流式细胞技术与图像处理

1、流式细胞术流式细胞术 流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞）是以流式细胞 仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学或生物学 颗粒颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。 原理：原理：以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素 染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的 强度，从而对细胞强度，从而对细胞(微粒微粒)的性状进行定性、定量分析和分选。的性状进行定性、

2、定量分析和分选。 流式细胞仪简介流式细胞仪简介 流式细胞仪流式细胞仪（Flow CytometerFlow Cytometer ）是集细胞与）是集细胞与 分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、 计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的一种新型高科技仪器。为一体的一种新型高科技仪器。 流式细胞仪特点 流式细胞仪的分类 n分析型分析型流式细胞仪流式细胞仪 细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。 n分选型分选型流式细胞仪流式细胞仪 既能流式分析

3、，还能对分析的目的细胞进行分选；既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选； 进样管道较长，需要保持无菌状态，所以分选型流进样管道较长，需要保持无菌状态，所以分选型流 式细胞仪一般只用于分选，不兼单纯分析。式细胞仪一般只用于分选，不兼单纯分析。 BD公司产品公司产品 FACS Calibur 双激光四色，市场覆盖率最高 FACSAria 科研型分选流式细胞仪 FACS Vantage DiVa 科研型（大型机） 特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选 Beckman Coulter流式细胞仪流式细胞仪 Epics XL 单激光四色， 市场覆盖率高，分析型 CyAn三激光九色，分析型 F

4、C 500 单激光或双激光五色， 市场覆盖率高，分析型 Gallios 三激光十色， 分析型 MoFlo XDP 高端分选型 第一节第一节 流式细胞仪流式细胞仪结构组成结构组成 n液流系统液流系统 n光学系统光学系统 n电子数据系统电子数据系统 n细胞分选系统细胞分选系统 液流系统液流系统 液流系统液流系统 n鞘流技术：根据层流原理发鞘流技术：根据层流原理发 展起来的技术，可以实现两展起来的技术，可以实现两 种液体的同轴流动，样本细种液体的同轴流动，样本细 胞流位于轴心稳定流动，外胞流位于轴心稳定流动，外 面包裹有鞘液面包裹有鞘液(sheath)。 n流体动力学聚焦：稳定的液流体动力学聚焦：稳

5、定的液 流从截面积较大的部分流入流从截面积较大的部分流入 截面积较小的部分后，有一截面积较小的部分后，有一 个聚焦收缩作用，细胞流直个聚焦收缩作用，细胞流直 径被约束在径被约束在10-20um，避免，避免 了多个细胞重叠进入检测区了多个细胞重叠进入检测区 。 鞘液鞘液鞘液鞘液 细胞流细胞流 激光照射点激光照射点 流体动力学聚焦示意图流体动力学聚焦示意图 液流驱动系统液流驱动系统 进样速率控制进样速率控制 通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并 不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。

6、高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细 胞数就增加，这样会导致变异系数增加。胞数就增加，这样会导致变异系数增加。 光学系统光学系统 激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。 光学原理光学原理 散射信号散射信号与与荧光信号荧光信号 荧光信号荧光信号 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态 ，再回到低能状态时释放出的光。，再回到低能状态时释放出的光。 发射波长发射波长(荧光波长荧光波长) Emission wavelength

7、激发波长激发波长 Excitation wavelength Longpass Shortpass Bandpass 460 500 540460 500 540460 500 540 光收集系统：滤光片 电子数据系统电子数据系统 电子数据系统构成：电子数据系统构成： n光电检测器光电检测器 将光信号转换成电子信号。将光信号转换成电子信号。 n前置放大电路前置放大电路 将信号等比例放大，输出电脉冲信号。将信号等比例放大，输出电脉冲信号。 n模数转换器模数转换器 将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。 n数据处理系统数据处理系统 计算机系统数据采集、分析。计算机系统

8、数据采集、分析。 光电检测器光电检测器(photodetector) n光电二极管光电二极管(photodiode) 光灵敏度低，测定强信号（光灵敏度低，测定强信号（FSC）；）； n光电倍增管光电倍增管(photomultiplier, PMT) 光灵敏度高，测定弱信号（光灵敏度高，测定弱信号（SSC, FL1, FL2, FL3, FL4)。 PMT 前向散射光前向散射光 光电二极管光电二极管 光信号的类型：光信号的类型： n散射光信号散射光信号：与标记荧光素无关，与标记荧光素无关， 是细胞的固有参数。是细胞的固有参数。 前向散射光前向散射光(forward scatter, FSC);

9、侧向散射光侧向散射光(side scatter, SSC). n荧光信号荧光信号 自发荧光自发荧光 ：微弱：微弱 特异荧光：标记的荧光素分子发出特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。的荧光，比自发荧光强很多倍。 流式细胞分析的信息流式细胞分析的信息光信号检测光信号检测 流式细胞的基本信息流式细胞的基本信息: “形态形态” 散射光的作用散射光的作用 n实验中，常利用实验中，常利用FSC和和SSC这两种参数的组合，区分不同这两种参数的组合，区分不同 的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。 粒细胞粒细胞 单核细胞单核细胞 淋

10、巴细胞淋巴细胞 红细胞、死细胞和碎片红细胞、死细胞和碎片 流式细胞的主要信息流式细胞的主要信息:Fluorescence nFL1 nFL2 nFL3 nFL4 最常用的标记方法是荧光素分子标记最常用的标记方法是荧光素分子标记 的抗体与细胞抗原结合的抗体与细胞抗原结合 nForward scatter (FSC)Forward scatter (FSC) nSide scatter (SSC)Side scatter (SSC) nFL1-FL1-绿色绿色 nFL2-FL2-、橙色橙色 nFL3-FL3-红色红色 nFL4-FL4-红色红色 488FL1BP 530/30515-545nm F

11、ITC（绿色，（绿色，520nm520nm） FL2BP 585/42564-606nm PE FL3670 LP670nm PE-Cy5、PerCP、PE- Cy7（红色）（红色） 635FL4BP 661/16653-669nm APC（红色，（红色，660nm660nm） 流式常见图形流式常见图形 (Histogram Plot) 适用于：单参数分析适用于：单参数分析 DNA倍体分析倍体分析抗原表达分析抗原表达分析 流式常见图形流式常见图形 (Dot Plot) 散点图散点图伪彩图伪彩图 假三维图和三维图假三维图和三维图 SSC-Height FSC-Height Counts SSC

12、CD45 CD14 等高图和密度图等高图和密度图 n等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目 相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。 n密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方 细胞少。细胞少。 设门与数据分析设门与数据分析 n门门(Gate，简写，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，是流式细胞术中的一个重要术语，FCM 数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。 椭圆形椭圆形圆形圆形 十字门十字门

13、线性门线性门 流式分选流式分选 电荷式电荷式分选分选 超声振动器超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统液流充电系统 高压偏转板高压偏转板 收集装置收集装置(流式管、培养板流式管、培养板) lasers 断裂点断裂点(充电充电) 高压偏转板高压偏转板 第二节第二节 流式细胞术的科研应用流式细胞术的科研应用 n分析群体细胞分析群体细胞 n所需时间短所需时间短 n多参数分析多参数分析 n定性或定量定性或定量 流式应用常见范围流式应用常见范围 n细胞大小细胞大小 n细胞的颗粒度细胞的颗粒度 n细胞表面分子：细胞表面分子：CD 系列等系列等 n细胞浆内分子：胞内细胞因子等细胞浆内分子：胞内细胞因

14、子等 n细胞核内分子：细胞核内分子：P53 n细胞功能检测：细胞周期、凋亡、细胞功能检测：细胞周期、凋亡、PH、 Ca+、细胞活性等、细胞活性等 样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋 单细胞 悬液 标记 荧光抗体 检测 表型测定细胞分选 流式细胞术操作流程 统计学 分析 继续 培养 实验标本的处理实验标本的处理 n单细胞悬液的制备：单细胞悬液的制备：胰酶消化胰酶消化 n抗体或标记分子的染色：抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应抗原抗体反应 n非特异结合的去除：非特异结合的去除：洗涤和封闭洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体封闭：血清和同型抗体 细胞染色细胞染色 n染色要求：染色要求： 特异识别某一群细

15、胞，有效区分不同细胞亚群特异识别某一群细胞，有效区分不同细胞亚群 非特异反应水平低非特异反应水平低 抗体效价高，用量适用于常规标本抗体效价高，用量适用于常规标本 n使用特异的单克隆抗体使用特异的单克隆抗体 n最好使用荧光直接标记的抗体最好使用荧光直接标记的抗体 n采用适当的阴性对照物采用适当的阴性对照物 n抗体最适滴度抗体最适滴度 抗体的选择抗体的选择 n首选直接标记抗体首选直接标记抗体 n荧光分子：荧光分子：PE最强，适用于弱表达抗原最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原最便宜，适用于强表达抗原 n间接标记：间接标记：适用范围广适用范围广, biotin-avidin不适不

16、适 合弱抗原的检测合弱抗原的检测 实验对照的设计实验对照的设计 n空白对照：空白对照：ALL n阴性对照：阴性对照：评估非特异反应水平，界定阴性范围 常用同型抗体对照常用同型抗体对照 单色分析：设阴性对照（单色分析：设阴性对照（或同型抗体对照或同型抗体对照） 多色分析：阴性对照（或同型对照），单阳性对照多色分析：阴性对照（或同型对照），单阳性对照 （用于仪器校正），（用于仪器校正），补偿调整管补偿调整管 n阳性对照：确定抗原表达正常时的抗原表达强度和百分含 量。（特别在检测阴性时）（特别在检测阴性时） 流式检测应用实例流式检测应用实例 n细胞表面、细胞内分子检测细胞表面、细胞内分子检测 n细胞

17、周期分析细胞周期分析 n细胞凋亡分析细胞凋亡分析 淋巴细胞表面抗原分析淋巴细胞表面抗原分析 n样本来源样本来源 新鲜抗凝全血新鲜抗凝全血 PBMC n单克隆荧光抗体染色单克隆荧光抗体染色 n溶血溶血 n洗细胞洗细胞 n固定固定 n上机检测上机检测 淋巴细胞细胞内抗原分析淋巴细胞细胞内抗原分析 n样本来源样本来源 新鲜抗凝全血新鲜抗凝全血 PBMC n细胞表面抗体染色细胞表面抗体染色 n溶血、固定溶血、固定 n细胞打孔细胞打孔 n细胞内抗体染色细胞内抗体染色 n上机检测上机检测 细胞周期分析：细胞周期分析： G1 M G2 S Quiescent cells G0 n处于不同细胞周期的细胞处于不

18、同细胞周期的细胞DNADNA含量不同，含量不同， G G0 0/G/G1 1期细胞含有期细胞含有二倍体二倍体量的量的DNADNA，G G2 2/M/M期期 细胞含有细胞含有四倍体四倍体量的量的DNADNA，而，而S S期细胞期细胞DNADNA 含量处于含量处于二倍体和四倍体量之间二倍体和四倍体量之间。 nDNADNA荧光染料能与荧光染料能与DNADNA结合，结合，DNADNA含量的多含量的多 少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度 反应了反应了DNADNA吸收荧光分子的多少。通过流吸收荧光分子的多少。通过流 式检测就能反映细胞内式检测就能反映细胞内DNADNA

19、的含量，区分的含量，区分 细胞周期的细胞周期的G G0 0/G/G1 1期、期、S S期和期和G G2 2/M/M期细胞比期细胞比 例。例。 样品制备 上机 DNA DNA 流式检测的主要指标流式检测的主要指标 nDNA 含量含量: ploidy：细胞内染色体细胞内染色体DNA含量含量 DI：测定标本的测定标本的G0/G1期细胞期细胞DNA含量与同种系正常细含量与同种系正常细 胞的胞的G0/G1期细胞期细胞DNA含量的比值，表示细胞倍体性含量的比值，表示细胞倍体性 nPI：增殖细胞占总周期细胞的比例增殖细胞占总周期细胞的比例 nCV： G0/G1期细胞期细胞DNA含量变异系数含量变异系数 An

20、nexin V Assay （建议用于悬浮细胞）（建议用于悬浮细胞） 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)位 于细胞膜内侧，一旦发生细胞凋亡， 可以从细胞膜的内侧迅速翻转到细胞 膜外侧，使得PS 暴露在细胞膜表面。 在Ca2+存在时，Annexin V 与PS 有很 高的亲和力，可与之迅速结合。PS 外 翻发生在细胞核破裂、DNA 片段化以 及凋亡相关蛋白出现之前，这使得 Annexin V 与PS 的结合成为凋亡早期 的一种重要检测标志事件。 PI 被用来区分存活的早期细胞和坏死 或晚期凋亡细胞。坏死细胞可以同时 与annexin V-FITC 和PI 结合显色，而 PI 则被排除在活细胞(F

21、ITC 阴性)和早 期凋亡细胞(FITC 阳性)之外。 Annexin V-FITC/ PI双染色法 双阴：活细胞 Annexin V-FITC单阳：早期凋亡细胞 双阳：晚期凋亡细胞 PI 单阳：坏死细胞 PI常用于鉴别死细胞。凋亡细胞的细胞膜仍然是完整的，所常用于鉴别死细胞。凋亡细胞的细胞膜仍然是完整的，所 以以PI不能进入早期凋亡细胞核内。不能进入早期凋亡细胞核内。 Annexin V-FITCAnnexin V-FITC PIPI 活细胞活细胞 早期凋亡早期凋亡 晚期凋亡晚期凋亡 坏死细胞坏死细胞 裸核裸核 进样速率控制进样速率控制 通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并通过改变

22、样本压力可以调节样本的进样速率，而这并 不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。 高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细 胞数就增加，这样会导致变异系数增加。胞数就增加，这样会导致变异系数增加。 电子数据系统构成：电子数据系统构成： n光电检测器光电检测器 将光信号转换成电子信号。将光信号转换成电子信号。 n前置放大电路前置放大电路 将信号等比例放大，输出电脉冲信号。将信号等比例放大，输出电脉冲信号。 n模数转换器模数转换器 将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。 n数据处理系统数据处理系统 计算机系统数据采集、分析。计算机系统数据采集、分析。 nForward scatter (FSC)Forward scatter (FSC) nSide scatter (SSC)Side scatter (SSC) nFL1-FL1-绿色绿色 nFL2-FL2-、橙色橙色 nFL3-FL