微生物检验培养基质量控制技术

1、浙江省食品药品检验所抗生素室浙江省食品药品检验所抗生素室 李珏李珏 2009.6.30 微生物检验培养基质量控制技术微生物检验培养基质量控制技术 培养基质量的重要性培养基质量的重要性 培养基是微生物试验的基础，直接影培养基是微生物试验的基础，直接影 响微生物试验结果。适宜的培养基制响微生物试验结果。适宜的培养基制 备方法、贮藏条件和质量控制试验是备方法、贮藏条件和质量控制试验是 提供优质培养基的保证。提供优质培养基的保证。 主主 要要 内内 容容 l培养基制备、使用、贮存中的注意事项培养基制备、使用、贮存中的注意事项 l培养基质量控制培养基质量控制 2010版药典附录版药典附录 实例（培养基质

2、量对实验结果的影响）实例（培养基质量对实验结果的影响） CHP与与USP的异同点的异同点 同行的方法介绍同行的方法介绍 新技术新技术 l部分菌种在培养基上的典型特征部分菌种在培养基上的典型特征 培养基制备过程中的注意事项培养基制备过程中的注意事项 培养基的水化培养基的水化 培养基水化时不得用铜锅或铁锅培养基水化时不得用铜锅或铁锅,以防有离以防有离 子混入培养基中子混入培养基中,影响微生物的生长；影响微生物的生长； 配制培养基最常用的溶剂是纯化水配制培养基最常用的溶剂是纯化水 ,不能含不能含 有任何可能抑制或影响微生物生长的物质；有任何可能抑制或影响微生物生长的物质； 培养基制备过程中的注意事项

3、培养基制备过程中的注意事项 培养基的溶解培养基的溶解 在培养基分装灭菌前在培养基分装灭菌前,各成分应溶解均各成分应溶解均 匀匀, 使用电炉等设备煮沸培养基时使用电炉等设备煮沸培养基时,应应 用小火加热用小火加热,并边加热边搅拌并边加热边搅拌,避免培避免培 养基焦化或爆沸溢出。养基焦化或爆沸溢出。 培养基制备过程中的注意事项培养基制备过程中的注意事项 培养基的灭菌培养基的灭菌 已配制好的培养基必须立即灭菌已配制好的培养基必须立即灭菌 湿热灭菌必须严格控制灭菌温度和时湿热灭菌必须严格控制灭菌温度和时 间间 培养基制备过程中的注意事项培养基制备过程中的注意事项 培养基的培养基的pH 微生物必须在适宜

4、的微生物必须在适宜的pH范围内才能正常生长繁范围内才能正常生长繁 殖殖 或体现其生物特性。或体现其生物特性。 调整培养基的调整培养基的pH,应用应用1 mol/LNaOH或或1 mol/L HCl调整调整pH，一般灭菌前比最终，一般灭菌前比最终pH高高0.20.3。 培养基制备过程中的注意事项培养基制备过程中的注意事项 培养基的保温培养基的保温 灭菌以后培养基应该迅速冷却至所灭菌以后培养基应该迅速冷却至所 需温度需温度,避免长时间保存在灭菌锅内避免长时间保存在灭菌锅内, 造成过度灭菌造成过度灭菌,影响培养基的营养成影响培养基的营养成 分或选择性效果。分或选择性效果。 培养基使用过程中的注意事项

5、培养基使用过程中的注意事项 培养基的接种培养基的接种 平板在接种使用时平板在接种使用时,表面必须无明表面必须无明 显潮湿水珠；显潮湿水珠； 对于保存的培养基对于保存的培养基,需待温度回复需待温度回复 至室温后才可使用至室温后才可使用,并且使用前应并且使用前应 检查；检查； 培养基贮存过程中的注意事项培养基贮存过程中的注意事项 干燥培养基干燥培养基 应遵循先入先出的原则；应遵循先入先出的原则； 贮存于阴凉干燥处贮存于阴凉干燥处,避免强光直射；避免强光直射； 培养基贮存过程中的注意事项培养基贮存过程中的注意事项 已配制的培养基已配制的培养基 建议平板倾注后立即使用；建议平板倾注后立即使用； 在平板

6、上标上制备日期和在平板上标上制备日期和/或有效期或有效期 和名称；和名称； 固体培养基灭菌后的再融化只允许固体培养基灭菌后的再融化只允许 一次一次 ； 实实 例例 三糖铁培养基（三糖铁培养基（TSI） 未校正未校正pH时，不同厂家的时，不同厂家的TSI培养基产培养基产 硫化氢强度不一；硫化氢强度不一； 校正校正pH7.5后，后，各培养基硫化氢反应均各培养基硫化氢反应均 有改善有改善,不同厂家的不同厂家的TSI培养基产硫化氢培养基产硫化氢 强度仍不相同强度仍不相同； 实实 例例 三糖铁培养基（三糖铁培养基（TSI） 由于培养基由于培养基pH太低太低, 本身就是黄色本身就是黄色,细菌细菌 生长后下

7、层仍为黄色生长后下层仍为黄色, 而斜面变为橙红而斜面变为橙红 色色,易误判断为下层易误判断为下层“ 变为变为黄色黄色” 。由。由 此定为发酵菌，造成误判此定为发酵菌，造成误判； 培养基质量控制（培养基质量控制（2010版药典）版药典） 培养基适用性检查培养基适用性检查 计数培养基计数培养基 控制菌检查用控制菌检查用 培养基培养基 计数培养基适用性检查计数培养基适用性检查 对照培养基对照培养基 系指按培养基处方特别系指按培养基处方特别 制备、质量优良的培养基，用于培养制备、质量优良的培养基，用于培养 基适用性检查。由中国药品生物制品基适用性检查。由中国药品生物制品 检定所研制及分发。检定所研制及

8、分发。 计数培养基适用性检查计数培养基适用性检查 大肠埃希菌大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 白色念珠菌白色念珠菌 黑曲霉黑曲霉 白色念珠菌白色念珠菌 营养琼脂培养基营养琼脂培养基 玫瑰红钠琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基 酵母浸出粉胨葡萄糖酵母浸出粉胨葡萄糖 琼脂培养基琼脂培养基 计数培养基适用性检查计数培养基适用性检查 结果判定结果判定 被检培养基上的菌落平均数被检培养基上的菌落平均数 对照培养基上的菌落平均数对照培养基上的菌落平均数 菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致 计数培养基计数培养基 70% 控制菌检查用培养基

9、适用性检查控制菌检查用培养基适用性检查 促生长能力促生长能力 抑制能力抑制能力 指示能力指示能力 检查项目检查项目 控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用培养基适用性检查 增菌培养基促生长能力检查：分别接增菌培养基促生长能力检查：分别接 种不大于种不大于100cfu 的试验菌于被检培养的试验菌于被检培养 基和对照培养基中，在相应控制菌检基和对照培养基中，在相应控制菌检 查规定的培养温度及查规定的培养温度及最短培养时间最短培养时间下下 培养。与对照培养基管比较，被检培培养。与对照培养基管比较，被检培 养基管养基管试验菌应生长良好。试验菌应生长良好。 控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用培养

10、基适用性检查 固体培养基促生长能力检查：取试验固体培养基促生长能力检查：取试验 菌各菌各0.1ml（含菌数（含菌数50100cfu）分别）分别 涂布涂布于被检培养基和对照培养基平板于被检培养基和对照培养基平板 上，在相应控制菌检查规定的培养温上，在相应控制菌检查规定的培养温 度及最短培养时间下培养。被检培养度及最短培养时间下培养。被检培养 基与对照培养基生长的基与对照培养基生长的菌落大小形态菌落大小形态 特征应一致。特征应一致。 控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用培养基适用性检查 培养基抑制能力检查：接种不少于培养基抑制能力检查：接种不少于100cfu 的试验菌于被检培养基中，在相应控制

11、菌的试验菌于被检培养基中，在相应控制菌 检查规定的培养温度及检查规定的培养温度及最长时间最长时间下培养，下培养， 试验菌应不得生长。试验菌应不得生长。 控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用培养基适用性检查 固体培养基指示能力检查：取试验菌固体培养基指示能力检查：取试验菌 各各0.1ml（含菌数不大于（含菌数不大于100cfu）分）分 别涂布于被检培养基和对照培养基平别涂布于被检培养基和对照培养基平 板上，在相应控制菌检查规定的培养板上，在相应控制菌检查规定的培养 温度及时间下培养。温度及时间下培养。被检培养基中试被检培养基中试 验菌生长的菌落形态、大小、指示剂验菌生长的菌落形态、大小、指示

12、剂 反应情况等应与对照培养基一致。反应情况等应与对照培养基一致。 控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用培养基适用性检查 液体培养基指示能力检查：分别接种液体培养基指示能力检查：分别接种 不大于不大于100cfu 的试验菌于被检培养基的试验菌于被检培养基 和对照培养基中，在相应控制菌检查和对照培养基中，在相应控制菌检查 规定的培养温度及最短培养时间下培规定的培养温度及最短培养时间下培 养。养。与对照培养基管比较，被检培养与对照培养基管比较，被检培养 基管试验菌生长情况、指示剂反应等基管试验菌生长情况、指示剂反应等 应与对照培养基一致。应与对照培养基一致。 培养基质量控制（培养基质量控制（20

13、10版药典）版药典） 实验室配制的培养基的常规监控项目实验室配制的培养基的常规监控项目 pH 适用性检查试验适用性检查试验 定期的稳定性定期的稳定性 检查以确定有效期检查以确定有效期 培养基质量控制（培养基质量控制（ CHP与与USP的异同点）的异同点） 计数培养基的适用性检查：计数培养基的适用性检查： CHP USP 菌种的选择菌种的选择 大肠埃希菌大肠埃希菌 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 结果判定结果判定 比值大于比值大于70% 1/2 2 培养基培养基 营养琼脂培养基营养琼脂培养基 大豆消化酪素培养基大豆消化酪素培养基 玫瑰红钠琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基 沙氏葡萄糖培养基沙氏葡萄糖培养基

14、酵母浸出粉胨葡萄糖酵母浸出粉胨葡萄糖 琼脂培养基琼脂培养基(YPD) 培养基质量控制（培养基质量控制（ CHP与与USP的异同点）的异同点） 控制菌检查用培养基的适用性检查：控制菌检查用培养基的适用性检查： CHP与与USP方法基本一致，检查用培养基不同。方法基本一致，检查用培养基不同。 同行的方法介绍同行的方法介绍 培养基质量控制培养基质量控制 理化试验方法理化试验方法 包括测定培养基的包括测定培养基的pH值和凝胶强度值和凝胶强度 微生物学方法微生物学方法 包括固体培养基和液体培养基包括固体培养基和液体培养基 同行的方法介绍同行的方法介绍 固体培养基固体培养基 定量质控定量质控 采用倾注平板

15、法、涂布法、采用倾注平板法、涂布法、 划线法划线法(半定量法半定量法) 、改良的、改良的MilesMisra 法等测定生长情况；法等测定生长情况； 定性质控定性质控 评价目标微生物非目标微生评价目标微生物非目标微生 物接种以后的生长情况物接种以后的生长情况 ； 同行的方法介绍同行的方法介绍 液体培养基液体培养基 采用定量稀释法采用定量稀释法,用目标菌和杂菌的混用目标菌和杂菌的混 合合 菌株评价选择性增菌培养基的选择性；菌株评价选择性增菌培养基的选择性； 利用利用OD 值评价液体培养基生长率；值评价液体培养基生长率； 同行的方法介绍同行的方法介绍 分值计算分值计算 质量比较质量比较 新技术介绍新

16、技术介绍 BioBall 是一个很小的水溶性球状物，包含是一个很小的水溶性球状物，包含 了数量精确的微生物个体，它可以了数量精确的微生物个体，它可以 使微生物质控中的定量控制达到非使微生物质控中的定量控制达到非 常高的精确度。常高的精确度。 新技术介绍新技术介绍 BioBall 目前可以提供超过目前可以提供超过25种菌株；种菌株； 可应用于培养基质控、方法验证等可应用于培养基质控、方法验证等 需要定量质控的各个领域；需要定量质控的各个领域； 新技术介绍新技术介绍 BioBall SingleShot 提供提供1次精确接种量次精确接种量 BioBall MultiShot-550 提供提供10次精确接种量次精确接种量 新技术介绍新技术介绍 BioBall SingleShot 每个每个BioBall SingleShot都含都含28至至33cfu； 标准误差小于或等于标准误差小于或等于3cfu； 新技术介绍新技术介绍 BioBall与常规稀释法相比的优势与常规稀释法相比的优势 使用方便；使用方便； 精确的精确的cfu数量；数量； 不同批次间不同批次间cfu数量稳定；数量稳定； 减少了由于接种量的变化，造成的质控失减少了由于接种量的变化，造成的质控失 败的风