模拟酶人工酶

1、 模拟酶的概念模拟酶的概念 吸收酶中那些起主导作用的因素，利用有机化学、吸收酶中那些起主导作用的因素，利用有机化学、 生物化学等方法设计和合成一些较天然酶简单的生物化学等方法设计和合成一些较天然酶简单的 非蛋白质或蛋白质分子，以这些分子作为模型来非蛋白质或蛋白质分子，以这些分子作为模型来 模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。 由此可见，模拟酶是在分子水平上模拟酶活性部由此可见，模拟酶是在分子水平上模拟酶活性部 位的形状、大小及微环境等结构特征，以及酶的位的形状、大小及微环境等结构特征，以及酶的 作用机理和立体化学等特异性的一门科学。作用机理和立体化学等特异性

2、的一门科学。 一方面基于酶的作用机制，另一方面基于对简化一方面基于酶的作用机制，另一方面基于对简化 的人工体系中识别、结合和催化。的人工体系中识别、结合和催化。 较为理想的小分子仿酶体系有环糊精、冠较为理想的小分子仿酶体系有环糊精、冠 醚、环番、环芳烃、卟啉等大环化合物；醚、环番、环芳烃、卟啉等大环化合物； 大分子仿酶体系有聚合物酶模型，分子印大分子仿酶体系有聚合物酶模型，分子印 迹酶模型、胶束酶模型。迹酶模型、胶束酶模型。 化学修饰、基因工程改造天然酶产生的半化学修饰、基因工程改造天然酶产生的半 合成人工酶。合成人工酶。 抗体酶抗体酶 理论基础理论基础 主客体化学：主客体化学：主体和客体通过

3、配位键或其他次级主体和客体通过配位键或其他次级 键形成稳定复合物的化学领域。本质上，来源于键形成稳定复合物的化学领域。本质上，来源于 酶和底物的相互作用，主体和客体在结合部位的酶和底物的相互作用，主体和客体在结合部位的 空间及电子排列的互补。空间及电子排列的互补。 超分子化学：超分子化学：超分子起源于底物和受体的结合，超分子起源于底物和受体的结合， 基于非共价健的相互作用，如静电作用、氢键、基于非共价健的相互作用，如静电作用、氢键、 范德华力等。当接受体和络合离子或分子结合成范德华力等。当接受体和络合离子或分子结合成 稳定的、具有稳定结构和性质的实体，即稳定的、具有稳定结构和性质的实体，即“超

4、分超分 子子”，它兼具分子识别、催化和选择性输出的功，它兼具分子识别、催化和选择性输出的功 能。能。 主客体化学、超分子化学是酶人工模拟的重要理主客体化学、超分子化学是酶人工模拟的重要理 论基础。根据酶催化反应机理，若能合成出能识论基础。根据酶催化反应机理，若能合成出能识 别底物又具有酶活性部位催化基团的主体分子，别底物又具有酶活性部位催化基团的主体分子， 就能有效地模拟酶的催化过程。就能有效地模拟酶的催化过程。 设计模拟酶前，酶的结构和酶学性质的设计模拟酶前，酶的结构和酶学性质的 深入了解：深入了解： （1 1）酶活性中心酶活性中心- -底物复合物的结构、底物复合物的结构、 （2 2）酶的专

5、一性及其桶底物结合的方）酶的专一性及其桶底物结合的方 式和能力、式和能力、 （3 3）反应的动力学及各中间物的知识。）反应的动力学及各中间物的知识。 设计人工酶模型应该考虑的因素：设计人工酶模型应该考虑的因素： （1 1）非共价键相互作用是生物酶柔韧性）非共价键相互作用是生物酶柔韧性 可变性和专一性的基础，故酶模型要为底可变性和专一性的基础，故酶模型要为底 物提供良好的微环境；物提供良好的微环境； （2 2）催化基团必须相对于结合点尽可能）催化基团必须相对于结合点尽可能 同底物的功能团相接近，以促进反应定向同底物的功能团相接近，以促进反应定向 发生；发生； （3 3）模型应该具有足够的水溶性，

6、并在）模型应该具有足够的水溶性，并在 接近生理条件下保持其催化活性。接近生理条件下保持其催化活性。 模拟酶可分为：根据模拟酶可分为：根据KirbyKirby分类法分类法 （1 1）单纯酶模型：即以化学方法通过天然）单纯酶模型：即以化学方法通过天然 酶的活性模拟来重建和改造酶的活性。酶的活性模拟来重建和改造酶的活性。 （2 2）机理酶模型：即通过对酶作用机制诸）机理酶模型：即通过对酶作用机制诸 如识别，结合和过渡态稳定化的认识来指如识别，结合和过渡态稳定化的认识来指 导酶模型的设计和合成。导酶模型的设计和合成。 （3 3）单纯合成的酶样化合物：化学合成的单纯合成的酶样化合物：化学合成的 具有酶样

7、催化活性的简单分子具有酶样催化活性的简单分子 按照模拟酶的属性，可分为：按照模拟酶的属性，可分为： 主客体酶模型主客体酶模型 胶束酶模型胶束酶模型 肽酶肽酶 抗体酶抗体酶 分子印迹分子印迹 半合成酶。半合成酶。 一一. .主、客体酶的模型主、客体酶的模型 天然宿主：天然宿主：CDCD 合成主体：冠醚、穴醚、杂环大分子化合合成主体：冠醚、穴醚、杂环大分子化合 物、卟啉类物、卟啉类 主、客体酶的模型 （一）环糊精酶模型（一）环糊精酶模型 环糊精是环状低聚糖环糊精是环状低聚糖 的总称。其中研究得的总称。其中研究得 最多的是最多的是环糊精。环糊精。 环糊精是由环糊精是由6 6个葡萄个葡萄 糖分子按照糖

8、分子按照1 14 4连接连接 方式形成的一种环状方式形成的一种环状 结构天然淀粉，并具结构天然淀粉，并具 有园柱型立体结构特有园柱型立体结构特 点。点。 外侧亲水，外侧亲水，OHOH可与多种客体形成氢键。可与多种客体形成氢键。 内侧内侧C3C5C3C5的的H H和糖苷和糖苷O O组成的空腔，疏水性，能包组成的空腔，疏水性，能包 结多种客体分子，类似酶对底物的识别。结多种客体分子，类似酶对底物的识别。 介绍几种水解酶模介绍几种水解酶模 型型 1.1.水解酶模型水解酶模型 - -胰蛋白酶是一种胰蛋白酶是一种 蛋白水解酶，具有蛋白水解酶，具有 疏水性的环状结合疏水性的环状结合 部位，能有效的结部位，

9、能有效的结 合芳环。合芳环。 催化部位有催化部位有5757号号组组 氨酸咪唑基氨酸咪唑基，102102号号 天冬氨酸羧基天冬氨酸羧基及及195195 号号丝氨酸羟基丝氨酸羟基。 A:A:-Benzyme,-Benzyme,水解叔丁基苯基乙酸酯（水解叔丁基苯基乙酸酯（p-NPAcp-NPAc）比天然）比天然 酶快酶快1 1倍。倍。 B B：咪唑直接与：咪唑直接与CDCD连接，比天然酶催化速度快连接，比天然酶催化速度快1 1个数量级。个数量级。 C C：增加：增加CDCD对底物过渡态的结合能力：修饰底物增加，底对底物过渡态的结合能力：修饰底物增加，底 物与物与CDCD的结合，如用二茂铁、金刚烷为结

10、合位点的硝基苯的结合，如用二茂铁、金刚烷为结合位点的硝基苯 酯酯,CD,CD作为催化剂加速水解大作为催化剂加速水解大10105 5-10-106 6倍。倍。 2.2.核糖核酸酶模型核糖核酸酶模型 核糖核酸酶具有核糖核酸酶具有2 2个组氨酸咪唑基及个组氨酸咪唑基及1 1个质个质 子化赖氨酸基处于活性中心。子化赖氨酸基处于活性中心。 在它的催化下在它的催化下RNARNA的磷酸酯水解分为两步进的磷酸酯水解分为两步进 行，两个咪唑基交替起到一般酸或碱的催行，两个咪唑基交替起到一般酸或碱的催 化作用，使离去基团质子化或增加亲核基化作用，使离去基团质子化或增加亲核基 团的亲核性。团的亲核性。 Breslo

11、wBreslow等人设计了等人设计了2 2种种核糖核酸酶模型核糖核酸酶模型：A A、B B，A A 催化只生成催化只生成IIIIII，B B催化只生成催化只生成IIII。 CDCD底物复合物的几何形状和催化基团所处的位置底物复合物的几何形状和催化基团所处的位置 对选择性起了决定性作用。最佳对选择性起了决定性作用。最佳pH6pH6：一个咪唑基：一个咪唑基 以碱的形式，另一个咪唑基以质子化形式参加反以碱的形式，另一个咪唑基以质子化形式参加反 应，与天然酶相似。应，与天然酶相似。 磷酸吡哆醛（胺）是转氨酶的辅酶，最重要的反应是酮酸磷酸吡哆醛（胺）是转氨酶的辅酶，最重要的反应是酮酸 与氨基酸的转换，转

12、氨反应机理与氨基酸的转换，转氨反应机理. . 没有酶存在时，磷酸吡哆醛（胺）也能实现转氨作用，但没有酶存在时，磷酸吡哆醛（胺）也能实现转氨作用，但 反应极慢，其无任何选择性。原因在于辅酶本身无结合部反应极慢，其无任何选择性。原因在于辅酶本身无结合部 位，不能形成酶位，不能形成酶- -底物络合物，后者是酶反应必不可少的底物络合物，后者是酶反应必不可少的 环节。环节。 第一个模拟转氨酶模型第一个模拟转氨酶模型19801980年年 被报道，磷酸吡哆胺连在被报道，磷酸吡哆胺连在-CD-CD 上，模拟酶的转氨反应比磷酸上，模拟酶的转氨反应比磷酸 吡哆胺单独存在是快吡哆胺单独存在是快200200倍，倍，C

13、DCD 空腔能稳定结合类似亚胺中间空腔能稳定结合类似亚胺中间 体的过渡态。体的过渡态。 最大特点：良好的立体选择性，最大特点：良好的立体选择性， -CD-CD的手征性，产物氨基酸也的手征性，产物氨基酸也 具有光学活性。具有光学活性。 HanHan等人合成了含核糖的等人合成了含核糖的CDCD酶模型，兼具核酶模型，兼具核 酸酶、连接酶、磷酸酯酶和磷酸化酶的活酸酶、连接酶、磷酸酯酶和磷酸化酶的活 力。力。 核糖中相邻的二个羟基是关键，水解环状核糖中相邻的二个羟基是关键，水解环状 磷酸酯的速率提高磷酸酯的速率提高3333倍。倍。 CDCD分子分子 CDCD和底物的结合常数和底物的结合常数10104 4

14、L/mol,L/mol,酶，酶， 过去的工作：过去的工作：CDCD的修饰，在的修饰，在CDCD的两面引入催化的两面引入催化 基团，通过柔性或刚性加冕引入疏水基团，改基团，通过柔性或刚性加冕引入疏水基团，改 善善CDCD的疏水结合和催化功能，通常只有单包结的疏水结合和催化功能，通常只有单包结 部位和双重识别作用。部位和双重识别作用。 现在，桥联环糊精和聚合环糊精，可得到双重现在，桥联环糊精和聚合环糊精，可得到双重 或多重疏水结合作用和多重识别作用，结合常或多重疏水结合作用和多重识别作用，结合常 数数10108 8L/mol,L/mol, 将乙二胺与将乙二胺与CDCD偶联，然后与偶联，然后与CuC

15、u盐作用形成桥连环盐作用形成桥连环 糊精。糊精。 含镍的水杨酚含镍的水杨酚CDCD复合物复合物A A、B B，对一些特殊结构的，对一些特殊结构的 三肽化合物有显著的选择结合能力三肽化合物有显著的选择结合能力, ,用于肽库中筛用于肽库中筛 选特异性小肽。选特异性小肽。 胡萝卜素氧化酶的模拟： 含卟啉的桥连CD，金属卟 啉能催化双键，可以选择 性氧化C15=C15键。 合成的复合物对底物胡萝 卜素的结合远大于产物视 黄醛。 四桥连的四桥连的CDCD模拟模拟P-P- 450450酶（抗氧化酶，酶（抗氧化酶， 细胞色素），细胞色素），P-450P-450 活性中心的金属卟啉活性中心的金属卟啉 分子与分

16、子与4 4个个CDCD相连，相连， 既有底物结合部位既有底物结合部位 又有催化基团的小分又有催化基团的小分 子。子。 合成的冠醚、穴醚、环芳烃作为主体构筑 酶模型。 日本学者合成了带巯基的仿酶模型，可在 分子内实行“准双分子反应”以合成多肽， 此模型具有结合两个氨基酸的能力。 含冠醚环和含冠醚环和SHSH基的主体分基的主体分 子子A A、B B、C C， 分子中的冠醚环为结合部分子中的冠醚环为结合部 位，位， 含醚侧臂或亚甲基为主体含醚侧臂或亚甲基为主体 识别部位，侧臂末端为催识别部位，侧臂末端为催 化部位。化部位。 胶束在水溶液中提供了疏水微环境（类似酶的结胶束在水溶液中提供了疏水微环境（类

17、似酶的结 合部位），可以对底物束缚。合部位），可以对底物束缚。 如果将催化基团如咪唑、硫醇、羟基、一些辅酶如果将催化基团如咪唑、硫醇、羟基、一些辅酶 共价或非共价连接或吸附在胶束上，就有可能提共价或非共价连接或吸附在胶束上，就有可能提 供活性中心部位，合成有酶活力或部分酶活力的供活性中心部位，合成有酶活力或部分酶活力的 胶束酶模型。胶束酶模型。 1.1.模拟水解酶的胶束酶模型模拟水解酶的胶束酶模型 2.2.辅酶的胶束酶模型辅酶的胶束酶模型 3.3.金属胶束酶模型金属胶束酶模型 表面活性剂分子上连接组氨酸残基或咪唑基团，表面活性剂分子上连接组氨酸残基或咪唑基团， 就有可能形成模拟水解酶的胶束。就

18、有可能形成模拟水解酶的胶束。 如：如：N-N-十四酰基组氨酸所形成的胶束催化十四酰基组氨酸所形成的胶束催化PNPAPNPA （对硝基苯酚乙酸酯）的水解，催化效率比（对硝基苯酚乙酸酯）的水解，催化效率比N-N-乙乙 酰基组氨酸酰基组氨酸( (无胶束无胶束) )高高33003300倍。倍。 如果该胶束中加入带羟基的表面活性剂如果该胶束中加入带羟基的表面活性剂N N，N-N-二甲二甲 基基-N-N-（2-2-羟乙基）十八烷基氨溴化物，共同催化羟乙基）十八烷基氨溴化物，共同催化 PNPAPNPA的水解，先生成酰基咪唑基中间体，然后酰的水解，先生成酰基咪唑基中间体，然后酰 基转移到羟基上（电荷中继系统）

19、，与基转移到羟基上（电荷中继系统），与- -胰凝乳胰凝乳 蛋白酶水解很相似。蛋白酶水解很相似。 将疏水性VB6长链衍生物与阳离子胶束混合 形成泡囊体系中，在Cu2+存在下可将酮酸 转化为氨基酸，有效模拟了VB6为辅酶的转 氨基作用，氨基酸的收率达52%. 阳离子胶束不但能活化催化基团，也能活 化辅酶的功能团。 带疏水键的金属配合物单独或与其他表面活性剂 共同形成的胶束体系。 模拟金属酶的活性中心结构和疏水性的微环境。 金属离子-催化水解反应，疏水性微环境-底物包 结。 模拟羧肽酶A、碱性磷酸酯酶、氧化酶、转氨酶。 如：羧肽酶A的模拟,水解PNPP（-吡啶甲酸对 硝基苯酚酯）,Cu 2+、Zn2

20、+与相应的表面活性剂 形成1：1的配合物时，水解反应速度最大。 三三. . 肽酶肽酶 肽酶肽酶(pepzyme)(pepzyme)就是模拟天然酶活性部位而人工就是模拟天然酶活性部位而人工 合成的具有催化活性的多肽。合成的具有催化活性的多肽。 四四. .半合成酶半合成酶 半合成酶是以天然蛋白质或酶为母体，用化学或半合成酶是以天然蛋白质或酶为母体，用化学或 生物的方法引进适当的活性部位或催化基团，或生物的方法引进适当的活性部位或催化基团，或 改变其结构从而形成一种新的改变其结构从而形成一种新的“人工酶人工酶”。 类型类型1 1：选择性修饰：选择性修饰AAAA侧链将一种侧链将一种AAAA侧链化学转侧

21、链化学转 化为新的化为新的AAAA侧链（化学诱变法）侧链（化学诱变法） 类型类型2 2：将辅酶引入母体结构制备半合成酶，如：将辅酶引入母体结构制备半合成酶，如 黄素木瓜蛋白酶，其他辅酶如黄素木瓜蛋白酶，其他辅酶如VB1VB1、吡哆醛、卟、吡哆醛、卟 啉都可以共价偶联到某些酶的结合部位，产生新啉都可以共价偶联到某些酶的结合部位，产生新 的实用催化剂。的实用催化剂。 （Abzyme) 催化抗体又称抗体酶：是抗体的高度选择催化抗体又称抗体酶：是抗体的高度选择 性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物， 本质上，是一类具有催化活性的免疫球蛋本质上，是一类具有催化活性的免疫

22、球蛋 白，在其可变的区域赋予了酶的属性。白，在其可变的区域赋予了酶的属性。 抗体 由抗原诱导产生的，在结构上与抗原高度 互补并与抗原具有特异结合功能的免疫球 蛋白。 抗体的最显著的特征是 多样性和专一性 酶是生物催化剂 酶是一类具有催化功能的生物分子酶是一类具有催化功能的生物分子 酶反应有两个主要的特征：酶反应有两个主要的特征： 高催化效率、高选择性高催化效率、高选择性 19461946年，年，PaulingPauling用用过渡态理论过渡态理论阐明酶催化阐明酶催化 的实质的实质 酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合 并稳定化学反应的过渡态并稳定化学

23、反应的过渡态( (底物激态底物激态) )，从而降，从而降 低反应能级。低反应能级。 对任何化学反应，反应物在对任何化学反应，反应物在 变为产物之前，必须获得一变为产物之前，必须获得一 定的能量，成为活化态或称定的能量，成为活化态或称 过渡态过渡态。过渡态处于最高能。过渡态处于最高能 阶上。阶上。 过渡态与反应物的能阶之差过渡态与反应物的能阶之差 称为称为活化能活化能。 获得活化能的多少与反应的获得活化能的多少与反应的 速度成正比。速度成正比。 S 过渡态理论是解释酶催化原理的经典理论。过渡态理论是解释酶催化原理的经典理论。 过渡态理论 S过渡态理论认为，酶与底物的结合经历了一个过渡态理论认为，

24、酶与底物的结合经历了一个 易于形成产物的过渡态，实际上是降低了反应易于形成产物的过渡态，实际上是降低了反应 所需的活化能。所需的活化能。 过渡态理论 与反应过渡状态结合作用与反应过渡状态结合作用 在酶催化的反应中，与酶的活性中心形成 复合物-实际上是底物形成的过渡状态， 酶与过渡状态的亲和力要大于酶与底物或 产物的亲和力。 抗体与酶 抗体具有极高的亲和力，与酶相似。 抗体与酶的本质差别：酶是能与反应过渡 态选择结合的催化性物质，结合过渡态降 低能障，而抗体是和基态紧密结合的物质 。 以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互 补构象的抗体，使其具有催化活性（抗体 酶）。 19691969年年Jenc

25、ksJencks根据抗体结合抗原的高度特异性，根据抗体结合抗原的高度特异性， 与天然酶结合底物的高度专一性相类似的特性，与天然酶结合底物的高度专一性相类似的特性， 在过渡态理论的基础上首先提出设想：在过渡态理论的基础上首先提出设想： 能与化学反应中过渡态结合的抗体，可能能与化学反应中过渡态结合的抗体，可能 具有酶的活性，催化反应的进行。具有酶的活性，催化反应的进行。 19861986年年LernerLerner和和SchultzSchultz证实了这一设想。证实了这一设想。 抗体酶设想 抗体酶的发现 LernerLerner和和SchultzSchultz分别领导各自的研究小组分别领导各自的研

26、究小组 首次观察到了抗体具有选择性的催化活性。首次观察到了抗体具有选择性的催化活性。 19861986年美国年美国LernerLerner和和SchultzSchultz两个实验室同两个实验室同 时在时在ScienceScience上发表论文，报道他们成功地上发表论文，报道他们成功地 得到了具有催化活性的抗体。得到了具有催化活性的抗体。 并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为催化催化 抗体抗体，即，即抗体酶抗体酶。 1986年Schultz以对硝基苯酚磷酸胆碱酯（ PNPPC）作为相应的羧酸二酯的过渡态类似 物。 诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快 12000倍。

27、 抗体酶 抗体酶（Abzyme）或催化抗体（Catalytic antibody) 一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋 予了酶的属性。 它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉 研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效 催化能力巧妙结合的产物。 过渡态理论与抗体酶 如果使抗原最大限度地接近某一特定反应 的过渡态，就可能使诱导的抗体在与之结 合时发挥催化作用。 实际所采用的过渡态抗原只是推测而设计 的过渡态类似物。 用过渡态类似物诱导的抗体所催化的反应 并非该类似物本身，而是与其相似的另一 种反应。 抗体酶具有典型的酶反应特性 结合了酶与抗体的优点，既可以起酶促催化作用，又结合了酶与抗体的

28、优点，既可以起酶促催化作用，又 可以起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用。可以起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用。与配与配 体体( (底物底物) )结合的专一性，包括立体专一性，抗体酶催结合的专一性，包括立体专一性，抗体酶催 化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性；化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性； 具有高效催化性，具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速度比非催化一般抗体酶催化反应速度比非催化 反应快反应快10102 210106 6倍，有的反应速度已接近于天然酶促倍，有的反应速度已接近于天然酶促 反应速度；仍比天然酶慢反应速度；仍比天然酶慢 抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方

29、程动力学及抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pHpH依依 赖性等。赖性等。 在理论上研究酶的作用机理，也为过渡态理论提供依在理论上研究酶的作用机理，也为过渡态理论提供依 据。据。 抗体酶的特性 有更强的专一性和稳定性有更强的专一性和稳定性 抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的 或合成的分子或合成的分子 抗体酶催化反应的介质效应抗体酶催化反应的介质效应 酯解反应中介质效应酯解反应中介质效应 ： 抗体酶在有机溶剂中具抗体酶在有机溶剂中具 稳定性。稳定性。 脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧反应速脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧反应速 率增加。率

30、增加。 酰基转移反应中介质效应酰基转移反应中介质效应 ：在疏水溶剂中，活性：在疏水溶剂中，活性 较高。较高。 抗体酶的催化反应类型 天然酶所催化的天然酶所催化的6 6种酶促反应和数种酶促反应和数1010种类型的常规种类型的常规 反应反应的抗体酶，如酯、羧酸和酰胺键的水解、酰的抗体酶，如酯、羧酸和酰胺键的水解、酰 胺的形成、光诱导裂解和聚合、酯交换、内酯化胺的形成、光诱导裂解和聚合、酯交换、内酯化 、克莱森重排、金属螯合、环氧化、氧化还原、克莱森重排、金属螯合、环氧化、氧化还原、 化学上不利的环化、肽键形成、脱羧、过氧化、化学上不利的环化、肽键形成、脱羧、过氧化、 周环反应。周环反应。 能催化一

31、些天然酶不能催化的反应能催化一些天然酶不能催化的反应 有许多化学反应还没有已知酶催化进行有许多化学反应还没有已知酶催化进行 抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多样抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多样 性性 抗体酶可以根据需要人工裁制抗体酶可以根据需要人工裁制 抗体酶的制备 将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入 法、化学修饰法等途径。法、化学修饰法等途径。 诱导法诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原制是利用反应过渡态类似物为半抗原制 作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗 即抗体酶。即抗体酶。 拷贝法拷贝法主

32、要根据抗体生成过程中抗原主要根据抗体生成过程中抗原- -抗体互抗体互 补性来设计的。补性来设计的。 引入法引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化则借助基因工程和蛋白质工程将催化 基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使 其获得催化功能。其获得催化功能。 化学修饰法化学修饰法对抗体进行化学修饰，使抗体与对抗体进行化学修饰，使抗体与 催化基团相连。催化基团相连。 诱导法 设计半抗原设计半抗原 选择合适的反应过渡态类似物作为化学模型物选择合适的反应过渡态类似物作为化学模型物 用设计好的半抗原，与载体蛋白（如牛血清白蛋白）用设计好的半抗原，与载体蛋白（如牛血清白蛋白

33、） 偶联制成抗原；将此抗原进行免疫，使宿主针对抗原偶联制成抗原；将此抗原进行免疫，使宿主针对抗原 产生抗体。产生抗体。 用标准的单克隆技术制备、分离、筛选抗体酶：用标准的单克隆技术制备、分离、筛选抗体酶：产生产生 抗体的脾脏细胞与骨髓瘤细胞相融合，得到的杂交瘤抗体的脾脏细胞与骨髓瘤细胞相融合，得到的杂交瘤 细胞既能产生抗体又能在体外培养；细胞既能产生抗体又能在体外培养； 将杂交瘤细胞克隆化，即能产生单一均匀的抗体将杂交瘤细胞克隆化，即能产生单一均匀的抗体 。 拷贝法拷贝法 用已知酶为抗原免疫动物用已知酶为抗原免疫动物，获得抗酶的抗体，获得抗酶的抗体， 再将这种抗体免疫动物进行单克隆化获得单克再

34、将这种抗体免疫动物进行单克隆化获得单克 隆的抗体，筛选后获得具有原酶活性的抗体酶隆的抗体，筛选后获得具有原酶活性的抗体酶 。 引入法 （1）借助基因工程和蛋白质工程将催化基团（）借助基因工程和蛋白质工程将催化基团（ 特定的氨基酸残基）引入到已有底物结合能力的特定的氨基酸残基）引入到已有底物结合能力的 抗体的抗原部位结合位点上，获得抗体酶。抗体的抗原部位结合位点上，获得抗体酶。 （2）对于已产生的单抗，分析抗体结合部位的）对于已产生的单抗，分析抗体结合部位的 氨基酸顺序或对应的碱基顺序。然后通过对抗体氨基酸顺序或对应的碱基顺序。然后通过对抗体 酶结合部位氨基酸对应的基因序列进行定点突变酶结合部位

35、氨基酸对应的基因序列进行定点突变 ，希望能在抗体结合部位换上有催化作用的氨基，希望能在抗体结合部位换上有催化作用的氨基 酸。进而改变抗体酶的催化效率。酸。进而改变抗体酶的催化效率。 抗体酶和酶一样也可以用化学修饰法加以改造。抗体酶和酶一样也可以用化学修饰法加以改造。 对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和 的方法在抗体结合位置或附近的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功引入具有催化功 能的基因。能的基因。 游离巯基就是适合的基团之一，它具有高亲游离巯基就是适合的基团之一，它具有高亲 核性，易于氧化，能通过二硫化物进行交换核性，易于氧化，能通过二硫化物

36、进行交换 反应或亲电反应而选择性修饰的特点。反应或亲电反应而选择性修饰的特点。 化学修饰法 稳定过渡态法制备抗体酶 酶催化机理：稳定过渡态（酶催化机理：稳定过渡态（transition transition state stabilizationstate stabilization）、酸碱催化、亲电）、酸碱催化、亲电 和亲和催化、邻近效应（和亲和催化、邻近效应（strain and strain and proximity effectproximity effect） 通过理论设计合适的与反应过渡态类似的通过理论设计合适的与反应过渡态类似的 小分子为半抗原，然后让动物免疫系统产小分子为半抗

37、原，然后让动物免疫系统产 生针对半抗原的抗体，这种抗体在几何形生针对半抗原的抗体，这种抗体在几何形 状和电学性质上与反应过渡态互补，形成状和电学性质上与反应过渡态互补，形成 稳定过渡态，加速反应。稳定过渡态，加速反应。 如：如：NapperNapper用环化的磷酸酯作为过渡态类用环化的磷酸酯作为过渡态类 似物，动物免疫获得单克隆抗体似物，动物免疫获得单克隆抗体24B1124B11，该，该 抗体酶可催化外消旋的羟基羧酸酯分子内抗体酶可催化外消旋的羟基羧酸酯分子内 环化形成内酯，加速反应环化形成内酯，加速反应167167倍，同时表现倍，同时表现 出很高的对映体和立体选择性。用于手性出很高的对映体和

38、立体选择性。用于手性 拆分的应用拆分的应用 抗体与半抗原互补法抗体与半抗原互补法 抗体与其配体的相互作用是相当精确的，抗体常抗体与其配体的相互作用是相当精确的，抗体常 含有与配体功能互补的特殊功能基。含有与配体功能互补的特殊功能基。 已经发现带正电的配体能诱导出结合部位带负电已经发现带正电的配体能诱导出结合部位带负电 残基的配体，反之亦然。残基的配体，反之亦然。 ShokatShokat利用抗体与半抗原利用抗体与半抗原 之间的电荷互补性，制备之间的电荷互补性，制备 了针对带正电半抗原的抗了针对带正电半抗原的抗 体，结果在抗体结合部位体，结果在抗体结合部位 产生带负电的羧基，可作产生带负电的羧基

39、，可作 为一般碱基催化为一般碱基催化- -消除反消除反 应。应。 在抗原结合部位诱导出在抗原结合部位诱导出2 2个个 催化基团（催化基团（2 2个酸个酸/ /碱）。碱）。 抗体酶的应用前景 1、 抗体酶在帮助戒毒方面的应用 Landry等用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸 单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡 因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的 丁酰胆碱酯酶差不多，水解后的可卡因片断失 去可卡因刺激功能。 因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可 卡因上瘾，达到戒毒目的 。 抗体酶用于肿瘤治疗 目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗 （ADEPT）技术，即将能水解前药释放出肿 瘤细胞毒剂

40、的酶和肿瘤专一性抗体相偶联 ，这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存 在于细胞的表面。 前药 ( prodrug)是指由具有生物活性的药物 经化学修饰后转变为体外无活性的化合物。这 种化合物在体内经酶或非酶作用，脱去保护基 ，释放出母体药物而发挥治疗作用。 静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表 面或附近，抗体酶就会将前药迅速水解释 放出抗肿瘤药物，从而提高肿瘤细胞局部 药物浓度，增强对肿瘤的杀伤力，达到提 高肿瘤化疗效果的目的。 当然前药只能被抗体酶水解而不能被内源 性酶水解，抗原还要尽量减少免疫原性 。 抗体酶的研究，为人们提供了一条合理途 径去设计适合于市场需要的蛋白质，即人 为地设计制作酶。

41、它是酶工程的一个全新 领域。 构建有别于天然功能酶的新酶类，是酶工 程研究的又一前沿领地。 以一种分子充当模板，以一种分子充当模板， 其周围用聚合物交联，其周围用聚合物交联， 当模板分子除去后，此当模板分子除去后，此 聚合物就留下了与此分聚合物就留下了与此分 子相匹配的空穴。如果子相匹配的空穴。如果 构造合适，这种聚合物构造合适，这种聚合物 就像就像“琐琐”一样对钥匙一样对钥匙 具有选择性识别的作用具有选择性识别的作用 - -分子印迹。分子印迹。 主主- -客聚合作用或模板客聚合作用或模板 聚合作用聚合作用 类似于抗体、类似于抗体、CDCD模拟酶和天然酶的的结合部位，模拟酶和天然酶的的结合部位

42、， 能否在聚合物中产生？分子印迹技术。能否在聚合物中产生？分子印迹技术。 分子印迹聚合物的分子印迹聚合物的 制备方法制备方法 1.1.选定印迹分子和单体，充分作用选定印迹分子和单体，充分作用 2 2、在印迹分子周围发生聚合反应、在印迹分子周围发生聚合反应 3 3、印迹分子从聚合物中抽提出来。、印迹分子从聚合物中抽提出来。 聚合反应条件的控制：溶剂、交联聚合反应条件的控制：溶剂、交联 剂的浓度等。剂的浓度等。 聚合物的形态有块、珠、薄膜、表聚合物的形态有块、珠、薄膜、表 面印迹等，最常规的是整块聚合物面印迹等，最常规的是整块聚合物 ，然后粉碎过筛，获得不同粒径。，然后粉碎过筛，获得不同粒径。 用

43、乳液聚合、悬浮聚合、分散聚合用乳液聚合、悬浮聚合、分散聚合 可获得粒径均一的整粒。可获得粒径均一的整粒。 印迹分子与聚合单体的结合 印迹分子与单体相互作用的类型：印迹分子与单体相互作用的类型：共价可逆结合共价可逆结合 （预组织法）、非共价结合（自组织法）。（预组织法）、非共价结合（自组织法）。 共价结合：共价结合：印迹分子预先共价联结到单体上，聚印迹分子预先共价联结到单体上，聚 合后共价键可逆打开，除去印迹分子合后共价键可逆打开，除去印迹分子结合部位结合部位 的官能团预先与印迹分子定向排列。的官能团预先与印迹分子定向排列。 非共价结合：非共价结合：印迹分子与功能单体预先自组织排印迹分子与功能单

44、体预先自组织排 列，一非共价健形成多点相互作用，聚合后这种列，一非共价健形成多点相互作用，聚合后这种 作用保存下来。作用保存下来。 聚合物与印迹分子间的作用力的强弱聚合物与印迹分子间的作用力的强弱是影响分辨是影响分辨 力的重要因素，两者间的相互作用力越多（离子力的重要因素，两者间的相互作用力越多（离子 键、氢键等），键的数目又多，聚合物的识别能键、氢键等），键的数目又多，聚合物的识别能 力越强。力越强。 可逆共价结合法 例：印迹分子苯基例：印迹分子苯基-D-D-甘露吡喃糖苷的甘露吡喃糖苷的-OH-OH与乙与乙 烯基苯基硼酸形成可逆共价结合，交联剂下，经烯基苯基硼酸形成可逆共价结合，交联剂下，经

45、 自由基聚合产生具有大量内表面积的微孔聚合物自由基聚合产生具有大量内表面积的微孔聚合物 ，酸水解除去印迹分子，得印迹聚合物。，酸水解除去印迹分子，得印迹聚合物。 对对D D型糖苷有选择性识别，在适当溶剂中，该空腔型糖苷有选择性识别，在适当溶剂中，该空腔 只与只与D D型对映体建立平衡并与之结合。型对映体建立平衡并与之结合。 缺点：携带适当结合基团的聚合单体数量有限，缺点：携带适当结合基团的聚合单体数量有限， 应用范围受限。应用范围受限。 非共价结合 例：印迹分子苯丙氨酸衍生物与聚合单体例：印迹分子苯丙氨酸衍生物与聚合单体 甲基丙烯酸通过离子键、氢键、疏水作用甲基丙烯酸通过离子键、氢键、疏水作用

46、 相结合。相结合。 比共价结合法优越，可使用不同的单体、比共价结合法优越，可使用不同的单体、 洗脱印迹分子的过程更加简单。洗脱印迹分子的过程更加简单。 印迹技术的特点 印迹技术可以产生对底物的特异性结合部位。印迹技术可以产生对底物的特异性结合部位。 将催化官能团以确定的排列引入结合部位。将催化官能团以确定的排列引入结合部位。 底物必须与印迹分子的结构、大小相似，并能与底物必须与印迹分子的结构、大小相似，并能与 催化官能团相结合。催化官能团相结合。 热力学控制的拆分（对映体选择）：决定因素是热力学控制的拆分（对映体选择）：决定因素是 空隙内功能基的取向，形状选择性是第二位的。空隙内功能基的取向，

47、形状选择性是第二位的。 动力学控制的拆分：主要受平衡结合常数的影响动力学控制的拆分：主要受平衡结合常数的影响 ，孔穴的形状是最重要的识别因素。，孔穴的形状是最重要的识别因素。 在载体表面产生分子印迹空腔或进行表面修饰产在载体表面产生分子印迹空腔或进行表面修饰产 生印迹结合部位的过程。生印迹结合部位的过程。 1 1无机物为载体的表面印迹无机物为载体的表面印迹 如：将如：将3-3-（三甲氧基硅烷基）甲基丙烯酸共价结（三甲氧基硅烷基）甲基丙烯酸共价结 合在大孔硅胶表面，引入聚合单体甲基丙烯酸酯，合在大孔硅胶表面，引入聚合单体甲基丙烯酸酯， 待印迹分子与单体共同包被在硅胶表面，聚合，待印迹分子与单体共

48、同包被在硅胶表面，聚合， 除去印迹分子。除去印迹分子。 2 2固体材料的表面修饰固体材料的表面修饰 3 3蛋白质的表面印迹蛋白质的表面印迹 用大分子为模板制备大分子蛋白质印迹聚合物。用大分子为模板制备大分子蛋白质印迹聚合物。 生物印迹：生物印迹：指以天然的生物材料，如蛋白质和糖指以天然的生物材料，如蛋白质和糖 类物质为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印类物质为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印 迹分子具有特异性识别空腔的过程。迹分子具有特异性识别空腔的过程。 原理：原理：生物分子构象的柔性在有机相中被取消生物分子构象的柔性在有机相中被取消 （构象被固定），因而模板分子与生物分子在水（构象被固定

49、），因而模板分子与生物分子在水 溶液中相互作用后产生的构象变化在移入有机相溶液中相互作用后产生的构象变化在移入有机相 后得以保持。后得以保持。 印迹的生物分子只能在无水有机相中起作用：印迹的生物分子只能在无水有机相中起作用：有有 机相中蛋白质的刚性保持了原来的构象，在水相机相中蛋白质的刚性保持了原来的构象，在水相 中蛋白质结合模板的构象不能保持。中蛋白质结合模板的构象不能保持。 如：如：用酒石酸作用于牛血清白蛋白，冷冻干用酒石酸作用于牛血清白蛋白，冷冻干 燥，再用溶剂抽提酒石酸，得到酒石酸印迹燥，再用溶剂抽提酒石酸，得到酒石酸印迹 的的BSABSA。印迹白蛋白在无水乙酸乙酯溶剂中。印迹白蛋白在

50、无水乙酸乙酯溶剂中 结合酒石酸的量比未印迹的白蛋白高结合酒石酸的量比未印迹的白蛋白高3030倍倍. . 生物印迹制备半合成酶 1、蛋白质部分变性，扰乱起始蛋白质的构象。 2、加入印迹分子，与部分变性的蛋白质充分结合。 3、印迹分子与蛋白质相互作用后，用交联剂交联印 迹的蛋白质。 4、透析等方法除去印迹分子。 使起始蛋白质产生了类似于酶的新的活性中心，赋予了新使起始蛋白质产生了类似于酶的新的活性中心，赋予了新 的酶活力。的酶活力。 起始蛋白质既可以无酶活力的蛋白质，也可以是有活力的起始蛋白质既可以无酶活力的蛋白质，也可以是有活力的 酶，印迹分子通常是酶的抑制剂、底物修饰物、过渡态类酶，印迹分子通

51、常是酶的抑制剂、底物修饰物、过渡态类 似物。似物。 通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心 的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在 结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物 定向排列。定向排列。 性质：遵循米氏方程，催化活力依赖反应速度常性质：遵循米氏方程，催化活力依赖反应速度常 数。数。 在人工酶的研究中，印迹被证明是产生酶结合部在人工酶的研究中，印迹被证明是产生酶结合部 位最好的方法。位最好的方法。 印迹分子的选择：印迹分子的选择： 1.1.印迹底物及其类似物印迹底物及其类似物 2.2.印迹过渡态类似物印迹过渡态类似物 3.3.印迹过渡态类似物以及产物印迹过渡态类似物以及产物 p有机相生物印迹酶：有机相生物印迹酶：在在 水相介质中受体（酶底物、水相介质中受体（酶底物、 抑制剂、过渡态类似物）抑制剂、过渡态类似物） 诱导的非酶蛋白质或酶产诱导的非酶蛋白质或酶产 生生“记忆记忆”效应，冷冻干效应，冷冻干 燥后，在非水介质中，其燥后，在非水介质中，其 构象刚性保持诱导产生的构象刚性保持诱导产生的 结合部位。结合部位。 p如：脂肪酶印迹酶如：脂肪酶印迹酶 p生物印迹可以改变酶的