实验4微生物的分离与平板菌落计数法

1、实验四 微生物的分离与平板菌落计数法 【实验目的】 了解利用平板菌落计数法测定微生物 样品 中活细胞原理。 掌握掌握平板菌落计数的操作步骤与 方法。 【实验原理】 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀 释之后，取一定量的稀释样品液接种到 平板上，经培养后，每个单细胞繁殖形 成肉眼可见的菌落，选择每板上菌落数 在3030300300之间的平板统计菌落数，用平 板上(内)出现的菌落数乘上菌液的稀释 度，即可计算出原菌液的含菌数。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需 要培养一段时间才能取得，而且测定结 果易受多种因素的影响。 但是，由于该计数方法的最大优点是可 以获得活菌的信息，所以被广泛用于生 物制

2、品检验，以及食品、饮料和水等的 含菌指数或污染程度的检测。 【材料和器皿】 菌种：培养8h的大肠杆菌。 培养基 ：LB培养基。 器皿：无菌试管，无菌移液管，无菌平 皿等。 其他：无菌生理盐水，试管架，记号笔。 【方法和步骤】 融化培养基 先将LB固体培养基加热融化，置于50度水浴 锅中备用。 倒培养液 将固体培养基融化并冷却至45左右倒入加 好样品的平皿中，每平皿约倒入1012ml培 养基，随即快速而轻巧地晃动培养皿，注意 不要使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。 编号 8支试管依次编号为10-1，10-8,再取 平板，依次编号为10-6,10-7,10-8，各 稀释浓度3个重复。 分装稀释液 以

3、无菌操作法用5ml移液管分别吸取4.5ml无 菌水，与上述编号的试管中。 稀释菌液 用1ml无菌吸管吸取0.5ml已充分混匀的待测 菌液，转入101的试管中，此即为10倍稀 释。另取一支1ml洁净无菌吸管插入101试 管中，来回吹吸菌悬液数次，将菌体分散均 匀。用此吸管吸取101菌液0.5 ml移至10 2试管中，此即为100倍稀释。其余以此 类推，整个过程如图所示。 平板菌落计数法的稀释流程示意图平板菌落计数法的稀释流程示意图 转移菌液 用一支1ml无菌吸管吸取10-6,10-7,10-8的稀 释菌悬液各0.2ml，向已编好号的无菌平皿。 用涂布器涂匀。 倒置培养 待平板完全凝固后，倒置于3

4、7恒温箱中培 养。 计菌落数 培养24、48h、72后，取出平板，算出同一稀 释度三个平板上的菌落平均数，在平板菌落计 数中，可用彩色笔或钢笔在皿底点涂菌落进行 计数，以防漏计和重复。实际工作中同一稀释 度重复对照平板不能少于三个，且同一稀释 度的三个重复对照的菌落数不应相差很大， 否则说明试验误差太大。 由106、107、108三个稀释度计算出 的每ml菌液中菌落形成单位数也不应相差 太大。平板菌落计数法，所选择倒平板的 稀释度是很重要的，培养后所出现的平均 菌落数小于100个左右为好，否则要适当增 加或减少稀释度加以调整。 【结果记录】 下面的表格是对一个培养时间菌液的平板计 数结果的记录表格，其余培养时间菌液的计 数表格请依此自行制作，将菌落计数结果填 入表格： 稀释 度 培养 时间 （h） 每皿菌落数 （个） 每稀释度 平均数 （个） 活菌数/ml 菌液 （个） X1X2X3 106 （7 or 8） 24 48 72 X1X2+X3 3 活菌数(个) /ml菌液 稀释倍数5 100 【注意事项】 吸入菌液时移液管要伸入管底，吹出时 一定要离开液面，以免使试管内液体外 溢。 菌液移至下一稀释度试管时注意勿使移液管 尖段触到液面，即每一支移液管只能接触一 个稀释