实验3 化脓性球菌的分离鉴定

1、微生物学教研室微生物学教研室 郭棵棵郭棵棵 录像：录像：消毒灭菌消毒灭菌 操作：操作： 紫外线杀菌实验（普通平板紫外线杀菌实验（普通平板 1 1块块/3/3人）人） 抗生素敏感试验（普通平板抗生素敏感试验（普通平板 1 1块块/3/3人）人） 化脓性球菌分离鉴定（一）化脓性球菌分离鉴定（一） 接种血平板接种血平板 材料：材料： 抗生素纸片抗生素纸片（青霉素、链霉素、庆大霉素、黄连素（青霉素、链霉素、庆大霉素、黄连素 1 1套套/6/6人）人） 大肠杆菌、敏感金葡菌（大肠杆菌、敏感金葡菌（1 1支支/6/6人）人） 脓汁标本（乙型链球菌、致病性金葡菌脓汁标本（乙型链球菌、致病性金葡菌 各各1 1

2、支支/6/6人）人） 1.1. 普通平板、血平板、黑纸片等普通平板、血平板、黑纸片等 实验内容实验内容 了解：各种消毒灭菌的方法及应用了解：各种消毒灭菌的方法及应用 无菌操作技术无菌操作技术 掌握：掌握：1.1.化脓性球菌分离鉴定的方法和步骤化脓性球菌分离鉴定的方法和步骤 2.2.紫外线杀菌的原理紫外线杀菌的原理 3.3.抗生素敏感实验的方法抗生素敏感实验的方法 教学目标教学目标 重点难点重点难点 重点：化脓性球菌分离鉴定重点：化脓性球菌分离鉴定接种血平板接种血平板 难点：化脓性球菌分离鉴定难点：化脓性球菌分离鉴定接种血平板接种血平板 消毒与灭菌消毒与灭菌 概念：概念： 消毒消毒( disin

3、fection):( disinfection):杀死物体上病原微生物，杀死物体上病原微生物， 并不一定能杀死含芽孢的细菌和非病原微生物。并不一定能杀死含芽孢的细菌和非病原微生物。 用以消毒的药品称为消毒剂。用以消毒的药品称为消毒剂。 灭菌灭菌(sterilization):(sterilization):杀灭物体上所有微生物的杀灭物体上所有微生物的 方法。方法。 防腐防腐(antisepsis):防止或抑制细菌生长繁殖的方法，防止或抑制细菌生长繁殖的方法， 细菌一般不死亡。同一种化学药品在高浓度时称细菌一般不死亡。同一种化学药品在高浓度时称 为消毒剂，低浓度时为防腐剂。为消毒剂，低浓度时为防

4、腐剂。 无菌无菌(asepsis):不含活菌的意思。防止细菌进入人不含活菌的意思。防止细菌进入人 体或其他物品的操作技术，称无菌操作。体或其他物品的操作技术，称无菌操作。 热力灭菌法热力灭菌法 湿热灭菌法：巴氏消毒法、流动蒸汽消毒法、湿热灭菌法：巴氏消毒法、流动蒸汽消毒法、 煮沸法、间歇蒸汽灭菌法、煮沸法、间歇蒸汽灭菌法、高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法 干热灭菌法：焚烧、烧灼、干烤干热灭菌法：焚烧、烧灼、干烤 电磁波辐射杀菌法电磁波辐射杀菌法 紫外线紫外线 电离辐射电离辐射 滤过除菌法滤过除菌法 超声波杀菌超声波杀菌 干燥干燥 物理消毒灭菌法：物理消毒灭菌法： 化学消毒灭菌法：化学消毒灭菌法：使

5、用消毒剂使用消毒剂 原理：原理： 1.1.使菌体蛋白质变性或凝固：酚类、醇类、重金属使菌体蛋白质变性或凝固：酚类、醇类、重金属 盐等。如石炭酸、来苏、洗必泰盐等。如石炭酸、来苏、洗必泰 2.2.干扰细菌的酶系统和代谢：氧化剂，如过氧化氢，干扰细菌的酶系统和代谢：氧化剂，如过氧化氢， 高锰酸钾，过氧乙酸等高锰酸钾，过氧乙酸等 3.3.损伤细菌细胞膜：表面活性剂，如新洁尔灭损伤细菌细胞膜：表面活性剂，如新洁尔灭 二、抗生素敏感试验二、抗生素敏感试验 随着抗生素的广泛应用，耐药变异菌株日益随着抗生素的广泛应用，耐药变异菌株日益 增加（尤其是金葡、肠道杆菌），给医疗工作带增加（尤其是金葡、肠道杆菌），

6、给医疗工作带 来了不少的困难。来了不少的困难。 为正确使用抗生素，临床上常在分离致病细为正确使用抗生素，临床上常在分离致病细 菌的同时做药物敏感试验，以了解该细菌对常用菌的同时做药物敏感试验，以了解该细菌对常用 各种抗生素的敏感性。各种抗生素的敏感性。 药敏试验的常用方法：药敏试验的常用方法：纸片法纸片法 操作：操作： 贴纸片贴纸片 敏感金葡敏感金葡 结果分析：结果分析： 如果细菌对药物敏感，则在药片周围有抑菌圈如果细菌对药物敏感，则在药片周围有抑菌圈 形成，敏感度越高抑菌圈直径越大：形成，敏感度越高抑菌圈直径越大： 20mm20mm： 极度极度敏感敏感 15-20mm15-20mm： 中度中

7、度敏感敏感 10-15mm10-15mm： 轻度轻度敏感敏感 10mm: 10mm: 不敏感不敏感 无抑菌圈：耐药无抑菌圈：耐药 抑菌圈直径抑菌圈直径 化脓性炎症是临床上常见病，除了病原性球化脓性炎症是临床上常见病，除了病原性球 菌外，其他微生物也可以引起化脓性感染。菌外，其他微生物也可以引起化脓性感染。 常见的标本有脓汁、咽拭子、痰、血液、脑常见的标本有脓汁、咽拭子、痰、血液、脑 脊液等。脊液等。 本次实验是以脓汁标本进行病原性球菌的分本次实验是以脓汁标本进行病原性球菌的分 离鉴定离鉴定 三、化脓性球菌分离鉴定（一）三、化脓性球菌分离鉴定（一） 化脓性球菌分离鉴定步骤化脓性球菌分离鉴定步骤

8、脓汁脓汁血平板血平板菌落菌落 葡萄状排列葡萄状排列 链状排列链状排列 血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验 甘露醇发酵试验甘露醇发酵试验 血清肉汤管血清肉汤管 接种接种 划线法划线法 3737 24h24h 革兰染色革兰染色 成对排列成对排列 操作：操作： 1. 1. 接种血平板（接种血平板（1 1块块/ /人）人） 三线法接种分离单个菌落三线法接种分离单个菌落 1. 临床上耐药性菌株感染，如何确定其治疗用药？临床上耐药性菌株感染，如何确定其治疗用药？ 2. 抗生素耐药性实验的结果是如何判定？抗生素耐药性实验的结果是如何判定？ 思考题思考题 高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌法： 高压蒸汽灭菌法的杀菌效果最

9、好，运用广泛。高压蒸汽灭菌法的杀菌效果最好，运用广泛。 压力为压力为1515磅磅/ /寸寸2 2，3030分钟可杀死一切芽胞，达到灭菌的目的。分钟可杀死一切芽胞，达到灭菌的目的。 （温度可达（温度可达121 )121 ) 优点：优点：1.1.能够达到较高的温度。能够达到较高的温度。 2.2.穿透力强。穿透力强。 3.3.蒸气遇冷物凝成水时可放出汽化热，蒸气遇冷物凝成水时可放出汽化热， 迅速提高冷物的温度。迅速提高冷物的温度。 4.4.高压蒸气不会使物品过分潮湿，避高压蒸气不会使物品过分潮湿，避 免了水煮的缺点。免了水煮的缺点。 高压的整个过程必须有专人守侯，并随时排气以高压的整个过程必须有专人

10、守侯，并随时排气以 防压力表显示错误及其它原因引起高压锅内压力防压力表显示错误及其它原因引起高压锅内压力 剧增而导致爆炸。剧增而导致爆炸。 2. 2. 高压完毕需等待高压锅内压力降低至零时方可打高压完毕需等待高压锅内压力降低至零时方可打 开取物。开取物。 注意事项：注意事项： 波长波长200-300nm200-300nm的紫外线具有杀菌作用，其中的紫外线具有杀菌作用，其中 以以265-266nm265-266nm最强，这与最强，这与DNADNA的吸收光谱范围一致。的吸收光谱范围一致。 紫外线主要作用于紫外线主要作用于DNADNA，使一条，使一条DNADNA链上相邻的两个链上相邻的两个 胸腺嘧啶

11、共价结合而形成双聚体，从而改变胸腺嘧啶共价结合而形成双聚体，从而改变DNADNA的的 分子构型，干扰分子构型，干扰DNADNA的复制与转录，导致细菌的死的复制与转录，导致细菌的死 亡或变异。亡或变异。 紫外线杀菌原理紫外线杀菌原理: : 1.1.穿透力弱，一般玻璃、纸、布、尘埃、水穿透力弱，一般玻璃、纸、布、尘埃、水 蒸气均能阻挡。蒸气均能阻挡。 2.2.适用于空气、物体表面的消毒。适用于空气、物体表面的消毒。 3.3.有效距离在有效距离在2 2米左右（米左右（紫外灯的安装紫外灯的安装） 4.4.紫外线对人的眼睛、皮肤有损害作用。紫外线对人的眼睛、皮肤有损害作用。 注意事项注意事项: : 操作步骤操作步骤： 取普通平板（取普通平板（1 1块块/3/3人）人） 取大肠杆菌斜面培养物在平板上取大肠杆菌斜面培养物在平板上密集划线密集划线 用灭菌镊子取无菌黑纸片夹放到平板正中用灭菌镊子取无菌黑纸片夹放到平板正中 将平板放到紫外线下照射将平板放到紫外线下照射3030分钟分钟 放放3737孵箱培养孵箱培养 观察结果观察结果 1.1. 注意操作中始终保持无菌操作注意操作中始终保持无菌操作 划线、盖纸、照射划线、盖纸、照射 紫外线杀菌实验操作紫外线杀菌实验操作 电离辐射电离辐射 射线和射线和射线；射线； 产生自由基或毒性基团，干扰产生自由基或毒性基团，干扰DNADN