶吸水膨润一定 时间后，再借助过滤或离心等办法分离浓缩 的酶液。胶过滤浓缩法的优点是，条件温和， 操作简便，也没有pH与离子强度等的改变。 4 冰冻浓缩 原理:溶液相对纯水融点升高,冰点降低。这 有两种方式： 1.先将溶液冻成冰块。然后使之缓缓融解， 这样几乎不含蛋白质和酶的冰块就浮于液面,而 酶等则融解并集中于下层溶液(约为原体积的1 4); 2.让酶溶液缓缓冻凝，尔后移去水形成的冰 块. 问题:浓缩过程可能会发生离子强度与pH的变 化,从而导致酶失效；其次是需要大功率的致冷 设备. 5. 其它 还有聚乙二醇等浓缩法，它们 一般只适用小量样品，而且往往 成本很高。 （三）酶的纯化（三）酶的纯化 在抽提液中,除了待纯化的酶外,通常不可避免地杂 有其它小分子和大分子物质.其中小分子杂质在以后的 纯化步骤中一般会自然地除去,因此比较容易解决;大 分子物质包括核酸,粘多糖和其它蛋白质.核酸和粘多 糖往往干扰以后的纯化,特别是细菌等的抽提液中常会 有大量核酸,最好设法预先除去.核酸可加硫酸链霉素, 聚乙烯亚胺,色精蛋白或MnC