流式细胞仪FlowCytometer基础简介

1、主要内容主要内容 l流式细胞仪概要 l流式细胞仪的工作原理 l流式细胞仪测量的对象 什么是流式细胞仪什么是流式细胞仪 流式细胞仪实物流式细胞仪实物 BD FACSVantageBD-Calibur l流式细胞仪基本结构 FCMFCM的定义的定义 流式细胞仪是指，使细胞（或其 他粒子）以单个方式依次高速通过激 发光束，采集细胞被光照时产生的各 种信号，对信号进行处理，并对各参 数进行关联分析的一种仪器。 l对比 流式细胞仪是一种特殊的显微镜 流式细胞仪 显微镜 流动的细胞 静止的细胞样本 数量大 数量少 高速分选 样本难以再利用 细胞群体特征量分布 可以揭示细胞内部结构信息 流式细胞仪 蛋白胶

2、多参数 单参数 量化的分布 平均值 容易检测各个参数间的相关性 不容易 l功能特点 （1）多参数定量分析每一个细胞； （2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。 （3）高通量（分析分选） 分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒 l应用领域 疾病诊断 生物学基础研究 环境监测 海洋微生物研究 农业领域应用 等等 70年代美国为攻克癌症 而建造。 厂商： Becton-Dickson Coulter-Beckman DOCytomation 已成为一个几十亿美金 的产业 流式细胞仪工作原理流式细胞仪工作原理 流体动力学聚焦 流动

3、室 激光聚焦 液流与光源 探测光路聚焦 二色镜 1 2 3 带通滤波片 光电倍增管 激光束 细胞 收集透镜 前向 散射 光 侧向散射 光，荧光 光信号分离，导向，各探测通道PMT 接收并转化为电信号。 光信号收集 数据处理数据处理 FSC SSC FL1 FL2 FL3 对数对数 线性线性 线性线性 线性线性 对数对数 脉冲处理，模数转换 光信号 电信号 记录数据，显示结果 （面积，峰高，宽度） 流式细胞仪产生的信号流式细胞仪产生的信号 l非荧光信号 颗粒度 细胞大小 散射光信号区分裂解后的外周血细胞群 l荧光信号 荧光染料被激发而发射的光信号。 定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量

4、多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量 PIAnnexinV细胞凋亡检测 DNA含量-PI Annexin-V CD45 FITC (log) R1=单核细胞 (CD14+ve) R2=淋巴细胞 (CD45单核细胞) R3=中性粒细胞 (CD45单核细胞) CD14 PE (log) 前向散射光 (linear) 侧向散射光(linear) PEFITC荧光标记检测外周 血裂解后细胞群 细胞分选 流式细胞仪的测量对象流式细胞仪的测量对象 l大小 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 大小范围：0.2uM-300uM。 l对象类型 细胞类型： （1） 高等真核细胞； （2）酵母； （3）细菌； （4）多

5、细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒： 细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。 l流式细胞仪能够检测的细胞属性和组分举例 1）不需染色： 大小，胞浆颗粒度，细胞自发荧光，色素，细胞精确计数。 2）需染色或标记： 细胞组分： 细胞膜：流动性，通透性，膜电位 细胞内离子：H+（可检测PH值），Na+，K+，Ca2+（结合的和 自由 的）。 核酸：DNA含量，DNA成分，DNA合成，RNA，染色质结构等 总蛋白质 蛋白质分子间相互作用 抗原 细胞骨架成分 受体 功能属性： 酶活性 细胞凋亡 细胞坏死 细胞活性 氢硫基 凝血素结合位点 药物动力学 . 经验之谈：凡细胞内能进 行荧光标记的成分或者

6、某 种变化，都可用流式细胞 仪进行检测。 G1 S phase G2 M G1 12 1 DNA含量 DNA 含量 细胞周期时相 G0/1 G2/M S 细胞数 细胞周期分析 Hoechst 33258 （AT） Chromomycin A3 （GC） 白血病患者 2 4 5 6 X 8 9-12 7 recip 9-22 13 14 15 16 17 Y 18 20 19 22 21 Ph 1 / 3 染色体组型测定 1 3 生物物理所现有流式细胞仪生物物理所现有流式细胞仪 l型号：BD FACSVantage SE l参数：分析10，000个/ 秒，分选7，000个/秒； 激光：488nm，UV；四 色荧光通道。 l地点：1406 l联系方式：电话 64839306 或 ： 64862503 电子邮件 流式细胞仪 蛋白胶 多参数 单参数 量化的分布 平均值 容易检测各个参数间的相关性 不容易 探测光路聚焦 流式细胞仪产生的信号流式细胞仪产生的信号 l非荧光信号 颗粒度 细胞大小 散射光信号区分裂解后的外周血细胞群 流式细胞仪的测量对象流式细胞仪的测量对象 l大小 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 大小范围：0.2uM-300uM。 l对象类型 细胞类型： （1） 高等真核细胞； （2）酵母； （3）细菌； （4）多细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒： 细