DOXYCYCLINE抑制人肝癌细胞系HEPG2生长的实验研究

1、doxycycline抑制人肝癌细胞系hepg2生长的实验研究文章来源 毕业论文网 毕业论文 作者：张强波李杰时昌文李捷孙京杰曹莉莉 【摘要】  目的：观察多西环素（doxycycline）对人肝细胞性肝癌细胞系hepg2生长抑制和凋亡的作用，并初步探讨其作用机制。方法：不同浓度的doxycycline（5、10、20、30和50 mg/l）对体外培养人肝癌细胞系hepg2进行不同的时间干预（24、48和72 h），mtt法测定细胞生长抑制率，tunel法检测细胞凋亡率，免疫细胞化学检测fas、fasl及mmp-2蛋白表达的变化。结果：doxycycline作用hepg2细胞48 h

2、和72 h后，细胞生长被明显抑制，与无药对照组比较差异有统计学意义（p<0.001），且呈时间、浓度依赖趋势。其细胞凋亡率较无药对照组也明显升高（p<0.01）；20 mg/l doxycycline作用于癌细胞48 h后，实验组fasl蛋白阳性表达较无药对照组明显升高，mmp-2蛋白阳性表达较无药对照组明显降低，两组差异均有统计学意义（p<0.01），而fas蛋白表达则差异无统计学意义（p>0.05）。结论：doxycycline对人肝癌细胞系hepg2具有明显的生长抑制和促凋亡作用，其机制可能与下调mmp-2、上调fasl从而启动fas/fasl膜受体途径有关。【关

3、键词】  肝肿瘤doxycycline细胞凋亡faslmmp-2      【abstract】objective: to observe the effect and mechanism of doxycycline on cell growth inhibition and the apoptosis of human hepatoma cell hepg2 in vitro. methods: hepg2 cells were treated with doxycycline at different concentration

4、s and time in vitro. cell growth inhibition rate was detected by mtt assay, and apoptosis rate was identified by tunel assay, the expression of fas, fasl and mmp-2 proteins were examined by immunocytochemical staining. results: treated with doxycycline at different concentrations （5，10，20，30  a

5、nd 50 mgl-1） for 48 and 72 hours, the growth of hepg2 cells decreased significantly （p<0.001） and there was a tendency of dose-time dependent manner. incubated hepg2 cells with doxycycline at 20 mgl-1 for 48 hours, the expression of fasl were up-regulated and mmp-2 were down-regulated compared wi

6、th those of control group （p<0.01）, while the difference of fas expression was insignificant （p>0.05）. conclusion: doxycycline might inhibit cell growth and induce apoptosis of hepg2 significantly. the mechanism of doxycycline induced apoptosis might be associ    多西环素（doxycyclin

7、e）为4环素类抗生素的1种，已有研究表明其对前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤生长有明显的抑制作用1-3，而其对人肝癌细胞的生长抑制作用国内外未见报道。本研究观察了doxycycline对人肝癌细胞系hepg2的生长抑制和凋亡的影响，并初步探讨其作用机制。    1材料与方法    1.1实验材料人肝细胞性肝癌细胞系hepg2购自美国典型物保藏中心细胞库，用含10%胎牛血清的rpmi1640培养基，37、5%co2饱和湿度的孵箱内常规培养，每日倒置显微镜观察细胞生长情况，3d换液，适时0.25%胰酶消化传代。4甲基偶氮唑盐（mtt）、

8、dmso和doxycycline均购自sigma公司，tunel凋亡检测试剂盒购自roche公司，fasl兔多克隆抗体及mmp-2鼠单克隆抗体购自santcruz公司，fas鼠单克隆抗体购自北京中山公司。    1.2方法    1.2.1mtt法检测肿瘤细胞生长能力取对数生长期hepg2细胞，配成1.5105 ml-1的单细胞悬液，96孔培养板每孔加入200 l细胞悬液约3104细胞，细胞常规培养4 h，贴壁后每孔重新加入含不同浓度doxycycline的培养液2 l，使其终质量浓度约分别为5、10、20、30和50 mg/l，每个

9、药物浓度设5个孔。同时设无药对照组5孔，无细胞培养液1孔（调0孔）。37、5%co2饱和湿度的孵箱内常规培养24、48和72 h，分别取培养板mtt法计算药物作用后的吸光度（optical density,od）。按以下公式计算细胞生长抑制率：    1.2.2tunel检测细胞凋亡取对数生长期生长良好的hepg2细胞，将其分别接种于200 ml培养瓶中，细胞贴壁后更换成含终质量浓度分别为5mg/l和20 mg/l doxycycline的条件培养液作用24、48和72 h。胰酶消化各组细胞后，取1滴细胞悬液于已消毒载玻片上，细胞贴壁生长4 h制成细胞爬片，用11

10、甲醇丙酮固定30 min,保存备用。按tunel试剂说明书（roche）操作，采用倒置荧光显微镜成像，随机选取5个视野300个细胞计算细胞凋亡率。    1.2.3细胞免疫组织化学法检测fasl、fas及mmp-2蛋白的表达应用前述方法制作细胞爬片，分别加入fasl、fas及mmp-21抗，用sabc法进行细胞免疫组织化学染色，dab显色。    1.3判断标准fasl、fas及mmp-2蛋白定位于细胞膜和（或）细胞质，阳性反应为细胞膜和（或）细胞质内着棕黄色颗粒。免疫组织化学结果判定参照文献4，以阳性细胞百分比及着色强度计分做半定量

11、分析。随机观察5个高倍视野，根据阳性细胞数占细胞总数的百分比计为04分：无阳性细胞为0分，<25为1分，2650为2分，5175为3分，>75为4分；染色的深度以多数细胞的显色反应为准，着色强度计04分：无色为0分，淡黄色为1分，深黄色为2分，棕黄色为3分，棕褐色为4分。将上述两项指标的评分相加。每张片分别由2个观察者进行盲法测定，最后取两观察者所得平均值。    1.4统计学处理使用spss11.0统计软件，多组数据间的比较采用单因素方差分析或独立样本t检验，p<0.05为差异有统计学意义。nextpage2结果  &nbs

12、p; 2.1doxycycline对hepg2细胞生长的抑制作用 不同浓度doxycycline作用于hepg2细胞24、48和72 h后，各组od值见表1，其中24 h各实验组od值与对照组相比差异无统计学意义（f=1.15,>0.05），48h和72 h组较对照组均出现了不同程度的生长抑制作用（f=102.9,f=176.7;p<0. 01），并呈明显的时间和浓度依赖性（图1）。                2.2doxycycline对

13、hepg2细胞凋亡的影响本研究选用5、20 mg/l两个药物浓度观察其对hepg2细胞凋亡的影响,在24 h后各组凋亡率差异无统计学意义（p>0.05），而在作用48、72 h后各实验组细胞凋亡率较对照组明显增加，p<0.01（表2，图2）。            2.3doxycycline对hepg2细胞fasl、fas及mmp-2蛋白表达的影响本研究选用20 mg/l  doxycycline作用hepg2细胞观察对fasl、fas及mmp-23种蛋白表达的影响，作用

14、48 h后，fasl、fas及mmp-23种蛋白表达见表3。其中fasl蛋白表达积分较对照组明显增加(图3)，mmp-2蛋白表达积分较对照组明显降低(图4)，而fas蛋白表达与对照组相比差异无统计学意义，p>0.05(图5)。    3讨论    doxycycline是1种化学修饰的4环素类抗生素，近年来，有关其对肿瘤生长抑制作用的研究报道已被广泛关注。cakir等发现5、10 mg/l doxycycline对狗骨肉瘤细胞的生长抑制率分别为50%和72%，bettany等6研究发现doxycycline可以诱导兔破骨细胞的凋

15、亡。本实验结果显示，550 mg/l浓度doxycycline对hepg2细胞具有显著的生长抑制作用，并且呈现明显的剂量和时间依赖性。doxycycline可促进hepg2细胞凋亡，随着药物浓度及作用时间的增加，细胞凋亡率亦相应升高，提示doxycycline对人肝细胞肝癌细胞系hepg2具有明显的促凋亡作用，进而可抑制肿瘤细胞的生长。    细胞凋亡是1个比较复杂的过程，可通过多条启动途径实现，其中膜受体途径（fas/fasl）是最重要的途径之1。liu j等7发现doxycycline可通过fas/fasl介导的膜受体途径诱导t淋巴细胞凋亡，最近研究报道dox

16、ycycline能够明显抑制人胰腺癌细胞增殖，并证实其主要通过caspase依赖的细胞凋亡发挥作用3。有报道表明人肝癌细胞系hepg2表面fas有较强的表达8。本研究结果显示20 mg/ldoxycycline作用hepg2细胞48 h后fasl蛋白表达明显增加，与对照组比较差异有统计学意义（p<0.05），而fas蛋白表达差异无统计学意义（p>0.05）。提示doxycycline可能通过上调细胞表面fasl的表达而启动fas/fasl介导的信号传导途径诱导细胞凋亡。    有报道doxycycline作为mmp抑制剂，具有抑制胶原酶和其他mmp的作

17、用1,5,9。体内外实验发现，doxycycline对前列腺癌、乳腺癌及骨肉瘤均有明显的抑制作用，并证实它可抑制mmps的表达及活性，从而抑制肿瘤的生长1-2,9。mmps可通过多种途径调控肿瘤生长，亦可通过降解基底膜及启动血管内皮细胞生长来促进肿瘤增长及转移10，还可通过降解fasl以减少肿瘤细胞的凋亡11。本研究结果显示，20 mg/l doxycycline作用hepg2细胞48 h后，实验组mmp-2表达阳性率与对照组比较明显降低（p<0.05）。推测doxycycline抑制体外hepg2细胞生长作用可能通过降低mmp-2表达，从而减少fasl的降解,增加其表达，进而启动fas

18、/fasl膜受体途径来促进细胞的凋亡。    药物对肿瘤的抑制作用机制往往是多方面、多途径的，同样doxycycline通过何种途径影响细胞fasl及mmp-2表达，其具体机制尚不完全清楚，有待做更进1步的实验研究和机制探讨。但初期的体外研究得到了较理想实验结果，有望为肝癌的临床诊治寻求1种新的药物治疗。【参考文献】  1 fife rs, sledge gw jr. effects of doxycycline on cancer cells in vitro and in vivoj. adv dent res, 1998, 12（2）:94-96.

19、2 fife rs, sledge gw jr, roth bj, et al. effects of doxycycline on human prostate cancer cells in vitroj. cancer lett, 1998 ,127（1-2）:37-41.3 mouratidis px, colston kw, dalgleish ag. doxycycline induces caspase-dependent apoptosis in human pancreatic cancer cellsj.int j cancer, 2007,120（4）:743-752.4

20、 刑传平,刘斌,董亮.免疫组织化学标记结果的判断方法j中华病理学杂志，2001，30（4）：318。5 cakir y, hahn ka direct action by doxycycline against canine osteosarcoma cell proliferation and colloagenase（mmp-1）activity in vitroj. in vivo, 1999,13（4）：3273316 bettany jt, peet nm, wolowacz rg， et a1 tetracyclines induce apoptosis in osteocoastsj. bone, 2000, 27（1）：75807 liu j, kuszynski ca, baxter bt. doxycycline induces fas/fas ligand-mediated apoptosis in jurkat t lymphocytesj.biochem biophys res commun, 1999,260（2）:562-567.8 masato nakamura, hiroaki nagano, sakon m, et al. role of the fas