第二章提取、分离与鉴定的方法与技术6

1、第二章 天然药物化学成分提取分离和 鉴定的方法与技术 第一节 提取方法与技术 第二节 分离精制和鉴定的方法与技术 第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术 第二节 分离精制和鉴定的方法与技术 一、系统溶剂分离法 第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术 二、两相溶剂萃取法 三、沉淀法 四、结晶与重结晶法 五、透析法 六、分馏法 七、色谱法 学习目标： 1. 掌握结晶分离法的原理、溶剂选择的条件和 操作技术。 2. 熟悉常用影响结晶法因素。 3. 了解透析法、分馏法和盐析法的原理和应用。 四、结晶与重结晶法四、结晶与重结晶法 结晶法结晶法* * * *：是利用混合物中各成分在

2、某种溶剂中溶解是利用混合物中各成分在某种溶剂中溶解 度的差异，使某单一成分以结晶状态析出而与其他成分度的差异，使某单一成分以结晶状态析出而与其他成分 分离的一种方法。分离的一种方法。 1 1 结晶和重结晶概念结晶和重结晶概念 结晶：是指由非结晶状态到形成结晶的操作过程。结晶：是指由非结晶状态到形成结晶的操作过程。 重结晶重结晶* * * *：指由纯度低结晶处理成纯度高结晶的操作指由纯度低结晶处理成纯度高结晶的操作 过程。过程。 2 2 结晶溶剂的选择结晶溶剂的选择 关键关键 溶剂应符合下列件：溶剂应符合下列件： 不与有效成分发生化学反应。不与有效成分发生化学反应。 对欲结晶的成分在热时溶解度大

3、，冷时溶解度小，差别对欲结晶的成分在热时溶解度大，冷时溶解度小，差别 越大越好。越大越好。 对可能存在的杂质冷热时溶解度均大，这样当溶液放冷对可能存在的杂质冷热时溶解度均大，这样当溶液放冷 时，有效成分析出结晶，而杂质仍留在母液中；或杂质在时，有效成分析出结晶，而杂质仍留在母液中；或杂质在 冷热时溶解度均极小，可先滤过除去。冷热时溶解度均极小，可先滤过除去。 有一定的挥发性，沸点不宜过高或过低。过高时，附着有一定的挥发性，沸点不宜过高或过低。过高时，附着 于结晶表面的溶剂不易除去；过低时，则有效成分溶解度于结晶表面的溶剂不易除去；过低时，则有效成分溶解度 冷热时变化不大，不利于结晶。冷热时变化

4、不大，不利于结晶。 常用的溶剂有水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、常用的溶剂有水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、 苯、石油醚等。使用乙醚时应注意乙醚易燃，且易沿瓶壁苯、石油醚等。使用乙醚时应注意乙醚易燃，且易沿瓶壁 爬行挥发，而使结晶析出于瓶壁上，影响结晶的纯度。爬行挥发，而使结晶析出于瓶壁上，影响结晶的纯度。 混合溶剂混合溶剂* * * *：要能互相混溶要能互相混溶 若使用两种溶剂时，其中一种溶剂要若使用两种溶剂时，其中一种溶剂要对有效成分较易对有效成分较易 溶解溶解，最好是，最好是低沸点低沸点的，另一种要的，另一种要对有效成分难溶解对有效成分难溶解， 最好是最好是高沸点高沸点的。的

5、。 先加入一种有效成分易溶的低沸点的溶剂加热使样品先加入一种有效成分易溶的低沸点的溶剂加热使样品 溶解，再逐滴加入有效成分难溶的高沸点的溶剂，直溶解，再逐滴加入有效成分难溶的高沸点的溶剂，直 到溶液稍变混浊，再微微加热使溶液变澄明，低温放到溶液稍变混浊，再微微加热使溶液变澄明，低温放 置使有效成分析出结晶。置使有效成分析出结晶。 在放置过程中，若不析晶，可打开塞子，使其在室温在放置过程中，若不析晶，可打开塞子，使其在室温 中自然挥发，由于低沸点的溶剂易挥发，在溶剂中比中自然挥发，由于低沸点的溶剂易挥发，在溶剂中比 例逐渐减少，有效成分就会慢慢析出结晶。例逐渐减少，有效成分就会慢慢析出结晶。 3

6、 3 结晶的条件结晶的条件 关键关键 杂质的除去杂质的除去 有效成分的含量有效成分的含量 溶液的浓度溶液的浓度 温度温度 时间时间 4 4 结晶纯度的判断结晶纯度的判断 初步鉴定：根据化合物的物理性质判断初步鉴定：根据化合物的物理性质判断 结晶都有一定的结晶形状、色泽、熔点和熔距，这是结晶都有一定的结晶形状、色泽、熔点和熔距，这是 非结晶物质所没有的物理性质。非结晶物质所没有的物理性质。 熔点和熔距：熔点和熔距：一般单体化合物结晶熔距较窄，要求在一般单体化合物结晶熔距较窄，要求在0.50.5 左右，如果熔距较长则表示化合物不纯，但也不能绝对化，左右，如果熔距较长则表示化合物不纯，但也不能绝对化

7、， 特别是有些化合物的分解点不易看清楚，或分解点的距离特别是有些化合物的分解点不易看清楚，或分解点的距离 比较长。还有些化合物重结晶前后熔点一致，熔距也很短，比较长。还有些化合物重结晶前后熔点一致，熔距也很短， 但不是单体化合物，很可能是立体异构体或结构非常类似但不是单体化合物，很可能是立体异构体或结构非常类似 的混合物。另外，化合物结晶的形状和熔点往往因所用溶的混合物。另外，化合物结晶的形状和熔点往往因所用溶 剂不同而有差异。有的化合物具有双熔点特性，即在某一剂不同而有差异。有的化合物具有双熔点特性，即在某一 温度已全部熔融，当温度继续上升时又固化，再升温至一温度已全部熔融，当温度继续上升时

8、又固化，再升温至一 定温度又熔化或分解。这些情况都会影响到结晶纯度的判定温度又熔化或分解。这些情况都会影响到结晶纯度的判 断。断。 有标准品的化合物，将结晶和标准品混合后测熔点，如果有标准品的化合物，将结晶和标准品混合后测熔点，如果 混合熔点不降、即可判断是单体化合物。混合熔点不降、即可判断是单体化合物。 色谱分析法：色谱分析法：也是实验室常用的鉴定纯度的简易方法。也是实验室常用的鉴定纯度的简易方法。 一般常用的有薄层色谱和纸色谱等。在薄层色谱或纸一般常用的有薄层色谱和纸色谱等。在薄层色谱或纸 色谱上采用两种以上不同展开剂展层和不同的显色剂色谱上采用两种以上不同展开剂展层和不同的显色剂 来检定

9、，均为一个斑点者，一般可以认为是一个单体来检定，均为一个斑点者，一般可以认为是一个单体 化合物。但应注意，有的化合物在一般层析条件下、化合物。但应注意，有的化合物在一般层析条件下、 虽然只有一个斑点，但并不一定是单体成分。因此，虽然只有一个斑点，但并不一定是单体成分。因此， 要依据具体情况综合分析。要依据具体情况综合分析。 判定结晶的纯度，必要时可采用判定结晶的纯度，必要时可采用高效液相色谱、气相高效液相色谱、气相 色谱、紫外光谱色谱、紫外光谱等方法来检识结晶样品的纯度。等方法来检识结晶样品的纯度。核磁核磁 共振谱共振谱，尤其，尤其1HNMR也是判断结晶纯度的重要信息。也是判断结晶纯度的重要信

10、息。 4 4 操作技术操作技术 通常将化合物溶于适当溶剂中，过滤，浓缩至适当体积后，通常将化合物溶于适当溶剂中，过滤，浓缩至适当体积后， 塞紧瓶塞，静置或在低温下放置，使原来溶解的溶质成为塞紧瓶塞，静置或在低温下放置，使原来溶解的溶质成为 有一定几何形状的固体（晶体）析出，析出晶体后的溶液有一定几何形状的固体（晶体）析出，析出晶体后的溶液 仍是饱和溶液，又称母液。仍是饱和溶液，又称母液。 结晶的方法：结晶的方法： 浓缩结晶法浓缩结晶法，也称蒸发溶剂法。对溶解度受温度变化影，也称蒸发溶剂法。对溶解度受温度变化影 响不大的固体溶质适用。将溶液加热蒸发（或慢慢挥发），响不大的固体溶质适用。将溶液加热

11、蒸发（或慢慢挥发）， 过饱和的溶质就能成固体析出。过饱和的溶质就能成固体析出。 降温结晶法，降温结晶法，适用于溶解度受温度变化影响较大的固体适用于溶解度受温度变化影响较大的固体 溶质的结晶。先用适量的溶剂在加温情况下，将化合物溶溶质的结晶。先用适量的溶剂在加温情况下，将化合物溶 解制成过饱和的溶液，然后再放置冷处，让其溶质从溶液解制成过饱和的溶液，然后再放置冷处，让其溶质从溶液 中析出。中析出。 操作：操作： (1)(1)制备结晶溶液制备结晶溶液 (2)(2)趁热过滤，除去不溶性杂质趁热过滤，除去不溶性杂质 (3)(3)将滤液放冷，使析出结晶将滤液放冷，使析出结晶 (4)(4)抽气过滤，将结晶

12、从母液中分出抽气过滤，将结晶从母液中分出 (5)(5)重结晶重结晶 (6)(6)晶体的干燥晶体的干燥 结晶和重结晶操作：结晶和重结晶操作： 提取或分离物提取或分离物 溶于选择的溶剂，加热成饱和溶液，过滤溶于选择的溶剂，加热成饱和溶液，过滤 溶液溶液 放置（冷藏）析晶，过滤放置（冷藏）析晶，过滤 粗结晶粗结晶 重复上述操作（重结晶）重复上述操作（重结晶） 结晶结晶 适用范围：适用范围：分离纯化固体化学成分。分离纯化固体化学成分。 特点：特点：分离纯化固体成分的重要方法之一，可获得较纯单体。分离纯化固体成分的重要方法之一，可获得较纯单体。 提示：提示：结晶溶剂的选择是结晶法成败的关键；注意影响结晶

13、结晶溶剂的选择是结晶法成败的关键；注意影响结晶 的其他条件。的其他条件。 影响结晶的因素：影响结晶的因素： (1)(1)结晶溶剂的选择是最重要因素之一，应符合一定条件。结晶溶剂的选择是最重要因素之一，应符合一定条件。 (2)(2)杂质的存在会影响结晶的形成，应尽可能除去。杂质的存在会影响结晶的形成，应尽可能除去。 (3)(3)有效成分的含量高时容易形成结晶，溶液应尽可能纯化。有效成分的含量高时容易形成结晶，溶液应尽可能纯化。 (4)(4)溶液浓度：应考虑溶液的浓度高是有效成分含量高还是溶液浓度：应考虑溶液的浓度高是有效成分含量高还是 杂质较多。一般地，溶液浓结晶快，但结晶细碎，杂质多；杂质较多

14、。一般地，溶液浓结晶快，但结晶细碎，杂质多； 反之，结晶慢，但晶形大、纯度高。反之，结晶慢，但晶形大、纯度高。 (5)(5)结晶温度和时间：温度低、时间长，结晶较好。结晶温度和时间：温度低、时间长，结晶较好。 (6)(6)被结晶成分的类型：分子小易结晶；分子大、含糖多，被结晶成分的类型：分子小易结晶；分子大、含糖多， 不易结晶。不易结晶。 故：故：在制备结晶时，一般是用较稀溶液在较低温度下长时在制备结晶时，一般是用较稀溶液在较低温度下长时 间放置，使其缓慢析出结晶，这样形成的晶体大而且纯。间放置，使其缓慢析出结晶，这样形成的晶体大而且纯。 促使结晶形成的方法：促使结晶形成的方法： 用玻棒摩擦容

15、器壁；用玻棒摩擦容器壁； 加入晶种（同型化合物的微小颗粒）；加入晶种（同型化合物的微小颗粒）； 制备衍生物。制备衍生物。 第二节 分离精制和鉴定的方法与技术 一、系统溶剂分离法 第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术 二、两相溶剂萃取法 三、沉淀法 四、结晶与重结晶法 五、透析法 六、分馏法 七、色谱法 五、透析法五、透析法 透析法：透析法：是利用透析膜的选择性透过作用，提取液中的是利用透析膜的选择性透过作用，提取液中的 小分子物质可通过半透膜，而大分子物质不能通过的性小分子物质可通过半透膜，而大分子物质不能通过的性 质，使分子量差异较大的物质达到分离的方法。质，使分子量差异较大的

16、物质达到分离的方法。 1 1 操作技术：操作技术：实验室操作常用市售的玻璃纸或动物半透实验室操作常用市售的玻璃纸或动物半透 膜扎成袋状，外面用尼龙网袋加以保护，将欲透析的样品膜扎成袋状，外面用尼龙网袋加以保护，将欲透析的样品 液小心加入半透膜袋内，悬挂在清水容器中。透析过程中液小心加入半透膜袋内，悬挂在清水容器中。透析过程中 需要经常更换清水，使透析膜内外溶液的浓度加大，以加需要经常更换清水，使透析膜内外溶液的浓度加大，以加 快透析速度。透析法分离的速度较慢，为了加快透析速度，快透析速度。透析法分离的速度较慢，为了加快透析速度， 可采用电透析法，电透析法可使带电离子的透析速度增加可采用电透析法

17、，电透析法可使带电离子的透析速度增加 1010倍以上。倍以上。 透析法示意图：透析法示意图： 2 2 适用范围适用范围：适用于分离纯化蛋白质、多肽、多糖、皂适用于分离纯化蛋白质、多肽、多糖、皂 苷等分子量较大的成分时，常采用本法除去无机盐、单糖、苷等分子量较大的成分时，常采用本法除去无机盐、单糖、 双糖等小分子杂质。反之，如果杂质是大分子的蛋白质、双糖等小分子杂质。反之，如果杂质是大分子的蛋白质、 淀粉、树脂等，采用此法将其留在半透膜内，而将所要的淀粉、树脂等，采用此法将其留在半透膜内，而将所要的 小分子成分通过半透膜进入膜外溶液中，从而加以分离精小分子成分通过半透膜进入膜外溶液中，从而加以分

18、离精 制。制。 3 3 特点：特点：操作简便，分离完全。操作简便，分离完全。 4 4 提示：提示：透析膜有多种规格，需根据欲分离成分的分子透析膜有多种规格，需根据欲分离成分的分子 量大小来选择。透析是否成功与透析膜的规格关系很大。量大小来选择。透析是否成功与透析膜的规格关系很大。 常用的透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸常用的透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸 膜）、蛋白胶膜及玻璃纸膜等。膜）、蛋白胶膜及玻璃纸膜等。 第二节 分离精制和鉴定的方法与技术 一、系统溶剂分离法 第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术 二、两相溶剂萃取法 三、沉淀法 四、结晶与重结晶法

19、 五、透析法 六、分馏法 七、色谱法 六、分馏法六、分馏法 分馏法：分馏法：是利用混合物中各成分的沸点不同，在分馏过程中是利用混合物中各成分的沸点不同，在分馏过程中 产生高低不同的蒸气压，收集不同温度的馏份，借以分离液产生高低不同的蒸气压，收集不同温度的馏份，借以分离液 体混合物的一种方法。在天然产物有效成分研究中，挥发油体混合物的一种方法。在天然产物有效成分研究中，挥发油 及一些液体生物碱常用此法分离。分馏法是将多次蒸馏的复及一些液体生物碱常用此法分离。分馏法是将多次蒸馏的复 杂操作集中在一支分馏柱中完成。杂操作集中在一支分馏柱中完成。 1 1 操作技术：操作技术：操作时将待分馏样品放入圆底

20、烧瓶中，加入沸操作时将待分馏样品放入圆底烧瓶中，加入沸 石，安装好装置，在分馏柱的外围尽量用石棉绳包住，选择石，安装好装置，在分馏柱的外围尽量用石棉绳包住，选择 合适的热浴加热。当瓶内深一开始沸腾时，就要注意调节温合适的热浴加热。当瓶内深一开始沸腾时，就要注意调节温 度，使蒸气缓慢升入分馏柱。当蒸气走入分馏柱时，由于柱度，使蒸气缓慢升入分馏柱。当蒸气走入分馏柱时，由于柱 外空气的冷却，部分蒸气凝成液体，高沸点的组分较易被冷外空气的冷却，部分蒸气凝成液体，高沸点的组分较易被冷 凝，随着分馏柱管的升高，愈向上混合蒸气中所含高沸点成凝，随着分馏柱管的升高，愈向上混合蒸气中所含高沸点成 分的组分越少，

21、到一定高度时，可获得某一纯的组分。待低分的组分越少，到一定高度时，可获得某一纯的组分。待低 沸点沸点 组分蒸馏完后，再逐渐升高温度，如此进行操作，使不组分蒸馏完后，再逐渐升高温度，如此进行操作，使不 同沸点的组分逐一分馏出来。同沸点的组分逐一分馏出来。 2 2 适用范围适用范围：适用于分离天然药物中沸点差异较适用于分离天然药物中沸点差异较 小的液体混合物，如挥发油、液体生物碱等。小的液体混合物，如挥发油、液体生物碱等。 3 3 特点：特点：操作简便，但加热时可能会破坏某些成操作简便，但加热时可能会破坏某些成 分。分。 4 4 提示：提示：注意保持柱内适当的温度梯度，一般用注意保持柱内适当的温度梯度，一般用 石棉进行保温，严格控制热源的温度。石棉进行保温，严格控制热源的温度。 七、盐析法七、盐析法 在水提取液中加入无机盐在水提取液中加入无机盐( (常用氯化钠、硫酸常用氯化钠、硫酸 钠、硫酸铵等钠、硫酸铵等) )达到一定浓度或达到饱和