琼脂糖凝胶电泳和SDSPAGE凝胶电泳2

1、凝胶电泳凝胶电泳分离长度分离长度 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳200bp近近50kb 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 5500bp 分辨率高分辨率高 采用不同浓度的凝胶可以分辨采用不同浓度的凝胶可以分辨DNA分子的范围分子的范围 2021-6-2112015/5/6 DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测的琼脂糖凝胶检测 2021-6-2122015/5/6 一、实验原理一、实验原理 电泳是现在用于分离和纯化DNA/RNA片段的最常 用技术。当制备好的一块“胶”即一块包含电解质的 多孔支持介质并把它置于静电场中，DNA/RNA分子将 向阳极移动，这是因为DNA/RNA分子沿其双螺旋骨架 两侧带有

2、富含负电荷的磷酸根残基。 当DNA/RNA长度增加时，来自凝胶的阻力就会增加， 不同长度的DNA/RNA片段就会出现不同的迁移率。因 而就可依据DNA/RNA分子的大小使其分离 2021-6-2132015/5/6 含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围 凝胶中的琼脂糖含量凝胶中的琼脂糖含量%(W/V)DNA/RNA分子的分离范围分子的分离范围(kb) 0.3560 0.6120 0.70.810 0.90.57 1.20.46 1.50.23 20.12 2021-6-2142015/5/6 核酸染料核酸染料 1. 溴化乙锭（溴化乙锭（EB）是一种为芳香族类染料，当）是

3、一种为芳香族类染料，当DNA样样 品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插就插 入入DNA分子中形成荧光络合物，使分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光发射的荧光 增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂 糖中的糖中的DNA。 2. Godview吖啶橙类核酸低毒染料目前尚未发现具有吖啶橙类核酸低毒染料目前尚未发现具有 致癌性。致癌性。 3. Genegreen花青素母体为基础，苯环改良成链式结花青素母体为基础，苯环改良成链式结 构的油性大分子，目前认为的最低毒的核酸绿色染料。构的油性大分子，目前

4、认为的最低毒的核酸绿色染料。 备注：一般将核酸染料加入备注：一般将核酸染料加入loading buffer中可以减少中可以减少 污染及减少用量（污染及减少用量（1ml loading buffer ：10ul染料）。染料）。 2021-6-215 2015/5/6 电泳缓冲液的组成电泳缓冲液的组成 1. Tris乙酸（乙酸（TAE） 2. Tris硼酸（硼酸（TBE） 3. Tris磷酸（磷酸（TPE） 其浓度约为其浓度约为50mmoL/L，PH为为7.57.8,这些缓冲液这些缓冲液 均含有均含有EDTA。这些缓冲液通常配制成浓缩液，贮存。这些缓冲液通常配制成浓缩液，贮存 于室温于室温。 20

5、21-6-216 2015/5/6 常用的电泳缓冲液的配制常用的电泳缓冲液的配制 缓冲液缓冲液使用液使用液浓贮存液（每升）浓贮存液（每升） Tris乙酸乙酸 （TAE） 1：0.04moL/L Tris乙酸乙酸 0.001moL/L EDTA 50：242g Tris碱碱 57.7mL 冰乙酸冰乙酸 100mL 0.5moL/L EDTA (PH8.0) Tris磷酸磷酸 （TPE） 1：0.09moL/L Tris磷酸磷酸 0.002moL/L EDTA 10：108g Tris碱碱 15.5mL 85%磷酸磷酸 40mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0) Tris硼酸硼酸 （TBE

6、） 0.50.045moL/L Tris硼酸硼酸 0.001moL/L EDTA 5：54g Tris碱碱 27.5g硼酸硼酸 20mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0) 2021-6-2172015/5/6 加样缓冲液加样缓冲液 缓冲液类型缓冲液类型 6缓冲液缓冲液贮存温度贮存温度 I 0.25%溴酚蓝溴酚蓝 0.25%二甲苯青二甲苯青FF 40%（W/V）蔗糖水溶液）蔗糖水溶液 4 II 0.25%溴酚蓝溴酚蓝 0.25%二甲苯青二甲苯青FF 15%聚蔗糖水溶液聚蔗糖水溶液 室温室温 III 0.25%溴酚蓝溴酚蓝 0.25%二甲苯青二甲苯青FF 30%甘油水溶液甘油水溶液 4 I

7、V 0.25%溴酚蓝溴酚蓝 40%（W/V蔗糖水溶液）蔗糖水溶液） 4 V （碱性加样缓冲液）（碱性加样缓冲液） 300m moL/L NaoH 6 mmoL/L EDTA 18%聚蔗糖水溶液聚蔗糖水溶液 015%溴甲酚绿溴甲酚绿 025%二甲苯青二甲苯青FF 4 2021-6-2182015/5/6 1. 加样缓冲液可以增大样品密度，以确保加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进均匀进 入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操 作更为便利。作更为便利。 2. 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为

8、二甲苯青FF 的的2.2倍倍, 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长 300bp的双链线性的双链线性DNA相同相同,而二甲苯青而二甲苯青FF在琼脂糖在琼脂糖 凝胶中移动的速率则与凝胶中移动的速率则与4kb双链线性双链线性DNA相同。相同。 2021-6-2192015/5/6 DNA片段长度标记 1. DNA片段长度标记通常叫作 DNA Marker, 2. 本实验使用MarkerIII，分别由200 bp、500 bp、800 bp、1200 bp、2000 bp、3000 bp和4500 bp的7条DNA 条带组成，DNA Marker不仅可以作为凝胶中

9、DNA片 段长度的一个标记，还可以作为电泳的对照。 2021-6-2110 2015/5/6 二、实验方法二、实验方法 1、50TAE的稀释：如制备的稀释：如制备50mL 1TAE，取，取1mL 50TAE加入加入49mL水定容至水定容至50mL。 2、制备、制备1%的琼脂糖胶液：取的琼脂糖胶液：取0.2g琼脂糖溶于琼脂糖溶于20mL TAE中，在短时间里加热琼脂糖全部熔化，使溶液中，在短时间里加热琼脂糖全部熔化，使溶液 冷却至冷却至60。 2021-6-21112015/5/6 2021-6-2112 2015/5/6 3、用于、用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙电泳的电

10、泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙 醇干燥后灌满醇干燥后灌满3% 的的H2O2溶液，于室温放置溶液，于室温放置10分钟，然后用分钟，然后用 DEPCSDW冲洗电泳槽，梳子同样处理。冲洗电泳槽，梳子同样处理。 4、在制胶槽中放好梳子。将融化的琼脂糖凝胶导入胶槽中。室温、在制胶槽中放好梳子。将融化的琼脂糖凝胶导入胶槽中。室温 冷却冷却15-20min 5、将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在、将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在35mm之间，凝固之间，凝固 1520min。 基本参数（北京六一）：基本参数（北京六一）： 外型尺寸（外型尺寸（LWH）：）：31015090mm 凝胶板规格凝胶板规格

11、(LW)：6060mm；12060mm；60120mm；120120mm 试样格：试样格：11+25齿齿(1.0mm厚厚)；6+13齿齿,8+18齿齿(1.5mm厚厚)；2+3齿齿(2.0mm厚厚) 缓冲液总容量：约缓冲液总容量：约650ml 重量：重量：1Kg2021-6-2113 2015/5/6 6、在凝胶完全凝固之后，小心垂直移去梳子，将胶床放在电泳槽、在凝胶完全凝固之后，小心垂直移去梳子，将胶床放在电泳槽 内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。 7、向电泳槽中注入适量的、向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。

12、8、分别将、分别将DNA/RNA样品与加样缓冲液混合样品与加样缓冲液混合,用移液枪将样品加入用移液枪将样品加入 加样孔。加样孔。 9、正确连接电泳槽和电源，设定稳压为、正确连接电泳槽和电源，设定稳压为140V，电流一般为，电流一般为50mA。 10、电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察。、电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察。 2021-6-2114 2015/5/6 三、注意事项与实验技巧三、注意事项与实验技巧 1. 制胶和加样过程中要防治气泡的产生。制胶和加样过程中要防治气泡的产生。 2. 紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太

13、长。 3. EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。 4. 加样时，加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否 则样品渗漏或则样品渗漏或DNA带型不整齐。带型不整齐。 5. 配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。因为配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。因为pH 或离子强度很或离子强度很 小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，影响小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，影响DNA 片段的泳动。片段的泳动。 6. 梳板的选用梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，一般每个制胶模具均

14、配有多个齿型不同的梳板， 梳齿宽厚，形成的点样容积较大，用于梳齿宽厚，形成的点样容积较大，用于DNA 片段回收实验等；片段回收实验等； 相反，梳齿窄而薄，形成的点样容积就较小，用于相反，梳齿窄而薄，形成的点样容积就较小，用于PCR产物、产物、 酶切产物鉴定等。一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制酶切产物鉴定等。一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制 胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。 2021-6-2115 2015/5/6 四、跑出好看的电泳图四、跑出好看的电泳图 1. 凝胶一定要加热熔解完全，均匀，可以对着光亮的地方看看清凝胶一定要加热熔解完

15、全，均匀，可以对着光亮的地方看看清 澈不清澈澈不清澈 ； 2. 一般情况下，梳子越薄而长，条带越好看一般情况下，梳子越薄而长，条带越好看 ； 3. 上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压；上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压； 4. 如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘效应如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘效应 ，中间，中间 电场比较均匀电场比较均匀 ； 5. 做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致； 6. 加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔内加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔内 ； 7. 电泳开始时可以采用低电压使其

16、跑出孔后，再调高电压。电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。 2021-6-2116 2015/5/6 SDS-PAGE凝胶电泳凝胶电泳 实实 验验 二二 2021-6-2117 SDS-PAGE凝胶电泳凝胶电泳 1.1.实验原理实验原理 2.2.实验步骤实验步骤 3.3.注意事项注意事项 4.SDS-PAGE的优点的优点 5.SDS-PAGE的缺点的缺点 6.6.实验常见问题及处理实验常见问题及处理 7.7.小技巧小技巧 2021-6-2118 实验原理实验原理 l基本原理基本原理 l分类分类 l分离范围分离范围 2021-6-2119 丙丙烯烯酰胺酰胺 N,N-亚甲基双亚甲基双

17、丙烯酰胺丙烯酰胺 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 四甲基乙二胺四甲基乙二胺( (TEMED) ) 过硫酸胺过硫酸胺(AP) 激活作用激活作用 激活作用激活作用 共聚合共聚合 2021-6-2120 基本原理之一基本原理之一 l阴离子去污剂阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间破坏蛋白质分子之间 及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质 变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充 分结合形成带负电荷的蛋白质分结合形成带负电荷的蛋白质- -SDS复合物。复合物。 l强还原剂巯基乙醇强还原剂巯基乙醇打开蛋白质分子内的打开蛋白质分子内的

18、 二硫键使这种结合更加充分。二硫键使这种结合更加充分。 2021-6-2121 基本原理之二基本原理之二 l结合了结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长的蛋白质在水溶液中的形状类似于长 椭圆棒，不同的蛋白质椭圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短复合物其椭圆棒的短 轴长度恒定，而长轴的长度则与轴长度恒定，而长轴的长度则与蛋白质分子量蛋白质分子量的的 大小成正比。大小成正比。 l这样的蛋白质这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移复合物在电场作用下，其迁移 率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的 影响，而主要取决于其分子量大小这一因

19、素。根影响，而主要取决于其分子量大小这一因素。根 据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小 分开。分开。 2021-6-2122 分类分类 PAGE根据其有无浓缩效应根据其有无浓缩效应，分为连连 续系统续系统和不连续系统不连续系统两大类. 连续系统电泳体系中连续系统电泳体系中, ,缓冲液缓冲液pH值及凝值及凝 胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主 要靠电荷和分子筛效应要靠电荷和分子筛效应。 2021-6-2123 2021-6-2124 不连续系统不连续系统 l不连续系统中由于缓冲液离子成分，不连续系统中由于缓冲液

20、离子成分，pH， 凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗 粒在电场中泳动不仅有粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛电荷效应，分子筛 效应，还具有浓缩效应效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带，因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳。清晰度及分辨率均较前者佳。 2021-6-2125 浓缩胶浓缩胶 l浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小， 孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过 大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的 区带。区带。 分离胶

21、分离胶 l孔径较小孔径较小,通过选择合适的凝胶浓度通过选择合适的凝胶浓度,可以可以 使样品很好的分离使样品很好的分离. 2021-6-2126 lSDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚聚 丙烯酰胺的浓度和交联度丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的。在没有交联剂的情况下聚合的 丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联 后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS-蛋白质蛋白质 复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随复合物必须

22、通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰双丙烯酰 胺丙烯酰胺胺丙烯酰胺” 比率的增加而变小比率的增加而变小，比率接近，比率接近 1：20 时孔时孔 径达到最小值。径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰双丙烯酰 胺丙烯酰胺胺丙烯酰胺”为为1：29 配制，试验表明它能分离大小相配制，试验表明它能分离大小相 差只有差只有3% 的蛋白质。的蛋白质。 分离范围分离范围 2021-6-2127 变性胶变性胶浓缩胶浓缩胶 10%8 ml5%4ml (2 cm) H2O3.2 mlH2O3.2 ml 30% 丙烯酰胺2.7 ml30% 丙烯酰胺0.67 ml 1.5M Tris

23、HClPH8.82 ml1 M TrisHClPH8.81 ml 10% SDS100 l10% SDS50 l 10% AP50 l10% AP25 l TEMED5 lTEMED5 l 2021-6-2128 活性胶活性胶 6%8 ml H2O4.2 ml 30% 丙烯酰胺1.67 ml 1.5M TrisHClPH8.82.02 ml 10% AP100 l TEMED10 l 胶的配制方法胶的配制方法 l凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌 胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。 用用51

24、5%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围 如下表：如下表： 丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围线性分离范围（kD） 151243 101668 7.53694 5.057212 双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为 1：29。 2021-6-2129 上样缓冲液之一上样缓冲液之一 上样缓冲液上样缓冲液(SDS-PAGE loading buffer)是一种以是一种以 溴酚蓝溴酚蓝为染料，为染料，5倍浓缩的倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样凝胶电泳上样 缓冲液，用于常规的缓冲液，用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。蛋白电泳样品上样

25、。 本产品分为本产品分为还原型和非还原型还原型和非还原型两种，还原型上两种，还原型上 样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链 间二硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此间二硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此 分离，在电泳凝胶上显现多个蛋白条带，选购和使分离，在电泳凝胶上显现多个蛋白条带，选购和使 用时请务必注明，仔细区分。用时请务必注明，仔细区分。 2021-6-2130 上样缓冲液上样缓冲液 之二之二 l注意事项注意事项 还原型上样缓冲液中含一定量的还原型上样缓冲液中含一定量的DTT（二（二 硫苏糖醇）硫苏糖醇）或巯基乙醇，有轻微刺激

26、性气味，或巯基乙醇，有轻微刺激性气味， 较易区分；较易区分； 含巯基的试剂有一定的毒性，为了安全和含巯基的试剂有一定的毒性，为了安全和 健康，应穿健康，应穿实验服并戴一次性手套操作实验服并戴一次性手套操作。 2021-6-2131 上样缓冲液上样缓冲液 之三之三 使用说明使用说明 1.1.按每按每4 l蛋白样品加入蛋白样品加入1l蛋白上样缓冲液的比蛋白上样缓冲液的比 例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5X)。 2. 100或沸水浴加热或沸水浴加热35min，以充分变性蛋，以充分变性蛋 白。白。 3. 冷却到室温后取上清直接上样到冷却到室温后取上清直接上样到SDS

27、-PAGE胶胶 加样孔内即可。加样孔内即可。 4. 通常电泳时染料到达胶的底端附近（通常电泳时染料到达胶的底端附近（0.5 1cm)即可停止电泳。即可停止电泳。 2021-6-2132 增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔 内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油甘油 或蔗糖或蔗糖，这样可以增加样品的比重。，这样可以增加样品的比重。 上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加 粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩 散出来到电泳缓冲液中。散出来到电泳缓冲液中。 指示剂

28、检测电泳的行进过程指示剂检测电泳的行进过程，一般加入，一般加入 泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿 。 上样缓冲液上样缓冲液 之四之四 2021-6-2133 单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实 验中使用两种混和的固定液。验中使用两种混和的固定液。Carnoy固定液（甲醇固定液（甲醇: : 冰乙酸冰乙酸= =3:l）每次使用前需临时配制每次使用前需临时配制，长时间放置影，长时间放置影 响固定效果，固定时间响固定效果，固定时间15min至至24 h，冰箱、室温均，冰箱、室温均 可。可。 甲醇甲醇/冰醋酸固定液冰醋

29、酸固定液 2021-6-2134 甲醇甲醇/冰醋酸固定液冰醋酸固定液 甲醇甲醇：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、 球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差(亲和力小 且易自溶)。甲醇固定的特点是杀死快，渗透力强，对 组织收缩较大(可收缩20左右)，可使材料变硬。 冰醋酸冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又 称为冰醋酸。常用0.30.5的浓度作为固定液。冰醋 酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、 氯仿混合。 2021-6-2135 电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、 脱色后的凝胶照片脱色后的凝胶照片 图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱 9

30、4 000 62 000 43 000 31 000 20 100 14 400 注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3样品蛋白 考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色 常用染色方法常用染色方法 银染法银染法 金属离子染色法金属离子染色法 以考马斯亮蓝染色为例以考马斯亮蓝染色为例 蛋白质与考马斯亮蓝蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在结合在2min左右的时间内达到左右的时间内达到 平衡测定蛋白质浓度范围为平衡测定蛋白质浓度范围为01000gmL，是一种常用，是一种常用 的微量蛋白质快速测定方法。的微量蛋白质快速测定方法。 2021-6-2136 实验步骤实验步骤 试剂配制试剂配制 (1) 30%丙烯酰胺（丙烯酰

31、胺（Acr）：）：称Acr30g，甲叉双 丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤 后置棕色瓶中。 4，12月 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L Tris-HCl缓冲液缓冲液(pH8.9)： 称取Tris 18.2g, 加入50ml水,用1mol/L盐酸调 pH8.8,最后用蒸馏水定容至100ml。 2021-6-2137 （4）1.0mol/LTris-HCl缓冲液缓冲液(pH6.8): 称取Tris12.1g,加入50ml水，用1mol/L 盐酸调pH6.8,最后用蒸馏水定容至100ml （5）0.05mol/LTris-HCl缓冲液缓冲液(pH8

32、.0)： 称取Tris0.6g,加入50ml水，用1mol/L盐酸 调pH8.0,最后用蒸馏水定容至100ml （）TEMED（四甲基乙二胺） 2021-6-2138 （）（）上样缓冲液上样缓冲液： SDS（100mg）+巯基乙醇（巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝溴酚蓝 （2mg）+甘油（甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl （2ml），最后定容至），最后定容至10ml （）固定液：（）固定液：50%甲醇甲醇454ml，冰乙酸，冰乙酸46ml混匀混匀 （）染色液：（）染色液：称取考马斯亮蓝称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加，加 上述固定液上述固定液250ml，过

33、滤后备用，过滤后备用 2021-6-2139 （1）脱色液：）脱色液： 冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至 1000ml （1）电极缓冲液）电极缓冲液 （内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g， 甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解 后定容至1000ml 2021-6-2140 （1212）高分子量标准蛋白试剂盒）高分子量标准蛋白试剂盒: : 兔磷酸化酶兔磷酸化酶B MW=97,400 B MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200MW=66,200 兔肌动蛋白兔肌动蛋白

34、MW=43,000MW=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400MW=14,400 置置-20-20保存，使用前室温融化，沸水浴中加热保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-3- 5 5分钟后上样。分钟后上样。 （1313）样品：兔血清）样品：兔血清 2021-6-2141 .聚胶前准备聚胶前准备 (1) 配制配制10过硫酸铵溶液过硫酸铵溶液(需每天新鲜配需每天新鲜配 制制)。 (2) 将单体储存液、缓冲液、水按照一定比将单体储存液、缓冲液、水按照一

35、定比 例配制成凝胶溶液。例配制成凝胶溶液。 (3) 将灌胶装置准备好。将灌胶装置准备好。 (4) 待凝胶溶液平衡至室温待凝胶溶液平衡至室温(2325)后，真后，真 空脱气空脱气15 min。 2021-6-2142 1）.安装膜具 将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, , 将凡士林均将凡士林均 匀的涂在两侧的封条上，用封条将玻璃板匀的涂在两侧的封条上，用封条将玻璃板 封好。封好。 称取称取2g2g琼脂糖加琼脂糖加100ml100ml蒸馏水，慢慢的煮蒸馏水，慢慢的煮 开（煮的过程中要不断搅拌），将煮好的开（煮的过程中要不断搅拌），将煮好的 ( (无气泡无气泡) )琼脂糖倒入支胶架三

36、分之二高度，琼脂糖倒入支胶架三分之二高度， 快速将两侧封好的玻璃板插入琼脂糖中，快速将两侧封好的玻璃板插入琼脂糖中， 注意注意凹槽朝外凹槽朝外，用夹子固定好，用夹子固定好，待凝固待凝固后后 灌胶。灌胶。 2021-6-2143 2）制备SDS聚丙烯酰胺凝胶 制备分离胶制备分离胶 30%30%丙烯酰胺丙烯酰胺5ml + 5ml + 分离胶缓冲液分离胶缓冲液 5ml5ml +10%SDS 0.2ml +10% +10%SDS 0.2ml +10%过硫酸铵过硫酸铵 0.2ml + 0.2ml + 蒸蒸 馏水馏水 9.6 ml9.6 ml；混匀后加入；混匀后加入8ul TEMED,8ul TEMED,

37、立即混匀立即混匀 （不能有气泡），灌入安装好的垂直板中，灌胶（不能有气泡），灌入安装好的垂直板中，灌胶 时要匀速贴壁流入，防止气泡产生。灌至离槽沿时要匀速贴壁流入，防止气泡产生。灌至离槽沿 3cm3cm处，处，立即立即在胶面上用移液管加入在胶面上用移液管加入1-2cm1-2cm的蒸馏的蒸馏 水，静置，待凝胶聚合后（约水，静置，待凝胶聚合后（约30min30min），去除水），去除水 相，然后用相，然后用吸水纸吸干残余的水吸水纸吸干残余的水。 2021-6-2144 制备浓缩胶制备浓缩胶 30%30%丙烯酰胺丙烯酰胺 1.32ml + 1.32ml + 浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液 1ml1ml +

38、10%SDS 0.08ml +10% AP 0.08ml + +10%SDS 0.08ml +10% AP 0.08ml + 蒸馏水蒸馏水 5.6 5.6 mlml；混匀后加入；混匀后加入8ul TEMED,8ul TEMED,立即混匀（不能有气立即混匀（不能有气 泡），灌入垂直板至离槽沿泡），灌入垂直板至离槽沿0.5cm0.5cm处，插入梳子处，插入梳子 （不能混入气泡），静置，待凝胶聚合后，加入（不能混入气泡），静置，待凝胶聚合后，加入 电泳缓冲液，拔去梳子。电泳缓冲液，拔去梳子。 2021-6-2145 先用刀片先用刀片将琼脂糖剥离开，再将玻璃板从架子上将琼脂糖剥离开，再将玻璃板从架子上

39、 取出，再用夹子固定在电泳槽内（注意凹槽朝取出，再用夹子固定在电泳槽内（注意凹槽朝 内），将电泳缓冲液倒入电泳槽内。内），将电泳缓冲液倒入电泳槽内。 3)3). .样品预处理样品预处理 取取0.5ml0.5ml样品加入样品加入0.5ml0.5ml上样缓冲液，置沸水上样缓冲液，置沸水 中煮中煮5 5分钟。分钟。 4)4). .上样上样 第一个孔内加第一个孔内加20ul20ul标准蛋白质溶液标准蛋白质溶液 其他每孔加入其他每孔加入20ul20ul样品。上样时要将移液枪头样品。上样时要将移液枪头 垂直插入孔内且要缓慢匀速推入样品。垂直插入孔内且要缓慢匀速推入样品。 2021-6-2146 垂直板垂直

40、板 电泳装置电泳装置 加样加样 样品迁样品迁 移方向移方向 2021-6-2147 5)5). .电泳电泳 接通电源，将电压调至接通电源，将电压调至80V80V、50mA50mA。当溴酚兰进入分。当溴酚兰进入分 离胶后，把电压提高到离胶后，把电压提高到150V150V、80mA80mA，电泳至溴酚兰距离胶，电泳至溴酚兰距离胶 底部底部1-2cm1-2cm处，停止电泳。处，停止电泳。 6)6). .固定固定 取下凝胶，置于培养皿中的固定液中，轻轻振摇取下凝胶，置于培养皿中的固定液中，轻轻振摇1010分分 钟，倒去固定液。钟，倒去固定液。 7)7). .染色脱色染色脱色 培养皿中倒入培养皿中倒入5

41、0-6050-60度预热的染色液浸没凝胶，约度预热的染色液浸没凝胶，约4040 分钟后回收染色液，用清水冲洗掉胶上多余的染色液。倒分钟后回收染色液，用清水冲洗掉胶上多余的染色液。倒 入脱色液，脱色入脱色液，脱色2 2小时，期间换脱色液小时，期间换脱色液2-32-3次。次。 2021-6-2148 电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头， 大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一 个带孔胶粒。个带孔胶粒。 混合样品混合样品 带孔胶带孔胶 按分子按分子 大小分离大小分离 电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子 大

42、分子大分子 2021-6-2149 夹在两块玻璃夹在两块玻璃 板之间的凝胶板之间的凝胶 电泳电泳 缓冲液缓冲液 电泳电泳 缓冲液缓冲液 加在槽中的经加在槽中的经 SDS处理的样品处理的样品 分子量小分子量小 分子量大分子量大 电源电源 2021-6-2150 标准蛋白分子量标准蛋白分子量 未未 知知 蛋蛋 白白 在一定的凝胶浓度下，在一定的凝胶浓度下， 多肽链分子量的对数与多肽链分子量的对数与 多肽链的相对迁移率成多肽链的相对迁移率成 线性关系，所以可以通线性关系，所以可以通 过标准曲线求未知多肽过标准曲线求未知多肽 链分子量链分子量。 相对迁移率相对迁移率 .结果处理结果处理 2021-6-

43、2151 实验注意事项实验注意事项 1. 1.形成凝胶的试剂要有足够的形成凝胶的试剂要有足够的纯度纯度：丙烯酰胺是：丙烯酰胺是 形成凝胶溶液中的最主要成份，其纯度的好坏形成凝胶溶液中的最主要成份，其纯度的好坏 将直接影响凝胶的质量，丙烯酰胺可能混有的将直接影响凝胶的质量，丙烯酰胺可能混有的 影响凝胶形成的杂质有：线性多聚丙烯酰胺、影响凝胶形成的杂质有：线性多聚丙烯酰胺、 金属离子等。金属离子等。 2. 2. 注意不能随便倾倒注意不能随便倾倒单体溶液单体溶液，应加入过量的催，应加入过量的催 化剂使其完全聚合成无毒性的聚丙烯酰胺后再化剂使其完全聚合成无毒性的聚丙烯酰胺后再 弃置。弃置。 2021-

44、6-2152 3. TEMED中混有氧化试剂后其自身极易中混有氧化试剂后其自身极易 被氧化而失去催化能力，另外被氧化而失去催化能力，另外TEMED的的 氧化产物氧化产物呈黄色呈黄色，以此可以鉴定，以此可以鉴定TEMED 的质量。如果无法获得无色透明的的质量。如果无法获得无色透明的 TEMED，只能适当增加用量以保证聚胶，只能适当增加用量以保证聚胶 速度。速度。 2021-6-2153 l4. 过硫酸铵过硫酸铵容易吸潮，由于它溶解于水后容易吸潮，由于它溶解于水后 很快降解失去催化能力，因此潮解后的过硫酸很快降解失去催化能力，因此潮解后的过硫酸 铵会渐渐失去活性。保存固体过硫酸铵应密闭铵会渐渐失去

45、活性。保存固体过硫酸铵应密闭 干燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。另外在干燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。另外在 配制凝胶溶液时过硫酸铵不易过量，否则会使配制凝胶溶液时过硫酸铵不易过量，否则会使 蛋白质在电泳过程中被氧化蛋白质在电泳过程中被氧化(主要指天然无变性主要指天然无变性 剂凝胶剂凝胶)。 2021-6-2154 5. 激活剂的用量激活剂的用量: 激活剂的浓度适当与否激活剂的浓度适当与否 不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶 的质量。增加过硫酸铵或的质量。增加过硫酸铵或TEMED的用量，将的用量，将 使丙烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶会变得脆弱使丙烯

46、酰胺聚合链长度缩短，凝胶会变得脆弱 而失去应有的柔性。二者多至一定程度时，聚而失去应有的柔性。二者多至一定程度时，聚 合链长度过短，将不会形成肉眼可见的凝胶，合链长度过短，将不会形成肉眼可见的凝胶， 这些短链多聚物呈溶液状，只是其粘度较聚合这些短链多聚物呈溶液状，只是其粘度较聚合 前高一些。前高一些。 2021-6-2155 6. 温度的影响温度的影响聚胶的最佳温度为聚胶的最佳温度为2325 ，需要注意灌胶前单体溶液，需要注意灌胶前单体溶液(通常置于通常置于4冰冰 箱箱)及玻璃板或管及玻璃板或管(有时从烘箱取出有时从烘箱取出)也要平衡至也要平衡至 此温度。由于溶液在抽真空时仍维持较低温度，此温

47、度。由于溶液在抽真空时仍维持较低温度， 需待其升至室温后再脱气，另外升温后脱去氧需待其升至室温后再脱气，另外升温后脱去氧 气的速度较低温时快。气的速度较低温时快。 2021-6-2156 7. 氧气的影响氧气的影响氧气会与被激活的单体自由基氧气会与被激活的单体自由基 作用抑制聚合过程，因此需在加激活剂前对单作用抑制聚合过程，因此需在加激活剂前对单 体溶液脱气。如果省去这一步骤，凝胶仍能聚体溶液脱气。如果省去这一步骤，凝胶仍能聚 合但需更多的激活剂，并且不能保证很好的重合但需更多的激活剂，并且不能保证很好的重 复性，充分去除氧气可以用尽量少的激活剂得复性，充分去除氧气可以用尽量少的激活剂得 到最

48、佳聚合效果。通常在较好的真空度脱气至到最佳聚合效果。通常在较好的真空度脱气至 少少15 min 。 2021-6-2157 8. 凝胶添加剂：凝胶添加剂：凝胶中常常加入凝胶中常常加入SDS、 尿素、尿素、Triton X-100等添加剂。等添加剂。SDS加加 入后不会对凝胶的聚合产生影响，但尿入后不会对凝胶的聚合产生影响，但尿 素会使凝胶孔径变小，这一特性可用来素会使凝胶孔径变小，这一特性可用来 分离小分子蛋白质或多肽。分离小分子蛋白质或多肽。 2021-6-2158 9. 聚胶时间：聚胶时间：虽然应用过硫酸铵虽然应用过硫酸铵 TEMED催化后灌胶催化后灌胶1520 min即可观察即可观察 到

49、凝胶的形成，但至少需到凝胶的形成，但至少需90 min才能保证才能保证 95以上的单链聚合成长短以及具有合以上的单链聚合成长短以及具有合 适的孔径大小。采用核黄素时聚胶时间适的孔径大小。采用核黄素时聚胶时间 需更长，但它一般用于等电聚焦即根据需更长，但它一般用于等电聚焦即根据 蛋白质的电荷性质进行分离，对孔径大蛋白质的电荷性质进行分离，对孔径大 小要求不高，因此不必等很长时间小要求不高，因此不必等很长时间(完全完全 聚合需聚合需8 h)。 2021-6-2159 10. 单体的浓度单体的浓度：是指单体总重量是指单体总重量(丙烯酰丙烯酰 胺胺+bis)在溶液中的百分比在溶液中的百分比(wv)，可

50、选择的范，可选择的范 围为围为330，单体浓度增加后聚合速度将加，单体浓度增加后聚合速度将加 快，因此可适当减少催化剂的用量。快，因此可适当减少催化剂的用量。 11. SDS与蛋白质的结合按质量成比例与蛋白质的结合按质量成比例（即：（即： 1.4g SDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，蛋白质），蛋白质含量不可以超标， 否则否则SDS结合量不足。结合量不足。 2021-6-2160 12. 用用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相 对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用 这次的标准曲线作为下次用。并且这次的标准曲

51、线作为下次用。并且SDS-PAGE测测 定分子量有定分子量有10误差，不可完全信任。误差，不可完全信任。 13. 有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋 白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法 测相对分子量。测相对分子量。 2021-6-2161 14. 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以 上肽链（上肽链（-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基 乙醇和乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。的作用下解离成亚基或多条单肽链。 因此，对于这一类蛋

52、白质，因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝 胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链 的相对分子量。的相对分子量。 15. 如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清 晰等现象，可能是晰等现象，可能是SDS不纯引起不纯引起。 2021-6-2162 常见问题及处理办法常见问题及处理办法 、纹理和拖尾现象、纹理和拖尾现象 由于样品溶解不佳引起的，克服的方法可以在由于样品溶解不佳引起的，克服的方法可以在 加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素。加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素。 、蛋白带过宽蛋白带过

53、宽，与邻近泳道的蛋白带相连是由于与邻近泳道的蛋白带相连是由于 加样量太多，可以减少上样量。加样量太多，可以减少上样量。 电泳时间比正常要长电泳时间比正常要长 可能由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的可能由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的pH选择选择 错误。错误。 指示剂成微笑符号指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲（指示剂前沿呈现向上的曲 线形）：说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却线形）：说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却 不好，导致分子有不同的迁移率不好，导致分子有不同的迁移率。 2021-6-2163 .指示剂成微笑符号指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现（指示剂前沿呈现向下向下的曲线的曲线 形

54、）。形）。 由于电泳槽的装置不合适，尤其是凝胶和玻璃由于电泳槽的装置不合适，尤其是凝胶和玻璃 板组成的板组成的“三明治三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝底部有气泡或靠近隔片的凝 胶聚合不完全胶聚合不完全 .凝胶时间不对。凝胶时间不对。 通常胶在通常胶在30min内凝聚如果凝聚得太慢，可能是内凝聚如果凝聚得太慢，可能是 TEMED，APS剂不够或者失效。剂不够或者失效。 7.出现出现“皱眉皱眉”（两边向下中间鼓起）（两边向下中间鼓起） 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两 板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：

55、可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 2021-6-2164 8.8.出现出现“鬼带鬼带” 如何处理？如何处理？ “鬼带鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质就是在跑大分子构象复杂的蛋白质 分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中） 的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主 要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性， 致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚 基重新缔合，聚合成大分

56、子，其分子量要比目标基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标 条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条 带有相同的免疫学活性，在带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能反应中可见其能 与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热 煮沸后，再添加适量的煮沸后，再添加适量的DTT或或Beta巯基乙醇，以巯基乙醇，以 补充不足的还原剂；或可加适量补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还来阻止还 原剂的氧化。原剂的氧化。 2021-6-2165 9.9.为什么溴酚蓝不能起到指示作用？为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底， 但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液 和分离胶的浓度有关。处理办法：