核酸提取常见试剂地作用原理

1、实用标准异硫氰酸胍强用力的蛋白质变性剂， 能迅速溶解蛋白质， 导致细胞结构破碎， 核蛋白由于其二级结 构的破坏消失而迅速与核酸分离。 胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂， 在通常使用的蛋白 质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍， 它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。 含 有强力的阴离子和阳离子基团， 它们可以形成较强的氢键。 在还原剂存在的情况下， 异硫氰 酸胍可以断裂氢键，而去垢剂，如 SDS 存在的情况下，可以破坏疏水作用。盐酸胍、尿素盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂， 它并不是一种足够强的变性剂， 可以允许完整的 RNA 从富含 RNase 的组织中提取出来。4-8M 可断裂氢键，有两种可

2、能机制： 1 变性蛋白和盐酸胍、尿素优先结合，形成变性 蛋白 -变性剂复合物， 当复合物被除去， 从而引起 N-D 反应平衡向右移动， 随着变性剂浓度 增加，天然状态的蛋白不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性；2 盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作用，能形成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，结果盐酸胍、尿素就称 为非极性残基的较好溶剂， 使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强，盐酸胍、 尿素引起的变性往往是不可逆的。高浓度尿素使蛋白质变性并抑制 Rnase 活性十二烷基肌氨酸钠使蛋白质解体 变性巯基试剂文案大全实用标准1 防止蛋白质或酶等（如辅酶 A ）分子中 SH 基团氧化成二硫键， 2

3、在某些酶反应过程中维持体系的还原环境。 DTT ， DDTE 、巯基乙醇应用最广，谷胱甘肽也常应用，由于他是生物体内的还原剂，同时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放。 DNA 提取中，常使用巯基乙醇，维持缓冲液的还原环境， 防止多酚类氧化， 由于具有一定的毒性， 浓度不应高于 2% 。巯基乙醇- 巯基乙醇的主要作用是破坏 RNase 蛋白质中的二硫键（肽和蛋白质分子中的 半胱氨酸 残 基中的键）。1 还原蛋白质二硫键，使 Rna 酶变性2 抑制酚类氧化，若氧化，核酸会变成灰黑色，苯酚的氧化产物苯醌等氧化物引起磷酸二 酯键的断裂及导致 RNA 和 DNA 的交联3 保护蛋白质的巯基 蛋白质提取中需

4、要巯基乙醇还原二硫键，使 RNA 酶失活化学变性剂 SDS 、尿素、盐酸胍能破坏疏水键、盐键、氢键、范德华力使蛋白质变性但不影响肽键和二硫键，不能使蛋白质彻底变性加上还原剂巯基乙醇或 DTT ，能还原二硫键，使 RNA 彻底变性文案大全实用标准DTT 二硫苏糖醇刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。而且 DTT 比巯基乙醇的浓度低 7 倍时， 两者效果相近，但 DTT 价格略高一些。由于容易被空气氧化，因此 DTT 的稳定性较差；但 冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。 由于质子化的硫的亲核性较低， 随着 pH 值的降低， DTT 的有效还原性也随之降低； DTT 或含有 D

5、TT 的溶液不能进行高压处理。 抑制 Rnase 活性TCEP 三 （2- 甲酰乙基 ）膦盐酸盐半胱氨酸Trizol苯酚、异硫氰酸胍、 8羟基喹啉、 - 巯基乙醇等。 TRIzol 的主要成分是苯酚。苯酚的主要 作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质， 但不能完全抑制 RNA 酶活性， 因此 TRIzol 中还加入了 8羟基喹啉、 异硫氰酸胍、 - 巯基 乙醇等来抑制内源和外源 RNase （ RNA 酶）。0.1% 的 8 羟基喹啉可以抑制 RNase ，与氯仿联合使用可增强抑制作用。 异硫氰酸胍属于解偶剂， 是一类强力的蛋白质变性剂， 可溶解蛋白质并

6、使蛋白质二级结构消 失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。- 巯基乙醇的主要作用是破坏 RNase 蛋白质中的二硫键。液氮组织破碎，裂解细胞文案大全实用标准SDS十二烷基硫酸钠阴离子去垢剂，高温（ 55-65 ）裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，形成SDS/ 蛋白质 /多糖复合物，释放核酸，提高盐（ KAc 或 NaAc ）浓度并降低温度（冰浴） ，使 SDS/ 蛋白质 /复合物转变为溶解度更小的钾盐酸形式，使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全、离心后除去沉淀，上清液中的 DNA 用酚 /氯仿抽提，乙醇沉淀水相中的DNA操作简单，温和，可提取到高分子量的阳离子强表面活性剂，通常与蛋白酶 可破坏

7、细胞膜、核膜，并使组织蛋白与 溶解膜类蛋白DNA ，但产物多糖类杂质较多K 和抗氧化剂、螯合剂一起使用DNA 分离SDS 能裂解细胞。使细胞中的蛋白质和核酸之间常借着静电引力或配位键结合，阴离子去 污剂能够破坏这种价键，使染色体离析，蛋白变性，释放核酸。（1 ）SDS 是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质的 疏水部位 ;（2 ）SDS 可引起蛋白质构象改变（3 ）SDS 是一种良好的解离剂，可使蛋白质溶解，变性（4）形成 SDS- 蛋白质复合物，并使复合物带负电文案大全实用标准质粒方面：在 1的 SDS溶液中慢慢加入 5 N 的 NaCl ，你会发现 SDS 在

8、高盐浓度下是会 产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了 SDS 的沉淀。但如果你加入的不是 NaCl 而是 KCl ， 你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠( sodium dodecylsulfate )遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 ( potassium dodecylsulfate, PDS )，而 PDS 是水不溶 的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液 III 加入后的沉淀实际上是钾离子置换了 SDS 中的纳 离子形成了不溶性的 PDS ，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS 专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然

9、就 将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组 DNA 也一起被共沉淀了。 基因 组 DNA 一旦发生断裂，只要是 50 100 kb 大小的片断，就没有办法再被 PDS 共沉淀了CTABCTAB：十六烷基三甲基溴乙胺，低温时易沉淀阳离子去污剂 一种在高盐下能和核酸结合形成可溶、稳定的复合物，低盐浓度下可沉淀的表面活性剂 是一种阳离子去污剂 , 低离子强度( 0.1-0.5M NaCl )，沉淀核酸与酸性多聚糖，而蛋白质 和中性多聚糖仍留在溶液中。 在高离子强度的溶液中 (0.7mol/L NaCl) ，CTAB 与蛋白质和 多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除

10、蛋白，多糖，酚类等杂质 后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。CTAB 可从大量产生黏多糖的植物及某些革兰氏阴性菌制备纯化的 DNA ，这种去污剂加入 调节至高离子强度的细菌和细胞裂解液中( 0.7M NaCl )，经过连续的酚 /氯仿抽提，去除 CTAB/ 黏多糖 / 蛋白质复合体，异丙醇 / 无水乙醇沉淀上清即可将 DNA 分离出来文案大全实用标准CTAB 还有提高 DNA 互补链复性速率及稳定已形成的 DNA 双螺旋的作用CTAB 法的主要特点是用用较广CTAB 溶液在低于 15 度会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料时，必须预热，且离心温度不低于 15 度EDTA酶抑制剂，螯合二价

11、金属，抑制金属依赖性的酶螯合 Mg2+ 或 Mn2+ 离子，抑制细胞中 DNase 的活性，该酶可降解 DNAEDTA 是去垢剂，结合离子用，而它结合的部分离子是能够诱发或者促进 RNA 酶活性的， 比如 Ca2+ 。EDTA 是一种二价离子熬合剂 ,能熬合 Mg2+ 和 Ca2+ 等二价阳离子 ,而多种 RNA 酶的活性是需要依赖二价阳离子的 ,所以 EDTA 能通过熬合二价阳离子来抑制 RNA 酶的活性 碱性条件下才能够溶解， 要和 NaOH 粉末混合后， 再加水，然后用 NaOH 水溶液调节 pH 。 0.01M ，DNase 酶基本失活。BSA酶抑制剂，使一些降解酶的活性的表面变性精胺

12、或其他多胺 酶抑制剂，降低核酸酶的影响氰化物酶抑制剂，降低重金属氧化酶的影响文案大全实用标准PVP 减少酚类、醌类、单宁类物质的影响，抗氧化作用，络合多酚和萜类物质，防止多酚类褐变 而氧化，去除多糖和色素，色素是 PCR 强抑制剂，必须去除 样品液氮研磨及提取缓冲液中加入 PVP 或 PVPP 等能络合多酚和萜类物质，离心或氯仿抽 提出去，有效防止多酚氧化成醌类，避免溶液变褐色而具有抗氧化能力 提取液中加入适量的 PVP 或 PVPP 能提高 DNA 的纯度， 用量根据杂质而定 (1-6% )，PVP 同时能去除多糖，因此将 PVP 和巯基乙醇配合使用并调整用量，能有效防止多酚污染 PVP(

13、聚乙烯吡咯烷酮 )是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚， 减少 DNA 中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。Triton-x100Triton X100 之类的去垢剂有苯环结构，所以在 280nm 有很强的吸收。蛋白酶 K蛋白酶 K：切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸的羧基端肽键，将 蛋白质降解成小肽或氨基酸，使 DNA 分子完整地分离出来。蛋白酶 K 在较广的 pH 范围内均有活性 (pH 4-12.5 ) 温度范围 37-60 度 盐浓度 3M GuHCl 或 4M 尿素中均有活性 在一些去污剂： Tween20(5%) 、Triton X

14、-100 (1%) 和 SDS(1%) 条件下也有活性。文案大全实用标准蛋白酶 K 消化裂解法适用于所有标本的消化处理， 尤以 DNA 样品为佳 .如组 织细胞 （包 括石蜡包埋组织 ）绒毛、毛发、精斑、血液 （血清、血浆、全血 ）局部分泌 物、尿，粪便等 . 蛋白酶 K 的一般工作浓度是 50 100 g/ml蛋白酶 （蛋白酶 K 或链酶蛋白酶 ） 可以降解蛋白质 ,灭活核酸酶 （DNase 和RNase） ,DNase 和 RNase 也用于去除不需要的核酸，有人使用蛋白酶替代 DEPC 处理水 的，但有些人说效果不好。蛋白酶 K，威力巨大的广谱蛋白酶， 95C 加热 10 分钟，则完全失

15、活。数年前首次使 用它替代 DEPC 处理 RNA 抽提用的离心管和枪头，效果不错；后来又用于处理 RNase-Free 的水，效果也是一级棒。 从此就再也不用 DEPC 了。配制 RNA 裂解试剂时， 直接用灭菌的双蒸水配制，最后，加入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml 。轻轻混匀，室温放置 15 分钟后即可。枪头及离心管去除 RNase ：先将枪头及离心管清洗干净后， 移入预先混好的含 1ug/ml 蛋 白酶 K 的双蒸水，彻底浸入。室温放置 30 分钟后，连水一起高压灭菌。弃水后，烘干即 可。RNase-Free 水的获得：直接在灭菌的双蒸馏水中加入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml 。

16、轻轻 混匀，室温放置 15 分钟后， 灭菌处理即可。 该蛋白质的残留对后续实验没有可见的影响。 无蛋白质残留的 RNase-Free 水的获得：这比较麻烦。直接在灭菌的双蒸馏水中加入蛋白 酶 K 至终浓度 1ug/ml 。轻轻混匀后， 倒入专用的蒸馏器中。 放置 15 分钟后， 加热蒸馏， 流出的就是无蛋白质残留的 RNase-Free 水。要提醒的是，该专用蒸馏器头几次流出来的 水，只能当普通蒸馏水用，因为通道中难确保 RNase-Free 的环境；另外，一定要主要密 闭性，否则，流出的水又被污染了。文案大全实用标准DNA 裂解液的作用是破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与 DNA 分离，抑制细

17、胞中 Dnase 的活性，而蛋白酶 k 的作用是将蛋白质降解成小肽或氨基酸， 使 DNA 分子完整地分离出来！ 溶菌酶溶壁酶DnaseRnase多糖水解酶：水解多糖饱和酚酚是一种有机溶剂 ,预先要用 STE 缓冲液饱和 ,因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化发黄 ,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联：故在制备酚饱和液时要加入 82 羟基喹咛 ,以防止酚氧化。苯酚非极性分子 水为极性分子使蛋白质变性， 同时抑制了 DNase 的降解作用。 用苯酚处理匀浆液时， 由于蛋白与 DNA 联结键已断， 蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。 蛋白分子溶于酚相， 而

18、 DNA 溶于水相。使用酚的 优点 ： 1. 有效变性蛋白质； 2. 抑制了 DNase 的降解作用。能有效使文案大全实用标准蛋白质变性而出去， 酚形成的有机相破坏蛋白质的胶体稳定性， 从而蛋白质不会分布在水相 中，避免核酸污染缺点：1. 能溶解 10-15% 的水，从而溶解一部分 poly （A）RNA。2. 不能完全抑制 RNase 的活性。酚变性大，但与水相有一定程度的互溶，大约 10-15% 的水溶在酚相中，使核酸损失酚（ Phenol ）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提 掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如 4M 的异硫氰酸胍），

19、离 心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚 / 氯仿始终在下层，方便水相的回收； 还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提 后会有大量的酚溶解到水相中， 而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应）， 应此如果 单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚 / 氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多， 微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能 正常进行。 至于异戊醇的添加， 其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰， 也方便 了水相的回收。氯仿非极性分子 水为极性分子去除脂肪 ,使更多蛋白质变性 ,从而提高提

20、取效率 克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。 （酚 易溶于氯仿中）氯仿变性不如酚好，但与水不混溶，不会带走 DNA文案大全实用标准因此混合使用最佳， 经酚第一次抽提的水相有残留的酚， 由于酚和氯仿互溶， 可用氯仿第二次带走酚，也可在第二次抽提中混合使用，比例为1： 1苯酚 / 氯仿苯酚、氯仿抽提去除蛋白质非极性分子 水为极性分子，当蛋白水溶液与他们混合时，蛋白质分子见的水分子被挤去， 使蛋白失去水合状态而变性，经离心，变性蛋白密度比对大，而与水相分离，苯酚 / 氯仿比 重大，保留在最下层苯酚氯仿 使蛋白质变性 量要足够， 因为苯酚去除蛋白是有一定的饱和度

21、的， 超过饱 和度，裂解体系中蛋白质不能被一次性去除， 必须多次抽提。 离心后分三层，下层 有机层 中 有一些 脂溶性 的杂质， 中间层 白色絮状沉淀是蛋白， 上清液 中即含有 核酸 ； 变性后的蛋白 质从水相中析出，位于苯酚中或苯酚与水相之间。异戊醇抽提 DNA ，为混合均匀，容易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用，加入异戊醇降低 分子表面张力，一般采用氯仿：异戊醇 =24 ：1 或酚：氯仿：异戊醇 =25 ：24 ：1 （不必先 配置，临用前加入即可）减少操作过程中产生的气泡。减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。 异戊醇可以降低表面张力， 从而减少气泡产生。 另 外，异戊醇有助于分相，使

22、离心后的上层含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶 剂相维持稳定。文案大全实用标准NaCl提供一个高盐环境，使 DNA 充分溶解于液相沉淀 DNA 时总会加入 高浓度的盐 ,加盐的目的是破坏能使蛋白质保持稳定的两个因素,使蛋白和 DNA 分离并沉淀下来 .而此时盐的阳离子会与 DNA 结合形成 DNA- 阳离子盐 溶于溶液 中,再用 无水乙醇可以将 DNA- 阳离子盐沉淀下来提取 DNA 时先加 0.14mol/L 氯化钠，因为在这种浓度的氯化钠溶液中， DNA 的溶解 度最低，而蛋白质的溶解度增加，这样通过过滤能将 DNA 分离开，以除去蛋白质。再加入 95% 的酒精能使 DNA

23、沉淀，因为在这个浓度下 DNA 溶解度最低。如果直接加酒精不先加 氯化钠， DNA 和蛋白质都能被酒精所沉淀，就无法将 DNA 和蛋白质分离开。所以必须先 加氯化钠后加酒精，顺序不能颠倒。DNA 溶液是 DNA 以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去 DNA 周围的水 分子，使 DNA 失水而易于聚合。 这样可以是 DNA 沉淀出来在 pH 为 8 左右的溶液中， DNA 分子是带负电荷的，加一定浓度的 NaAc 或 NaCl ，使 Na+ 中和 DNA 分子上的负电荷，减 少 DNA 分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀，当加入的盐溶 液浓度太低时，只有部分

24、DNA 形成 DNA 钠盐而聚合，这样就造成 DNA 沉淀不完全，当 加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的 DNA 中，由于过多的盐杂质存在，影 响 DNA 的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。柠檬酸钠它可以控制反应体系的离子强度， 同时还有一定的缓冲作用， 保证体系 PH 的相对稳定状态， 总之柠檬酸钠在这里的作用类似于食物中的防腐剂。文案大全实用标准DEPC焦碳酸二乙酯，它通过和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制 酶的活性。与肝素何用效果增强。在 Tris 中不稳定，很快会分解为二氧化碳和乙醇。 强烈但不彻底的 RNA 酶抑制剂0.1% 浓度Tris

25、-HCl缓冲体系，使 pH 变化不会太大异丙醇加入异丙醇之后立即出现絮状沉淀， 我一直以为这是正确的， 看了帖子才知道是蛋白质污染， 异丙醇的沉淀效果要比无水乙醇的沉淀效果要好， 但是异丙醇沉淀有一个弊端就是会沉淀下 来好多的盐和蛋白质这样会影响下一步的操作，一般我加异丙醇是等体积的效果还可以。70% 乙醇70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀 （因为在 70% 乙醇里 DNA 是不溶的 ,而盐离子却可溶 ）,用无水乙醇 则达不到这个目的 !乙醇对于蛋白质、核酸的沉淀效应随分子量加大而增大，小分子的核酸 和蛋白质碎片是可以溶于 75% 乙醇的。 漂洗 DNA ，是为了去除残余的盐类， 去除过量 SDS 和酚等杂物，因为 SDS 在 70% 的乙醇中保持溶解状态，不与 DNA 共沉淀，从而通过弃上 清液去除这种去污剂 ,避免对以后 PCR 反应的影响。DEPC文案大全实用标准焦碳酸二乙酯） :常用 RNA 酶抑制剂，与 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性 ,强烈但不彻底的 RNA 酶抑制剂甲酰胺用高浓度甲酰胺替代苯酚从细胞裂解物的蛋白酶K 消化物中分离抽提 DNA ，甲酰胺是种离子化溶剂，能