DNA重排检测方法

1、DNA重排检测方法 DNA重排检测方法 一、形态学观察一、形态学观察 二、细胞遗传学二、细胞遗传学 如：染色体核型分析、染色体显带等如：染色体核型分析、染色体显带等 三、分子细胞遗传学三、分子细胞遗传学 如：荧光原位杂交如：荧光原位杂交 四、分子生物学四、分子生物学 如：如： SouthernSouthern杂交，杂交，PCRPCR及相关技术等及相关技术等 DNA重排检测方法 一、形态学观察形态学观察 例子：例子： 上个世纪上个世纪40年代科学家年代科学家BMcClintock 观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜色观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜色 变化。变化。 这种颜色变化是由遗传结构的基这种

2、颜色变化是由遗传结构的基 本改变引起的，从而导致转座子的发现。本改变引起的，从而导致转座子的发现。 肿瘤细胞与正常细胞肿瘤细胞与正常细胞 肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍，遗肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍，遗 传结构的改变引起表型的改变。因此从传结构的改变引起表型的改变。因此从 形态学上可以鉴定肿瘤。形态学上可以鉴定肿瘤。 DNA重排检测方法 二、细胞遗传学二、细胞遗传学 染色体核型分析、染色体显带染色体核型分析、染色体显带 一个物种的染色体核型及带型是稳定的一个物种的染色体核型及带型是稳定的 染色体核型分析染色体核型分析：观察中期染色体，初步：观察中期染色体，初步 分析染色体有无较大片段的缺失

3、、断裂、分析染色体有无较大片段的缺失、断裂、 易位、及附加易位、及附加 常规核型分析常规核型分析 荧光核型分析荧光核型分析 1.1. 光谱核型分析光谱核型分析( (Spectral karyotyping, SKY) SKY) DNA重排检测方法 光谱核型分析原理光谱核型分析原理( (Spectral karyotyping, SKY)SKY) 1996 年年 Schroch等首次描述了等首次描述了SKYSKY技术。技术。 应用应用5种荧光素同时标记种荧光素同时标记24条人染色体，制成条人染色体，制成 染色体涂染探针，应用染色体涂染探针，应用Fourier光谱仪，光谱仪，CC成成 像和荧光显微

4、镜进行检测分析，经计算成像处像和荧光显微镜进行检测分析，经计算成像处 理，理，46条染色体形成具有不同颜色的核型影像条染色体形成具有不同颜色的核型影像, , 可用以分析各种染色体异常。可用以分析各种染色体异常。 优势：优势： 特异性和分辨率比传统的显带技术高，它特异性和分辨率比传统的显带技术高，它 可以检测到可以检测到 1.5mb 1.5mb 碱基的转位碱基的转位 一次杂交即可分辨人的一次杂交即可分辨人的2424条染色体条染色体 DNA重排检测方法 人染色体光谱核型分析人染色体光谱核型分析 乳腺癌细胞染色体复杂的畸变乳腺癌细胞染色体复杂的畸变 DNA重排检测方法 2.2.染色体显带技术：染色体

5、显带技术： C-banding C-banding 主要染异染色质主要染异染色质 R-banding R-banding 与与C-banding C-banding 相反，主要染常相反，主要染常 染色质区域染色质区域 G-banding G-banding 是是Giemsa Giemsa 染色结果，产生深染色结果，产生深 浅不同的条带浅不同的条带 Q-banding Q-banding 是用喹丫因（是用喹丫因（quinacrinequinacrine）染）染 色得到的荧光条带，带型与色得到的荧光条带，带型与G G带相似带相似 DNA重排检测方法 G- G-带带 c. 正常染色体正常染色体 末端

6、缺失末端缺失 d. 末端倒位末端倒位 末端单向易位末端单向易位 e. 着丝粒周倒位着丝粒周倒位 DNA重排检测方法 G G带显示人急性骨髓白血病异常染色体带显示人急性骨髓白血病异常染色体 9 9、1010、1111染色体间易位，右为异常染色体染色体间易位，右为异常染色体 DNA重排检测方法 三、分子细胞遗传学三、分子细胞遗传学 原位杂交（原位杂交（In situ hybridisation） 标记的核酸探针变性后与已变性的靶核标记的核酸探针变性后与已变性的靶核 酸在退火温度下复性，酸在退火温度下复性，在不改变被分析在不改变被分析 对象，即维持其原位的前提下对靶核酸对象，即维持其原位的前提下对靶

7、核酸 进行分析。进行分析。 2. 荧光原位杂交荧光原位杂交 Fluorescent in situ hybridisation (FISH) 核酸探针用荧光染料标记，荧光信号通核酸探针用荧光染料标记，荧光信号通 过显微镜观察过显微镜观察。 DNA重排检测方法 3. 3. 染色体涂染染色体涂染(Chromosome painting)(Chromosome painting) 又称为多重荧光原位杂交又称为多重荧光原位杂交(multiplex-(multiplex- fluorescence in situ hybridisation, M-FISH) 可同时检测多个染色体，一次杂交即可检可同时检

8、测多个染色体，一次杂交即可检 测人的测人的24条染色体条染色体 可检测简单及复杂的染色体重排可检测简单及复杂的染色体重排 DNA重排检测方法 荧光原位杂交，荧光原位杂交，据标记物不同可分为：据标记物不同可分为： 间接法：用生物素或地高辛标记探针，间接法：用生物素或地高辛标记探针， 通过与荧光染料结合的抗生物素或抗通过与荧光染料结合的抗生物素或抗 地高辛抗体将信号放大而进行检测。地高辛抗体将信号放大而进行检测。 直接法：直接用荧光素标记，如直接法：直接用荧光素标记，如VysisVysis 公司的公司的FISHFISH探针。探针。 荧光原位杂交原理示意荧光原位杂交原理示意 DNA重排检测方法 荧光

9、原位杂交过程荧光原位杂交过程 DNA重排检测方法 急性骨髓白血病急性骨髓白血病 10、11号染色体间易位号染色体间易位 10、11号染色体易发生号染色体易发生 断裂的基因断裂的基因(MLL)位点位点 小麦簇毛麦小麦簇毛麦F1 代染色体间易位代染色体间易位 染色体涂染显示人染色体组染色体涂染显示人染色体组 DNA重排检测方法 荧光标记探针荧光标记探针 不对环境构成污染不对环境构成污染 灵敏度能得到保障灵敏度能得到保障 可进行多色观察分析，可同时使用多个可进行多色观察分析，可同时使用多个 探针，缩短因单个探针分开使用导致的探针，缩短因单个探针分开使用导致的 周期过长和技术障碍。周期过长和技术障碍。

10、 DNA重排检测方法 4. 4. 比较基因组杂交比较基因组杂交 Comparative Genomic Hybridization (CGH) (CGH) 原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂 交技术而发展起来的技术，主要用于交技术而发展起来的技术，主要用于 肿瘤的检测及其基因组分析肿瘤的检测及其基因组分析 是由是由Kallioniemi等在等在1992年首先提出的，是检年首先提出的，是检 测整个肿瘤基因组测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的增加或减少的强有力的 工具工具 DNA重排检测方法 比较基因组杂交原理示意比较基因组杂交原理示意 肿瘤肿瘤D

11、NADNA和对照和对照DNADNA 在染色体上的相对结在染色体上的相对结 合量取决于两种合量取决于两种DNADNA 标本中相应杂交序列标本中相应杂交序列 的多少的多少 因此可根据不同荧因此可根据不同荧 光強度的比率而定量光強度的比率而定量 分析肿瘤基因組中分析肿瘤基因組中 DNADNA的增加或丟失的增加或丟失 等比混合等比混合 比较基因组杂交过程比较基因组杂交过程 DAPIDAPI 4 4,6-,6-二联脒二联脒-2-2- 吲哚苯吲哚苯 FITC 异硫氰酸酯异硫氰酸酯 TRITC 硫氰酸四甲基罗丹明硫氰酸四甲基罗丹明 人染色体不同荧光素染色结果人染色体不同荧光素染色结果 数字化图像数字化图像

12、FITC/TRITC FITC/TRITC 荧光强度比率分析图荧光强度比率分析图 Ratio image FITC/TRITCRatio image FITC/TRITC DNA重排检测方法 应用：应用： 主要应用在检测肿瘤细胞的遗传变化主要应用在检测肿瘤细胞的遗传变化 物种间染色体同源性比较物种间染色体同源性比较 优势：优势： 可快捷检测中期、间期基因组可快捷检测中期、间期基因组 不需预先知道不需预先知道DNA发生改变的部位发生改变的部位 一次实验即可检出待测样本整个基因一次实验即可检出待测样本整个基因 组拷贝数的增减组拷贝数的增减 DNA重排检测方法 1. Southern-blottin

13、g 应用于基因重排检测是应用于基因重排检测是19811981年年KorsmeyerKorsmeyer等等 首先进行的。首先进行的。 淋巴瘤淋巴瘤DNADNA重排重排: :将细胞将细胞DNADNA抽提出来抽提出来, ,用限制用限制 性内切酶进行酶切，胚系性内切酶进行酶切，胚系DNADNA就会产生特征就会产生特征 性片段。但发生过基因重排的细胞性片段。但发生过基因重排的细胞DNADNA的酶的酶 切位点有所改变，会产生有别于胚系的切位点有所改变，会产生有别于胚系的DNADNA 酶切片段。转膜后，与标记的酶切片段。转膜后，与标记的DNADNA探针杂交，探针杂交， 如有一定数量的克隆性增殖的淋巴细胞存如

14、有一定数量的克隆性增殖的淋巴细胞存 在在 (1(1 5%5%），克隆性的基因重排条带就），克隆性的基因重排条带就 可显示出来。对于正常或多克隆性的淋巴可显示出来。对于正常或多克隆性的淋巴 细胞增生，由于重排片段大小各异而显弥细胞增生，由于重排片段大小各异而显弥 散带。散带。 四、分子生物学技术四、分子生物学技术 DNA重排检测方法 Figure 5._Southern blot analysis of the T-cell receptor -chain gene. Three specimens are shown, each digested with EcoRI, BamHI, and

15、HindIII restriction enzymes, run in agarose gels, transferred to a nylon membrane, and hybridized with a radioactively labeled J probe. Two specimens, one (negative control) in lanes 2, 5, and 8, and the second in lanes 3, 6, and 9, reveal only germline bands and are polyclonal. The third specimen,

16、in lanes 4, 7, and 10, has evidence of gene rearrangement in all 3 lanes and is monoclonal. Lane 1 shows the markers. Lane 11 is a 5% sensitivity control DNA重排检测方法 优势：优势：SouthernSouthern分析已被应用于分析已被应用于IgHIgH、 IgkIgk、 IglIgl及各种及各种TCR(T-TCR(T-细胞受体细胞受体) )克隆性重排的检测，克隆性重排的检测， 并以其令人满意的灵敏度和可靠性被视为基因并以其令人满意的灵敏

17、度和可靠性被视为基因 重排检测的重排检测的“金标准金标准”。 局限：需要较大量（局限：需要较大量（10mg10mg）新鲜或冰冻组织，）新鲜或冰冻组织， 操作复杂，若用放射性同位素标记，时间过长操作复杂，若用放射性同位素标记，时间过长 （约两周），易污染等缺点，仅适用于科研而不（约两周），易污染等缺点，仅适用于科研而不 适用于临床诊断。适用于临床诊断。 改进：荧光素标记改进：荧光素标记IgHIgH、 IgkIgk、IglIgl及各种及各种TCRTCR探探 针化学发光试剂盒克服了上述缺点，以荧光素针化学发光试剂盒克服了上述缺点，以荧光素 取代了同位素作为标记；缩短了曝光时间取代了同位素作为标记；缩

18、短了曝光时间(5(5 1010 分钟分钟) )，并且敏感性不降低，非常有利于在临床，并且敏感性不降低，非常有利于在临床 诊断中推广、应用。诊断中推广、应用。 DNA重排检测方法 DNADNA发生重排后，其扩增产物条带与正常的有差异，发生重排后，其扩增产物条带与正常的有差异， 由此可以检测由此可以检测DNADNA重排重排 淋巴瘤诊断：淋巴瘤诊断： 淋巴瘤是细胞克隆性增生的结果，淋巴瘤是细胞克隆性增生的结果， 其特殊的基因重排形式占一定的数量优势，从而成其特殊的基因重排形式占一定的数量优势，从而成 为细胞克隆性的检测指标。选取为细胞克隆性的检测指标。选取IgHIgH与与TCRTCR（T T细胞受细

19、胞受 体）的体）的V V、D D、J J、C C区基因编码中区基因编码中20 20 个左右的保守核个左右的保守核 苷酸序列，人工合成一对或多对（家族基因）引物，苷酸序列，人工合成一对或多对（家族基因）引物， 以待测样品以待测样品DNADNA为模板，扩增目的为模板，扩增目的DNADNA序列片段。如序列片段。如 果是淋巴瘤则扩增产物电泳出现单克隆性单带。而果是淋巴瘤则扩增产物电泳出现单克隆性单带。而 良性增生性淋巴组织或正常组织则出现弥漫涂片状，良性增生性淋巴组织或正常组织则出现弥漫涂片状， 2. 2. 常规常规PCR技术技术 不形成单带。不形成单带。 转基因材料外源基因的检测转基因材料外源基因的

20、检测 1,1,标准分子量；标准分子量；2 2，质粒；，质粒；3 3，对照；，对照；4-84-8，转基因植株，转基因植株 1 2 3 4 5 6 7 8 转基因黑麦草转基因黑麦草PCRPCR检测外源检测外源UbiUbi启动子启动子 DNA重排检测方法 (1) PCR-RFLP: PCR-RFLP: 多聚酶链反应多聚酶链反应(PCR)-(PCR)-限制性片限制性片 段长度多态性段长度多态性 (restriction fragment length Polymorphism，RFLP) 原理：原理：PCRPCR产物限制性内切酶切多态性分产物限制性内切酶切多态性分 析，析，DNADNA发生重排后，酶切

21、位点发生改变。发生重排后，酶切位点发生改变。 优点：具有分辩率高，无需标记优点：具有分辩率高，无需标记, ,重复性好，重复性好， 简便快速直观等。主要用于核酸变异性分析简便快速直观等。主要用于核酸变异性分析 与比较与比较, , 微生物的分群分型分亚型，癌基因微生物的分群分型分亚型，癌基因 分析，遗传病的诊断等。分析，遗传病的诊断等。 局限：只能应用突变引起限制性酶切位点改变局限：只能应用突变引起限制性酶切位点改变 的情况下，一次只能完成一个特定位点突变的情况下，一次只能完成一个特定位点突变 筛选，检测效率低。筛选，检测效率低。 3. 3. PCR相关技术相关技术 PCR-RFLP原理示意原理示

22、意 DNA重排检测方法 原理：是将经扩增的原理：是将经扩增的DNADNA片段经过变性处理，形成单片段经过变性处理，形成单 链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚 丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物 的对比，即可检测出有无变异。的对比，即可检测出有无变异。 刚建立时是将同位素掺入刚建立时是将同位素掺入PCRPCR扩增的产物中，通过放扩增的产物中，通过放 射自显影显示结果。后用银染取代同位素显示射自显影显示结果。后用银染取代同位素显示DNADNA带带 型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏等特

23、型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏等特 点。点。19931993年起用年起用EBEB染色法显示染色法显示DNADNA带型，使得带型，使得SSCPSSCP操操 作更简单，更经济，更迅速。作更简单，更经济，更迅速。 （2 2）PCR-SSCP：聚合酶链反应：聚合酶链反应一一单链构象多态性单链构象多态性 ( (single strand conformation polymorphism) ) DNA重排检测方法 聚合酶链反应聚合酶链反应一一单链构象多态性单链构象多态性 （ PCR-SSCP）示意）示意 DNA重排检测方法 优点：检测基因变异，具有操作简便、快速、优点：检测基因变异，具有操作简

24、便、快速、 不需特殊设备，适用于大样本筛选。己广泛不需特殊设备，适用于大样本筛选。己广泛 应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失 突变，基因的多态性分析等。突变，基因的多态性分析等。 DNA重排检测方法 （3 3）PCR-southern blot及及Dot blot技术：技术： PCR-southern blot 原理：是将原理：是将PCRPCR扩增产物转移到硝酸纤维膜或尼扩增产物转移到硝酸纤维膜或尼 龙膜上，再与标记的特异性探针进行杂交，来龙膜上，再与标记的特异性探针进行杂交，来 检测有无特定的扩增片段及相对含量。检测有无特定的扩增片段及相对含量。 优

25、点：可以直接检测基因的点突变，缺失及重优点：可以直接检测基因的点突变，缺失及重 排，比排，比PCRPCR产物产物EBEB染色电泳分离法的灵敏度至少染色电泳分离法的灵敏度至少 要高要高103103以上，由于非放射性同位素标记的探针以上，由于非放射性同位素标记的探针 的应用，使得的应用，使得PCR-southern blot应用更简便，应用更简便， 现己广泛应用于癌基因、遗传特异基因、病现己广泛应用于癌基因、遗传特异基因、病 原原 体特异基因等方面的研究及检测。体特异基因等方面的研究及检测。 DNA重排检测方法 PCR-Dot blot即是将即是将PCRPCR扩增产物变性后直接点扩增产物变性后直接

26、点 在膜上，与标记的特异性探针进行杂交。在膜上，与标记的特异性探针进行杂交。 优点：时间短，可半定量分析，一张膜上可优点：时间短，可半定量分析，一张膜上可 同时检测多个样品。同时检测多个样品。 局限：只能看到一个斑点，必须小心控制反局限：只能看到一个斑点，必须小心控制反 应条件，设立阳性及阴性对照，以便对检测应条件，设立阳性及阴性对照，以便对检测 标本做出正确鉴定标本做出正确鉴定. . DNA重排检测方法 原理：在扩增反应中加入不等量的两段寡核原理：在扩增反应中加入不等量的两段寡核 苷酸引物，引物量相差苷酸引物，引物量相差100100倍，通过倍，通过PCRPCR扩增扩增 获得单链获得单链DNA

27、DNA，然后利用双脱氧法直接测序。，然后利用双脱氧法直接测序。 应用：扩增产物的测序，可以很容易确定群应用：扩增产物的测序，可以很容易确定群 体中某一特定基因的序列变异情况，这种方体中某一特定基因的序列变异情况，这种方 法是了解目的基因突变的较理想的方法。法是了解目的基因突变的较理想的方法。 （4 4）不对称）不对称PCRPCR（asymmetricPCR） 直接测序法直接测序法 DNA重排检测方法 原理：即聚合酶原位扩增技术。将原理：即聚合酶原位扩增技术。将PCRPCR技术技术 与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织 的原有位置，直接在组织、细胞或病原体

28、原的原有位置，直接在组织、细胞或病原体原 位研究基因变化的技术。位研究基因变化的技术。 (5) (5) 原位原位PCRPCR技术技术 固定组织固定组织蛋白酶蛋白酶K消化消化 PCR扩增扩增 显微镜观察显微镜观察 dNTP-荧光素荧光素 或或dNTP-地高辛地高辛 -生物素生物素 或荧光染料抗地高辛抗体或荧光染料抗地高辛抗体 抗生物素抗体抗生物素抗体 DNA重排检测方法 优点：提高了杂交的灵敏度，又能直接显微优点：提高了杂交的灵敏度，又能直接显微 观察病变部位，且标本不需特殊处理或制备，观察病变部位，且标本不需特殊处理或制备， 比较省时和经济，尤其对形态学研究具有其比较省时和经济，尤其对形态学研

29、究具有其 它方法难以比拟的独到长处。它方法难以比拟的独到长处。 应用：原位应用：原位PCRPCR自创立以来，已经在神经性自创立以来，已经在神经性 疾病、肿瘤、微生物病原体等多种检测中得疾病、肿瘤、微生物病原体等多种检测中得 到广泛应用。到广泛应用。 DNA重排检测方法 （6）RT-PCR( reverse transcriptase-PCR) 原理：原理：mRNAmRNA反转录后进行反转录后进行PCRPCR扩增。实际上扩增。实际上 是检测基因表达产物的方法。是检测基因表达产物的方法。 优点：灵敏度高，可在优点：灵敏度高，可在10106 6个正常细胞中检个正常细胞中检 测出测出1 1个白血病细胞

30、。个白血病细胞。 DNA重排检测方法 4. 4. 基因芯片技术检测基因突变基因芯片技术检测基因突变 基因芯片（基因芯片（gene chips)gene chips) DNADNA芯片芯片 (DNA chips)(DNA chips) DNADNA微阵列（微阵列（DNA microarray)DNA microarray) 将数以万计的将数以万计的DNADNA探针按照一定的顺序排列固化探针按照一定的顺序排列固化 于支持物表面上，产生二维于支持物表面上，产生二维DNADNA高密度的分子探高密度的分子探 针阵列，然后与标记的样品进行杂交，再利用计针阵列，然后与标记的样品进行杂交，再利用计 算机控制的信号产生、识别及图象处理系统进行算机控制的信号产生、识别及图象处理系统进行 结果分析来实现对生物样品快速、并行、高效地结果分析来实现对生物样品快速、并行、高效地 检测。检测。 基因芯片技术是分子生物学、信息科学、材料基因芯片技术是分子生物学、信息科学、材料 科学、微加工技术、光学检测技术、计算机技术科学、微加工技术、光学检测技