虫草菌丝药物血清对白细胞介素-1β损伤胰岛细胞的保护作用的实讲解

1、虫草菌丝药物血清对白细胞介素-1 p损伤胰岛细胞 的保护作用的实验研究(一)作者：郑倩 刘红 曹弟勇 刘华 蓝海涛 敬华娥【摘要】目的通过白细胞介素1 p (Interleukin-1p ,IL-1 B)损伤离体胰岛细胞，研究虫草菌丝(Cordyceps sinensis, CS)含药血清对胰岛细胞的保护作用以及其机制与抗氧化酶和一氧化氮(Nitric oxide ,NO )的关系。方法 离体培养乳鼠胰岛细胞，用IL-1 p损伤胰岛细胞，与不同浓度 CS含药血清共 同孵育，应用MTT法检测细胞活性，放免法检测基础和高糖胰岛素分泌量，比 色法检测细胞培养上清液中一氧化氮(NO的含量，诱生型一氧化

2、氮合酶(Nitric oxide synthase ,iNOS)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase ,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione perioxidase,GSH-Px)的活性。结果CS含药血清显著提高IL-1 p损伤的胰岛细胞活性，并且胰岛细 胞基础和高糖刺激胰岛素分泌量明显提高。IL-1 p作用后细胞培养上清液中 NOS舌性升高，NO含量增加，而SOD GSH-Px的活性水平降低，经与不同浓度 CS含药血清共同孵育后，细胞培养上清液中NO含量减少、iNOS活性降低，SOD GSH-Px的水平明显升高，呈剂量依赖性，具有统计学意义(Pv 0.05

3、, PV 0.01 )。结论CS含药血清对IL-1 p损伤的胰岛细胞分泌功能和细胞活性有保 护作用，其机制与降低iNOS的活性，从而减少NO生成以及提高SOD GSH-PX 的活性水平有关。【关键词】 虫草菌丝血清药理学胰岛细胞损伤细胞保护Abstract : ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of medicated sera of cs on the islet cell damage in duced by IL- 1 p .MethodsThe pan creases of the rats were removed t

4、o collect islet cells ,and the n the cells were divided into no rmal con trol group, IL- 1 p damadaged group, IL-1 p +medicated sera of cs groups.The cellular activity was detected with methyl-thiazol-tetrazolium(MTT) assay,basic amount of in suli n secreti on and stimulated by high glucose was dete

5、cted by radioim muno assay,the content of n itric oxide and activities of n itric oxide syn thase superoxide dismutase and glutathi one perioxidase were determued accord ing to the kit directio n.ResultsMedicated sera of cs obviously improved the islet cellular activity damaged by IL-1p ,and basic a

6、mount of insulinsecreti on and stimulated by high glucose were improved(Pv 0.01 )content of n itric oxide and activity of n itric oxide syn thase in the supernatant were obviously higher in IL-1p damaged group,and therewere sig ni fica nt differe nces betwee n the medicated sera of cs groups and IL-

7、1 p damaged group. Compared with IL-1 p damage group, medicated sera of cs could sig nifica ntly elevate the activities ofsuperoxide dismutase and glutathione perioxidase(Pv0.05 ,P v0.01 ) .Con clusi on Medicated sera of cs plays a protective role in the pancreatic islets damaged by IL-1 B .The prot

8、ective mechanism may be correlated with the decrease of iNOS activity and the content of n itric oxide,a nd the in crease of the activities of superoxide dismutase and glutathi one perioxidase.Key wordsCordyceps sinensis; Seropharmacology ; Islets ofIangerhans ; Cytoprotction； Cell trauma1型糖尿病是一种胰岛B

9、细胞选择性破坏的自身免疫性疾病，其病理表现 为大量免疫炎性细胞浸润胰岛，并分泌白细胞介素-1 B （IL-1 B）、肿瘤坏死因子（TNF）和干扰素-丫 （IFN- 丫）等细胞因子，其中IL-1 B可能是其重要的内源 性损伤因子1。近年来中草药对糖尿病的防治作用受到了广泛关注。冬虫夏 草是一种名贵强壮滋补中药，为麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫上 的子座及其幼虫尸体的复合体。其味甘、性温，归肺、肾经，有补虚填精、保 肺益肾、止血化痰等作用，现代药理学证明其有抗氧化、调节免疫、抗肿瘤、 抑菌、抗病毒的作用。但由于天然虫草有严格的寄生性和特殊的生长地理环 境，药缺价高，限制天然虫草的使用。人工

10、虫草是人工发酵培养得到的菌丝， 其成分和药理作用与天然虫草基本一致，因此对虫草菌丝的实验研究和临床应 用逐步深入，有报道认为虫草菌丝可以降低血糖的浓度2，以及提高肝纤维 化大鼠的胰岛细胞基础胰岛分泌量3，但其具体机制并不清楚，缺乏相关的 基础研究。目前有报道认为胰岛抗氧化系统活性降低与一氧化氮（NO水平提高是糖尿病早期病变之一，NO和氧自由基可破坏胰岛细胞，引起 1型糖尿病。 本实验室用IL-1 B损伤乳鼠胰岛细胞，观察IL-1 B对胰岛抗氧化系统活性与 NO水平的影响，采用血清药理的方法探讨虫草菌丝对IL-1 B损伤的离体胰岛细胞的活性和分泌功能是否具有保护作用以及其机制与抗氧化作用和NO的

11、关系。1器材1.1材料出生13 d的Wistar大鼠和体重200220 g的健康Wistar大 鼠均由川北医学院实验动物中心提供；RPMI-1640培养液为美国GIBCO公司产 品；IL-1 B、胎牛血清为天津灏洋生物科技有限责任公司产品；虫草菌丝购自 中美华东医药制药公司（批号061140）;胰岛素放免检测试剂盒为华西生物制剂 公司产品；胶原酶 V型、STZ均为美国Sigma公司产品；SOD GSH-Px NO NOS测定盒由南京建成生物工程研究所提供；其他试剂为国产分析纯。1.2仪器CO2孵育箱（Forma scientific,美国），超净工作台（SW-CJ-2FD,苏州安泰），倒置相差

12、显微镜（olympus，日本）,全自动酶标仪（BIORAD 2550型，美国），紫外分光仪（RF-540,日本岛津），台式冷冻高速离 心机（日立himac CF-15型，日本），高压蒸气灭菌器（YXQ-SG46上海博讯 有限公司医疗设备厂）。2方法2.1药物血清的制备 选用Wistar大鼠40只，体重200220 g，雌雄 各半。灌胃前禁食12 h，设立正常对照组和用药组，用药组给予虫草菌丝灌 胃，每次10 ml/ kg，分低、中、高3个剂量组（1，10, 20 g/kg ），分别相 当于70 kg成人用量的5，10, 20倍，正常对照组给予等容量生理盐水灌胃， 所取血清为生理盐水对照血清，作

13、对照用。使用二次加强给药法给药（首次 给药2 h后，再次予相同的剂量灌胃），在第 2次给药后第1, 2, 3 h，于无 菌条件下自心脏采血，静置 4 h以上，离心30 min（3 000 r/min ，4C），分离 血清，56C，灭活30 min，置-70C低温冰箱冷藏备用，1个月内使用。2.2胰岛细胞分离与培养出生13 d的Wistar大鼠20只，无菌取出胰 腺，清洗，剪碎，V型胶原酶消化，Han kS液终止消化，消化离心。加入10%S台 牛血清的RPMI-1640培养液，制成细胞悬液，37C，5%CO孵育箱内培养24 h 后，去除成纤维细胞，收集胰岛细胞，制成新的细胞悬液，调节细胞浓度至

14、1X 106 ml，置96孔板培养，每孔内加入细胞悬液 200卩l。随机分组。分为 正常对照组、IL-1 B损伤组、IL-1 B +不同浓度CS含药血清保护组（IL- I B +CS1为低剂量含药血清组，IL-1 B +CS2为中剂量含药血清组，IL-1 B +CS3 为高剂量含药血清组），每组平行孔 6孔，损伤组和保护组每孔细胞加100 u/ml IL-1 B 20卩l作用20 h后，正常对照组加入大鼠生理盐水对照组血清 20卩l，于不同保护组分别加入20卩l低、中和高剂量含药血清 CS继续培养 30 h，进行各项检测。2.3四唑蓝比色法（MTT法）检测细胞活性检测方法如下：将各组细胞离 心

15、（500 r/min x 5 min ），吸取细胞培养上清液，于细胞中加200卩l的培养液（不含胎牛血清）和5mg/ml的MTT 20卩l，放入CO2孵育箱培养4 h后， 再离心（1 000 r/min x 10 min），弃上清，加入二甲亚枫 200卩l，振荡5 min,在全自动酶标仪上比色，测出每孔光密度值（ODfi）进行比较，检测波长为600 nm, OD值越高表明细胞活性就越强。2.4胰岛细胞上清液胰岛素分泌量测定提取正常对照组、IL-1 B损伤组和IL-1 B +CS组各待测标本细胞培养上清液，用放免法检测胰岛素的基础分泌 量；在抽取上清液的各组细胞中加入含20 mmol/L的葡萄糖

16、培养液继续培养2h,离心提取上清液，按上述方法进行高糖刺激胰岛素分泌量检测。2.5细胞培养液NO水平，iNOS, SOD GSH-PX舌性的检测提取正常对照 组、IL-1 B损伤组和IL-1 B +CSS各待测标本细胞培养上清液，分别用试剂盒 进行检测，步骤严格按试剂盒说明进行。2.6统计学处理实验结果以土 s表示，a =0.05，采用方差分析。整个统计 资料采用SAS软件处理完成。3结果3.1 CS药物血清对IL-1 B损伤胰岛细胞活性影响表1结果表明IL-1 B损 伤组与正常对照组比较光密度值 OD值降低，表明细胞活性明显下降（PV0.01 ）;损伤后加入不同浓度CS药物血清共同孵育可使O

17、D值较损伤组均有不 同程度的提高，具有显著意义，且具有剂量依赖性。表1不同浓度CS药物血清对IL-1 B损伤细胞活性的影响（略）与空白组比较,“ Pv0.01 ;与IL-1 B损伤组比较， Pv0.05 , Pv 0.01 ; n=63.2细胞培养液胰岛素分泌量测定结果见表 2。加入IL-1 B作用后胰岛细 胞基础分泌胰岛素量和葡萄糖刺激分泌量显著下降（Pv 0.01 ），在损伤的基础 上与不同浓度CS药物血清共同培养30 h后，测试培养液中分泌量和葡萄糖刺 激胰岛素分泌量较损伤组有明显升高，具有统计学意义。表2细胞培养液基础胰岛素分泌量和葡萄糖刺激胰岛素分泌量（略）与正常对照组比较，* Pv

18、 0.01;与IL-1 B损伤组比较， Pv 0.05， Pv 0.01 ； n=63.3细胞培养液中SOD, GSH-Px水平的测定与IL-1 B作用后胰岛细胞培 养液中SOD舌性显著降低（Pv0.01 ），GSH-PX舌性减弱（Pv 0.01 ），在损伤 的基础上与不同浓度CS药物血清共同培养30 h后，测试培养液中SOD以及 GSH-PX勺活性升高，具有统计学意义。见表 3。3.4细胞培养液中NO含量和iNOS活性的检测加入IL-1 B后，与正常对照 组比较可见胰岛细胞培养液中iNOS的活性与NO含量显著增加（Pv0.01 ），经 与不同浓度CS药物血清共同培养30 h后，测试培养液中i

19、NOS的活性降低，NO 的含量减少，具有统计学意义。见表 4。表3细胞培养液SOD和 GSH-PX舌性（略）与正常对照组比较，* Pv0.01 ；与IL-1 B损伤组比较， Pv0.05, Pv 0.01;n=6表4细胞培养液NO含量和iNOS活性（略）与正常对照组比较，* Pv0.01 ；与IL-1 B损伤组比较， Pv0.05， Pv 0.01 ； n=64讨论血清药理学研究是指给动物灌胃或人服用一定量的中药或复方制剂，在一 定时间后采集血液，分离血清，以此进行体外试验的一种实验方法。此方法由 20世纪中期日本学者Iwama H等提出。与传统的将中药粗提物直接加入反应体 系中的方法相比，它

20、具有明显的优势：在某种程度上克服了中药本身的杂质对 试验结果的影响，而且相对接近于药物在体内生物转化的真实过程，能客观地 阐明中药药效和作用机理，且使中药药理的研究易于深入到细胞分子水平。近 20年来，其已成为中药药理研究的一个热点，在体外实验中得到了广泛的应 用，是目前研究中药药理学的一种较为理想的方法4。本研究采用血清药理 方法探讨CS对IL-1 B损伤胰岛细胞的保护作用和机制，实验中多次给药可使 血清药物浓度出现累加效应，二次重复给药提高了血清药物浓度，所采集的血 清经56C，灭活30 min处理后，避免了未灭活血清中某些物质对细胞产生毒 性和不良反应。本实验表明IL-1 B对胰岛细胞具

21、有损伤作用，表现在 100 u/ml的IL-1 B 使胰岛细胞活性减弱，并且可抑制胰岛分泌功能，使胰岛素基础分泌量和葡萄 糖刺激胰岛素的分泌量均减少，这与 Ohara-lmaizumi M 5报道IL-1 B可抑 制胰岛B细胞活性以及胰岛素释放等生物作用相似。经与含CS含药血清作用后，能反转IL-1 B损伤的离体胰岛细胞的活性，细胞活性与未加保护剂的损 伤组比较均有显著提高；并且能减轻IL-1 B损伤的胰岛素分泌和葡萄糖刺激 的胰岛素分泌，使胰岛分泌功能增强。有报道认为，细胞因子对胰岛细胞的损伤与NO生成增多和SOD GSH-Px表达异常有关6。本实验亦证明IL-1 B作用后胰岛细胞SOD GSH-PX舌力明 显降低，SOD是机体内清除氧自由基的重要抗氧化酶之一，对机体的氧化与抗 氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基（O-2 ）保护细胞免受损伤，其活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶。它特异的催化还原型谷胱 甘肽（GSH对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作 用。自由基增多可对细胞、组织造成广泛损害，自由基可通过丙二醛等醛类的 促