临床色谱质谱检验技术：第三章 生物样品制备（三）

1、 第三章 生物样品制备 2017.03.24 临床色谱质谱检验技术 二、复习 三、生物样品制备要求 主要内容 临床色谱质谱检验技术 六、小结与思考 四、生物样品的类型 一、教学要求 五、常用样品制备技术 一、教学要求 临床色谱质谱检验技术 了解：生物样品制备的必要性和原则 熟悉：生物样品的类型及生物样品制备技术的临床应用及前景 掌握：常用生物样品制备技术的基本原理、操作流程及特点 为今后从事临床色谱质谱实验室检验工作打下基础。 第三章教学要求 6/8/2021 教学形式及学时 教学形式：理论教学 学时：2 第三章教学要求 6/8/2021 二、复习 临床色谱质谱检验技术 气相色谱柱的构造 复习

2、 1 毛细管气相色谱柱的参数 复习 2 柱参柱参 数数 固定液 名称 柱长 柱内径 固定液 膜厚 柱温限 复习 3 液相色谱柱的构造 柱管柱管（含有填料填料，柱内壁多经抛光，可 提高柱效，减少管壁效应） 柱头柱头 锥套：锥套：用于密封 筛板筛板：用于封堵住填料并使其不被流动相 冲出柱外而流失 螺帽螺帽 不同厂家和型号的柱子构造会有一定的差别 色谱柱各组件均为不锈钢材质，能 耐受一般的溶剂，含氯化合物有腐 蚀作用，需谨慎使用，以免被腐蚀 柱参数柱参数 物理参数物理参数 柱长、内径、颗粒形状、柱长、内径、颗粒形状、 粒径、孔径、比表面积粒径、孔径、比表面积 化学参数化学参数 填料基质、键合相、填料

3、基质、键合相、 碳载量、封端碳载量、封端 复习 4 液相色谱柱的柱参数 取决于分 析的目的 取决于样品 的化学性质 三、生物样品制备要求 临床色谱质谱检验技术 临床实验室生物样品分析流程 样品采样品采 集集 医生选择检 测项目 病人采样前 准备 采样前注意 事项 样品保存运 输 样品制样品制 备备 稀释 浓缩 加温 染色 离心 蛋白沉淀 液液萃取 固相萃取 衍生化 分析检分析检 测测 显微镜法 放射免疫分 析（RIA） 酶联免疫分 析（EIA） 化学发光免 疫分析 （CLIA） 电泳法 HPLC 法 GC-MS法 LC-MS法 ICP-MS法 数据处数据处 理理 Mass hunter EZ

4、chrom Chem Station 检查峰形 检查曲线 绘制标准曲 线 计算结果 结果报结果报 告告 数据上传至 病人信息系 统 核对病人信 息 结果建议解 释 出具检测报 告 临床实验室传统生化检测工作流程 样品传输系统样品传输系统 开盖子开盖子 离心储存管理器离心储存管理器 自动离心自动离心 盖盖子盖盖子 样品分拣样品分拣 自动分装自动分装 在线分析接口在线分析接口 罗氏分析接口罗氏分析接口 技术人员进行样 本接收 技术人员在LIS系 统中领取标本， 核对并按顺序生 成工作清单 技术人员清点标本、 对样本进行编号， 移取标本到处理管 中 技术人员对 标本按顺序 进行处理 技术人员手动录入

5、 工作清单，并将编 辑生成仪器运行列 表 仪器按照列表对样本进 行检测 技术人员对结果进行审核， 生成结果列表；并对数据 情况进行登记 技术人员将结果 列表导入LIS系 统，生成结果报 告；审核批准 临床色谱质谱实验室检测工作流程 临床色谱质谱实验室检测工作流程-时间占比 标本分析标本分析 6% 标本接收标本接收 6% 数据处理数据处理 27% 标本处理标本处理 61% 临床色谱质谱实验室检测工作流程出错来源 样品处理样品处理 30% 操作者 19% 色谱柱 11% 污染 4% 标准曲线 9% 仪器 8% 样品引入 6% 积分 6% 色谱图 7% 样品制备样品制备=样品处理样品处理+操作者操作

6、者+污染污染 大约占到大约占到50% 样品制备时间长，易出错，why？ 样品采集 分析检测 原形样品不适合直接进行在线分析！ 种类繁多血液、尿液、唾液、乳汁、组织等； 成分复杂数百乃至上千种化合物，大分子（蛋白质、核酸），小分子（脂肪、糖、尿酸）； 浓度太低待测物含量低，不进行富集浓缩，仪器灵敏度无法满足直接检测要求； 样品太“脏”基质组分的存在影响样品测定，产生基质效应； 太“危险”污染物可能成为“色谱柱杀手”、离子源污染。 太“脏”？“太“危险”？ 样品制备目的 净化样品 富集组分 去除干扰成分 减少基质效应 提高灵敏度 保护进样系统 和色谱柱 简化分析过程 提高检测通量 明确生物样品制

7、备的目的和要求 样品制备原则 注意分析物的 浓度及存在形 式 掌握生物样品基 质的性质及特点 防止和避免欲测 定组分发生化学 变化或损失 考虑样品的 量或体积 是否有特殊的 化学修饰或衍 生化 防止和避免欲 测定组分被污 染 制备方法 简单易行 四、 生物样品类型 临床检验生物样品的类型 生 物 样 品 血液 尿液 粪便 脑脊 液 浆膜 腔积 液 关 节腔 积液 精液 前列 腺液 阴道 分泌 物 胃液+ 十二 指肠 引流 液 羊水 痰液 唾液 组织 生物生物 样品样品 血液血液 尿液尿液 唾液唾液 组织组织 临床色谱质谱实验室常用生物样品类型 血液样品 全血 混合510次 混合510次 200

8、0-3000rpm 5-10min 放置3060min 2000-3000rpm 5-10min 尿液样品 保存时间？ 冷藏？ 是否防腐？ 易获得 样品量大 清洁一次性 有盖容器 方便运输， 便于保存 晨尿？ 随机尿？ 24H尿？ 保存条件体积 容器采集时间 唾液样品 无剌激安静状态下进行； 采集前应漱口，除去口腔 中的食物残渣； 唾液自然分泌； 采集后离心，分取上清液 作为分析样品。 组织样品 获取组织 精确并及时 迅速放置在冰 块或液氮冷冻 清洗 冷生理盐水漂 洗 擦干 称重 均质 研磨 机械搅拌 漩涡振荡 声波降解 珠磨 酶解 提取和 分析 肿瘤、病变组织等 干血滤纸片（dried bl

9、ood spot，DBS） 方法：将全血采集在滤纸片上，干燥后得到干血斑块，经溶剂萃取后，通过荧光反应法、串 联质谱法等分析干血斑中待检测组分的信息来反映患者的诊断结果 特殊生物样品类型 应用范围：新生儿筛查、代谢产物含量、酶活性代谢相关疾病的筛查、药 物动力学研究、基因检测及病毒DNA含量等 随着串联质谱技术等的发展，干血滤纸片在遗传代谢类疾病的诊断及筛查 中的应用价值日渐突显 干血滤纸片 采集方便 相比于全血，稳定性较高 储存运输方便，降低成本 所需血量少 在需要多次采样来进行诊断的检测中有着特定 的优势 优势优势 对于部分遗传代谢病，干血滤纸片仅能作为高 危筛查或者新生儿大规模筛查的手段

10、 确诊仍需要进一步对全血进行酶活性检测，并 结合基因突变检测完成疾病的诊断 局限性局限性 干血滤纸片 尿滤纸片 特殊生物样品类型 保存、运输方便，稳定性较好，降低成本保存、运输方便，稳定性较好，降低成本 五、常用样品制备技术 稀稀 释释 浓浓 缩缩 加加 温温 染染 色色 蛋蛋 白白 沉沉 淀淀 液液 液液 萃萃 取取 固固 相相 萃萃 取取 衍衍 生生 化化 超超 滤滤 免免 疫疫 亲亲 和和 萃萃 取取 水水 解解 离离 心心 临床实验室样品制备技术 液液萃取 稀释 固相萃取 离心 过滤 蛋白沉淀 临床色谱质谱实验室常用样品制备技术 衍生化 为什么要蛋白沉淀？ 蛋白质的存在会形成泡沫、浑浊

11、或出现沉淀而严重 干扰分析测定； 若直接进样，蛋白质会沉积在色谱柱上，造成色谱 柱的污染、堵塞，严重缩短色谱柱的寿命。 （一）蛋白沉淀法（protein precipitation,PPT） 定义 通过加入某种试剂，改变溶液环境，使蛋白质的构 象发生变化，导致溶解度降低，生成不溶性颗粒。 NO! 基本步骤 （一）蛋白沉淀法 取样加入蛋白 沉淀剂 高速混合离心直接进样 或稀释、 或浓缩富 集后进样 盐析法盐析法 饱和硫酸铵 硫酸钠 氯化钠 氯化铵 有机溶剂有机溶剂 沉淀法沉淀法 乙醇 乙腈 甲醇 丙酮 丙醇 . 加入变加入变 性试剂性试剂 三氯醋酸 高氯酸 焦磷酸 锌盐 铜盐 汞盐 （一）蛋白沉

12、淀法 方法特点 （一）蛋白沉淀法 优点 简单 快速 经济 回收率高 缺点 样品被稀释，灵敏度受影响 净化程度低，基质效应强 色谱柱寿命短，离子源易污染 为提升灵敏度，需溶剂蒸发 液液萃取 稀释 固相萃取 离心 过滤 蛋白沉淀 小结 3-临床色谱质谱实验室常用样品制备技术 衍生化 定义 采用与水不相溶或微溶的有机溶剂，利用待测组分在两相溶剂中的溶解度或分 配比的不同，将目标分析物从水相提取至有机相而实现分离、提取的方法。 （二）液液萃取（liquid-liquid extraction,LLE） 不互溶有机层 水层 基本步骤 （二）液液萃取 取样 加萃 取剂 涡旋 混匀 取有 机层 吹干 复溶

13、分析检测 （二）液液萃取 影响萃取效率的因素 （二）液液萃取 溶液的pH 非离子型的化合物 提取效率高于离子 型 酸性分析物在酸性 环境中萃取 碱性分析物在碱性 环境中进行 萃取剂 极性大小 与水互溶性 溶解性 沸点高低 不易乳化 萃取操作 萃取时间 萃取容器 萃取次数 乳化现象 方法特点 （二）液液萃取 灵活度高，可选择溶剂类型或改变pH及离子强度等； 干扰少，可去除大量内源性物质； 选择性相对较高，磷脂的残留量比较低； 可蒸发萃取液，富集分析物； 常温下操作、简单快速、经济实用。 优点 耗时费力，一般为手工操作，难以实现自动化； 对于极性大的分析物提取回收率低，所需样品量大； 使用大量有机

14、溶剂，污染环境。 缺点 分钟 0.000.250.500.751.001.251.501.752.00 mAU 0 20 40 60 80 100 mAU 0 20 40 60 80 100 VA 内标 DA D: 信 号 A , 326.0 nm/带 宽 :4.0 nm 1.0 名称 测定血清维生素A的样品制备 目标分析物：血清视黄醇 存在形式：与蛋白结合的复合物 理化性质：脂溶性维生素 举 例 取样稀释 加水 PPT 加乙醇 LLE 加正己 烷 氮吹 取上清 液 复溶 流动相 HPLC分 析检测 Vitamin A1: C20H30O（286.45 gmol-1） VA 六、小结与思考 小结 1-样品制备目的 净化样品 富集组分 去除干扰成分 减少基质效应 提高灵敏度 保护进样系统 和色谱柱 简化分析过程 提高检测通量 生物生物 样品样品 血液血液