实验三 海洋动物目的基因的发育

1、一、目的要求一、目的要求 掌握掌握RNA原位杂交的原理原位杂交的原理; 熟悉胚胎整体原位杂交操作技术；熟悉胚胎整体原位杂交操作技术； 加深对发育过程中基因表达时空特性的理解加深对发育过程中基因表达时空特性的理解 实验三实验三 海洋动物目的基因的发育表达图式海洋动物目的基因的发育表达图式 二、原位杂交技术原理二、原位杂交技术原理 定义：定义：是一种应用标记探针与胚胎或组织细胞中的待测是一种应用标记探针与胚胎或组织细胞中的待测 核酸杂交（碱基配对），再应用标记物相关的检测系核酸杂交（碱基配对），再应用标记物相关的检测系 统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术统，在核酸原有的位置将其显示出来

2、的一种检测技术 整体原位杂交（Whole-mount in situ hybridization）：）： 将目的基因的探针与胚胎整体进行杂交的方法 带有标记物的已知序带有标记物的已知序 列的核酸片段列的核酸片段 地高辛（地高辛（DIG）标记的）标记的UTP ALP标记的标记的Anti-DIG抗体抗体 ALP 碱性磷酸酶显色碱性磷酸酶显色 DIG Anti-DIG抗体抗体 ALP ALP底物底物 RNA原位杂交原理：主要是利用碱基互补原理，将体外合成 的带有标记的单链反义RNA（RNA探针）与组织或细胞中待 测的mRNA发生杂交，从而将探针定位在靶基因的表达区域内。 再通过显色反应，显示其表达部

3、位。显色反应，显示其表达部位。 标记物的种类分为2种，即 非放射性的标记物（地高辛 (DIG)和生物素(BIO)）或带 有放射性的同位素(32P)。 探针间接标记法探针间接标记法 DIG标记标记 实验动物：栉孔扇贝胚胎和幼虫实验动物：栉孔扇贝胚胎和幼虫 目的基因：目的基因：vasa基因基因 生殖细胞的标记分子生殖细胞的标记分子 三、实验材料三、实验材料 四、胚胎原位杂交的实验流程四、胚胎原位杂交的实验流程 RNA探针合成（以探针合成（以cDNAcDNA为模板，为模板， 通过体外转录获得）通过体外转录获得） 思考：如何确保探针特异性？思考：如何确保探针特异性？ 反义反义RNA探针探针 正义正义R

4、NA探针探针 Hind线性化质 粒 1 gEcoR线性化质 粒 1 g 10转录缓冲液2 l10转录缓冲液2 l 10NTP2 l10NTP2 l RNase抑制剂1 lRNase抑制剂1 l T7 RNA聚合酶2 lSP6 RNA聚合酶2 l DEPC处理水至20 lDEPC处理水至20 l 胚胎固定：胚胎固定：4多聚甲醛多聚甲醛(PBS配制配制)， 保存于保存于100%甲醇中（甲醇中（-20） 体外转录体外转录 带有T7/SP6噬菌体 转录启动子的载体 杂交流程（第一天）杂交流程（第一天） 胚胚 胎胎 预预 处处 理理 预杂交预杂交 杂交杂交 1. 复水：甲醇复水：甲醇/PBT (75/2

5、5.50/50.25/75) 各各5min 1ml PBT 2次次 各各5min 3.4%多聚甲醛后固定多聚甲醛后固定20min 1ml PBT，5次次 各各5min 无探针的杂交液，水浴锅内无探针的杂交液，水浴锅内60孵育孵育6h 含含变性探针变性探针的杂交液的杂交液100l，水浴锅内，水浴锅内60 过夜过夜 PBT/杂交液杂交液（1：1），），10 min (12-16 h)(12-16 h) 500 500 l TEA 2TEA 2次，次， 5 min/5 min/次次 1ml PBT 21ml PBT 2次，次，5 5 min/min/次次 2020 以上过程，为以上过程，为防止防止R

6、NA酶污染酶污染，操作时需戴手套和口罩。，操作时需戴手套和口罩。 试剂和容器处理：试剂和容器处理：DEPC（焦碳酸二乙酯）或（焦碳酸二乙酯）或180 复水、消化、后固定复水、消化、后固定杂交、预杂交杂交、预杂交 抗抗 体体 孵孵 育育 和和 显显 色色 洗脱洗脱 观察观察 杂交流程（第二天）杂交流程（第二天） 3.显色：显色：AP buffer洗洗 2次次,各各5min 0.5ml显色液避光显显色液避光显色色(室温室温 30 min 2 h)；4过夜过夜)，得得 到合适杂交信号后到合适杂交信号后PBT洗洗2次次 中止反应中止反应 2. 孵育：孵育：0.5ml含稀释含稀释2000 倍倍 抗体的封

7、闭液抗体的封闭液2h 洗脱缓冲液洗洗脱缓冲液洗2次次 再洗再洗6次次 1.封闭封闭: 0.5ml 封闭液封闭液1h 胚胎置于胚胎置于80 % 甘油中，显微镜下观察甘油中，显微镜下观察 60预热洗脱液预热洗脱液 1-3 各洗各洗1次，各次，各20min 60预热洗脱液预热洗脱液 4洗洗1次，次， 洗洗30min 胚胎预处理胚胎预处理 预杂交和杂交预杂交和杂交 洗脱和抗体孵育洗脱和抗体孵育 显色和观察显色和观察 实验主要阶段实验主要阶段 思考：各关键步骤的目的和原理，思考：各关键步骤的目的和原理， 如何确定最佳条件如何确定最佳条件 原位杂交流程 - 1 1）取存于100%甲醇的样品置于梯度甲醇/P

8、BT（3/1; 1/1; 1/3）中依次复水， 1 ml/次, 10 min/次，使样品完全沉于管底； 2）复水后用1 ml PBT洗2次；每次10 min； 3）500 l蛋白酶K（2 g/ml），37 水浴30 min（胚胎）或40 min（幼虫）； 4）500 l TEA（0.1 M）处理2次，每次10 min； 5）1 ml PBT洗2次，每次10 min； 6）1 ml 4%聚甲醛后固定20 min； 7）1 ml PBT洗5次，每次10 min； 8）PBT/预杂交液（1：1）室温10 min； 9）500 l预杂交液中于60水浴锅中预杂交6 h（至少3 h）； 10） 200 l

9、 杂交液（含探针，工作浓度1 g/ ml ）， 60杂交过夜（一般不 少于16 h），注意使所有胚胎和幼虫悬浮 原位杂交流程 - 2 11）60 洗脱（各1 ml）： Hybridization buffer/2SSC（1/1）洗20 min， Hybridization buffer/2SSC（1/3）洗20 min， 2SSC 2次，10 min/次， 1SSC 10 min， 0.2SSC+0.1%Tween-20 2次，30 min/次（可调）； 12）1 ml MaNaT室温洗2次，每次10 min； 13）500 l Blocking Buffer室温封闭1 h以上； 14）500

10、 l抗体孵育液（抗地高辛抗体加入Blocking Buffer 中，1：2000）中室温孵育2 h（或4 过夜，16 h以内）； 15）1 ml MaNaT室温洗2次，每次10 min； 16）1 ml MaNaT室温洗6次，每次15 min； 17）500 l AP buffer室温洗2次，每次10 min； 原位杂交流程 - 3 18）20 l NBT/BCIP于1 ml AP buffer中避光显色（室温30 min1 h，4降低显色速度）； 19）1 ml PBT洗2次终止显色反应，每次10 min； 20）1 ml 4%聚甲醛固定1 h； 21）1 ml PBT洗2次，每次10 min； 22）取适量胚胎放在80%甘油中于显微镜下观察拍照。 23）剩余胚胎于1 ml梯度乙醇（50%、75%、95%和100%） 脱水各10 min，500 l二甲苯透明2次、各5 min，中性树 脂封片，显微镜下观察拍照。 作 业 电子版上交电子版上交vasavasa mRNA mRNA在实验动物发育过程中的表达图式；在实验动物发育过程中的表达图式； 根据实验结果，提出目的基因在实