自由基对神经损伤机理研究

1、自由基对神经损伤机理自由基对神经损伤机理研究研究 兼谈依达拉奉对脑卒中作用兼谈依达拉奉对脑卒中作用 自由基概述 缺血性脑卒中各阶段自由基变化 依达拉奉有效减轻脑卒中病理损 害 总结 自由基概述 人人体内体内氧自由基约氧自由基约占自由基总量的占自由基总量的95%，也称也称活性氧活性氧 非氧自由基主要有非氧自由基主要有氢自由基氢自由基（H）和）和有机自由基有机自由基（R） 清除自由基：内源性自由基清除系统清除自由基：内源性自由基清除系统 （酶类：酶类：超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶；、过氧化氢酶；非酶类非酶类：维生素：维生素C、E等）等） 氧自由基的类型氧自由基的类型 超氧阴离子过

2、氧化氢分子羟自由基氢过氧基烷过氧基 O2-H2O2OHHO2-ROO 烷氧基氮氧自由基过氧亚硝酸盐氢过氧化物单线态氧 RONOONOOROOH 1O2 王志平,等. 西南军医 2010; 12(3) : 534-536 脑缺血脑缺血/再灌注时自由基的来源再灌注时自由基的来源 黄嘌呤氧化酶的形成增多 中性粒细胞的释放 线粒体内细胞色素氧化酶系统功能失调 儿茶酚胺的增加 自由基通过以下途径导致神经自由基通过以下途径导致神经/ /血管细胞损伤血管细胞损伤： 细胞膜损伤：双层结构改变，膜流动性 ，通透性 蛋白质损害：使各种蛋白、酶活性、离子泵等功能异常 核酸损害：核酸碱基改变，DNA断裂，染色体畸变

3、诱导炎症介质产生 自由基损伤 脑花生四烯酸（AA）链能引起毒性氧自由基增加，合成 潜在的水肿诱导因子白三烯（LT），这是导致脑水肿和 组织损伤的主要原因之一。在沙鼠的I/P模型中，MCI- 186能够抑制脑白三烯合成的增加，明显阻止水肿扩大。 自由基损伤导致的最终结果 脑 水 肿梗塞灶扩大 因缺血时间、再灌注时间的不同以及药物干预效果的 差异，体积大小处于动态变化之中。 细胞凋亡在缺血半暗带缩小及中心区扩大的过程中起 着十分重要的作用。 自由基损伤导致的最终结果自由基损伤导致的最终结果： 神经症状 如果在神经元细胞发生不可逆损伤前，脑组织恢复血供， 同时抑制了再灌注损伤，临床的症状体征是临时的

4、。 如果血流中断时间延长、或恢复血供时无有效抑制再灌 注损伤即导致不可逆缺血性损伤（梗塞）和持久的神经 功能缺损。 迟发性神经细胞死亡 自由基损伤导致的最终结果自由基损伤导致的最终结果： 自由基 DNA损害 新的基因表达 细胞凋亡 调控凋亡程序 缺血性脑卒中时 ROS产生超过抗氧化系统的清除能力 氧化应激反应（细胞吞噬）氧化应激反应（细胞吞噬） 金属离子转换金属离子转换 黄嘌呤氧化酶黄嘌呤氧化酶 血红蛋白血红蛋白 核黄素核黄素 细胞色素细胞色素P450 电子传递链电子传递链 脂质过氧化脂质过氧化 NADPH 氧化还原酶氧化还原酶 氧化酶类氧化酶类 王志平,等. 西南军医 2010; 12(3)

5、 : 534-536 刘扬,等. 中国中医药咨讯 2010; (10) : 210-211 缺血性脑卒中过量自由基的危害 损害大分子（核损害大分子（核 酸、蛋白质、脂酸、蛋白质、脂 质）质） 损害细胞膜损害细胞膜 自由基自由基 抗氧化物质抗氧化物质 问题问题：急性缺血性脑卒中各病程自由基的变化情况？：急性缺血性脑卒中各病程自由基的变化情况？ 王志平,等. 西南军医 2010; 12(3) : 534-536 需要需要 抗自由基抗自由基 主要内容 自由基概述 缺血性脑卒中各阶段自由基变化 依达拉奉有效减轻脑卒中病理 损害 总结 缺血性脑卒中溶栓再灌注后 诱导机体产生氧化性损伤 Oxidative

6、 Stress After Thrombolysis-Induced Reperfusion in Human Stroke Carmen Domnguez, Pilar Delgado, Angel Vilches, 试验组试验组(n=160)：t-PA治疗的缺血性脑卒中患者对照组(n=60) 基基线线t-PA后后1ht-PA后后2h 研究方法研究方法 t-PA后后24h t-PA后后12h 采血： Domnguez C, et al. Stroke. 2010 Apr;41(4)653-60 P655;Par1-2 急性期24h：患者MDA显著升高 患者在基线、1h、2h、12h、24h的

7、变化情况 Domnguez C, et al. Stroke. 2010 Apr;41(4)653-60 P656;FigA 对对照照基基线线1h2h 平均MDA(95% CI)micromolar 1.0 2 0.6 0.8 1.2 12h24h 所有组 vs.对照：*P0.001 * * * * 自 由 基 增 多 注：过量的ROS极易与脑组织中的脂质发生过氧化反应产生丙二醛（MDA），因此MDA 常作为衡量自由基变化的指标 急性期14天：重度患者MDA仍较高 一项对急性脑卒中患者14天内MDA检测结 果显示： 0 2 4 6 8 10 12h24h3天7天14天 轻度 中度 重度 对照

8、MDA浓度浓度 Nmol/mL * 注注：vs对照：*P0.05，*P0.01； vs轻型： P0.05； vs中型： P0.05； vs组内24h ：# P0.05 # # * # * # 李舟,等.浙江医学 2012; 34(22) : 1818-1820 高 P1819;Tab2; P1820;Par2; 急性期14天：重度患者SOD仍较低 该项研究对患者14天内SOD检测结果显示： 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12h24h3天7天14天 轻度 中度 重度 对照 SOD浓度浓度 Nmol/mL * 注注：vs对照：*P0.05，*P0.01； vs轻型： P0.05；

9、vs中型： P0.05； vs组内24h ：# P0.05 # # 李舟,等.浙江医学 2012; 34(22) : 1818-1820 * * 低 P1819;Tab3; P1820;Par2; 急性期(21天)：脂质过氧化物累积增 加 一项探究急性缺血性脑卒中患者血液ROOH 的动态变化： 急性阶段急性阶段为为21天天（WHO标准）标准） Alexandrova M et al.J Clin Neurosci. 2004 Jun;11(5):501-6. 血浆ROOH nmol/ml 对照组1周2周3周 *P=0.0009 *P=0.021 *P=0.010 P504;Par4;Fig6

10、自 由 基 增 多 急性期（21天)：TBARM累积增加 该项研究中硫代巴比妥酸反应性物质（TBARM）的变化 对照组1周2周3周 血浆TBARM nmol/ml *P0.0077 *P=0.020 *P=0.027 P504;Par4;Fig7B 自 由 基 增 多 Alexandrova M et al.J Clin Neurosci. 2004 Jun;11(5):501-6. 卒中发病6月后：丙二醛显著高于对 照组 一项探究缺血性脑卒中卒中发生6个月后，血清MDA水平变化，N=38 动脉粥样硬化 N=19 腔隙性脑梗死 N=19 健康志愿者 N=30 MDA水平（中位数） 3.5 （1

11、.56-6.82） 3.83 （1.17-5.66） 1.69 （0.45-3.50） P0.001 P0.001 nmol/mL Bir LS et al. Exp. Med. 2006 Jan;208(1)33-9 P36;Tab1;Fig1. 自由基在脑卒中病程中长期存在 病程病程存在自由基损伤存在自由基损伤 急性期急性期 （21天）天） 第一阶段 （2448h内） 所有患者所有患者 第二阶段 （314天） 部分中度患者部分中度患者 重度患者重度患者 第三阶段 （1521天） 重度患者重度患者 恢复期恢复期（26个月）部分重度患者部分重度患者 后遗症期后遗症期（6个月以后）未见临床报道

12、研究显示：研究显示：急性缺血性脑卒中的自由基损伤情况 Bir LS et al. Exp. Med. 2006 Jan;208(1)33-9 Alexandrova M et al.J Clin Neurosci. 2004 Jun;11(5):501-6. 李舟,等.浙江医学 2012; 34(22) : 1818-1820 Domnguez C, et al. Stroke. 2010 Apr;41(4)653-60 自由基损伤与炎症相互作用 是损伤长期存在的原因 血细胞氧血细胞氧 化性损伤化性损伤 血栓形成血栓形成NONO生物利用度降低生物利用度降低 氧化氧化LDLLDL 内皮氧化性损伤

13、内皮氧化性损伤 动脉粥样化动脉粥样化 血管收缩血管收缩 卒中卒中 Alexandrova,et al. Biol. Med.2005, 39, 297-316. P230;Par1;Fig1. P298;Par1;L9-L13 炎症炎症 补体系统激活补体系统激活 凝血纤溶异常凝血纤溶异常 血小板激活血小板激活 血小板血小板- -白细白细 胞聚集体胞聚集体 激活白细胞激活白细胞 某某些细胞因子和急些细胞因子和急 性炎症标志物变化性炎症标志物变化 血脂异常血脂异常 内皮细胞活化内皮细胞活化 ROS 上调内皮细胞和白上调内皮细胞和白 细胞表面粘附细胞表面粘附分子分子 OH H2O2 O2 主要内容

14、自由基概述 缺血性脑卒中各阶段自由基变化 依达拉奉有效减轻脑卒中病理损害 总结 21 依达拉奉阴离 子将带有的 1 个电子提供给 自由基而达到 清除自由基的 目的 依达拉奉：提供电子，清除自由基 依达拉奉清除脑缺血后增加的有害的 OH和其它毒性氧自由基 有效抑制 1.羟自由基与细胞膜脂质作用而生成脂性自由基 2.细胞膜脂质过氧化连锁反应 3.氧自由基介导的蛋白质、核酸不可逆的破坏作用 直接阻断神经细胞损伤和血管内皮细胞损伤 控制脑梗塞进展和症状恶化 依达拉奉显著降低自由基水平 Shen LH, et al. Neuroscience. 2012 Oct 25;223315-24 P318,Fi

15、gA.B 0 2 4 6 8 10 12 1天3天7天14天 MDA浓度浓度nmol/t 假手术组 MCAO 依达拉奉 0 10 20 30 40 50 60 70 1天3天7天14天 SOD活性活性Nu/t vs 假手术组 ：*P0.01 vs.MCAO组：#P 0.01 # # # * * * * * * 单药治疗单药治疗 依达拉奉显著减轻脑梗死面积依达拉奉显著减轻脑梗死面积 小鼠局灶性脑缺血损伤小鼠局灶性脑缺血损伤模型模型 研究目的：探究依达拉奉对模研究目的：探究依达拉奉对模 型小鼠型小鼠MMP-9、细胞凋亡、细、细胞凋亡、细 胞自噬的影响胞自噬的影响 研究分组：

16、假手术组、对照组研究分组：假手术组、对照组 （Ve）、依达拉奉（）、依达拉奉（A、B） 0 91.38 67.68 66.08 0 20 40 60 80 100 Sc组Ve组A组B组 总梗死面积总梗死面积 # # #p0.05 vs Ve mm.2 Liu N, et al.Brain Res. 2011 Jun 23;139766-75 P69,Fig3(a-e). 单药治疗单药治疗 依达拉奉减轻细胞凋亡和自噬 0 1007.84 550.95 544.24 0 400 800 1200 Sc组Ve组A组B组 凋亡细胞数凋亡细胞数 细胞数mm.2 风险比 # # #p0.05 vs Ve

17、# # *p0.05 vs Sc #p0.05 vs Ve * 0.23 0.31 0.2 0.13 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Sc组Ve组A组B组 LC-3（微血管蛋白）（微血管蛋白） Liu N, et al.Brain Res. 2011 Jun 23;139766-75 P70,Fig4(f-g). 单药治疗单药治疗 降低MMP-9和水通道蛋白的表达 # # *p0.01 vs Sc *p0.05 vs Sc #p0.05 vs Ve * * * 风险比 0.11 0.68 0.43 0.45 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

18、 1 Sc组Ve组A组B组 MMP-9含量含量 0.23 0.63 0.5 0.49 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Sc组Ve组A组B组 AQ-4含量含量 *p0.05 vs SC #p0.05 vs Ve # # * * Liu N, et al.Brain Res. 2011 Jun 23;139766-75 P105,Tab2. 单药治疗单药治疗 临床证实：依达拉奉显著抑制MMP- 9 Isahaya K, et al. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2012 Feb;21(2)102-7. 3.857 4.029

19、4.499 4.538 3.807 3.533.449 3.42 3 3.5 4 4.5 5 入院时48h7天 14天 MMP-9含量含量 对照 依达拉奉 ng/ML p=0.042 p=0.037 P105,Tab2. 单药治疗单药治疗 依达拉奉降低出血性转化风险 内皮细胞 紧密 连接蛋白 基膜 自由基 MMP9 A：正常状态B：tPAtPA后后，缺血再灌注损伤 Yamashita T, et al. Cell Transplant. 2011;20(1)95-7. P96,Fig1. 出血性转化（HT） Yamashita T, et al. J Cereb Blood Flow Meta

20、b. 2009 Apr;29(4)715-25 联合溶栓联合溶栓 依达拉依达拉奉奉 自由基与自由基与MMP-9损伤血管内皮损伤血管内皮 依达拉奉联合t-PA Deguchi K,et al. Brain Res. 2012 Feb 3;1436168-77 研究研究目的目的：探究依达拉奉联合t-PA对神经修复再生蛋白因 子的影响 检测指标检测指标： neurocan Sema3A Nogo-R GAP43 DCC 联合溶栓联合溶栓 P169,Par2;:L1-L4;Fig1. 依达拉奉显著降低t-PA后梗死面积 联合溶栓联合溶栓 251 265 187 222 0 80 160 240 320

21、 V+VV+tPAE+VE+tPA mm.2 P169,Fig2(A-E). 总梗死总梗死面积面积 p0.05 p0.01 Deguchi K,et al. Brain Res. 2012 Feb 3;1436168-77 依达拉奉显著升高修复蛋白因子 联合溶栓联合溶栓 Sema3A表达量表达量（125Da） 1 1.4 0.6 2 1 0 0.5 1 1.5 2 2.5 SV+V V+tPA E+V E+tPA 1.2 1.4 0.6 1.8 1.3 0 0.5 1 1.5 2 2.5 SV+V V+tPA E+V E+tPA Nogo-R表达量表达量(66Da) p0.01p0.01 p0

22、.01p0.01 P170-173,Fig3-Fig6 Deguchi K,et al. Brain Res. 2012 Feb 3;1436168-77 依达拉奉改善干细胞治疗引起的脑 损伤 研究目的研究目的：探究依达拉奉联合干细胞治疗 缺血性脑卒中的作用 联合联合干细胞治疗干细胞治疗 Shen LH, et al. Neuroscience. 2012 Oct 25;223315-24 细胞凋亡率细胞凋亡率 P318,Par2;Fig1B 7.12 27.8 11.54 0 5 10 15 20 25 30 对照组I/RE+I/R P0.01 % P0.01 联合依达拉奉显著改善功能恢复

23、P320,Fig5 1天天3天天 2 0 14 7天天14天天 * 基基线线 12 10 8 4 2 6 神经功能评分（mNSS） 神经功能恢复情况神经功能恢复情况 * # # 再灌注时间再灌注时间 MCAO 依达拉奉 BMSCs 联合组 P 0.05 vs MCAO 对照 0.05 vs MCAO对照 P0.01 vs BMSCs 组 Shen LH, et al. Neuroscience. 2012 Oct 25;223315-24 *P0.01 vs MCAO 对照 #P0.01 vs 依达拉奉 主要内容 自由基概述 缺血性脑卒中各阶段自由基变化 依达拉奉有效减轻脑卒中病理损 害 总结

24、 中重度缺血性脑卒中患者，基础及临床研究显示：自由基损中重度缺血性脑卒中患者，基础及临床研究显示：自由基损 伤长期存在伤长期存在 依达拉奉有效清除自由基，抑制依达拉奉有效清除自由基，抑制MMP9MMP9，保护基底膜，保护脑，保护基底膜，保护脑 微血管的完整性，改善神经功能微血管的完整性，改善神经功能 t-PAt-PA溶栓联用依达拉奉可减少出血性转化，依达拉奉联合干溶栓联用依达拉奉可减少出血性转化，依达拉奉联合干 细胞治疗疗效更优细胞治疗疗效更优 参考文献 王志平,孙红斌.氧自由基与缺血性卒中. 西南军医 2010; 12(3) 534-536. 刘扬,李日涵,刘畅. 氧自由基与缺血再灌注损伤.

25、中国中医药咨讯 2010; (10) 210-211. Domnguez C, et al. Oxidative Stress After Thrombolysis-Induced Reperfusion in Human StrokeStroke. 2010 Apr;41(4)653-60 李舟,蒋亚平.急性脑梗死患者溶血磷脂酸、丙二醛和超氧化物歧化酶的变化及临床意义.浙江医学 2012; 34(22) : 1818-1820。 Alexandrova M et al. Dynamics of free radical processes in acute ischemic stroke:i

26、nfluence on neurological status and outcome. J Clin Neurosci. 2004 Jun;11(5)501-6. Bir LS et al. Increased Serum Malondialdehyde Levels in Chronic Stage of Ischemic Stroke. Exp. Med. 2006 Jan;208(1)33-9. Alexandrova,et al. Oxidative stress during the chronic phase of stroke. Free Rad. Biol. Med.2005, 39, 297- 316. Shen LH, et al. .PROTECTIVE EFFECTS OF MCI-186 ON TRANSPLANTATION OF BONE MARROW STROMAL CELLS IN RAT ISCHEMIC STROKE