重组DNA技术与基因工程

1、生物技术与应用 重组dna技术与基因工程 华东理工大学 张惠展 重组dna技术与基因工程 5 2 3 4 1 6 7 8 9 重组dna技术与基因工程的基本概念 重组dna技术与基因工程的基本原理 重组dna技术所需的基本条件 重组dna技术的操作过程 目的基因的克隆与基因文库的构建 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因表达产物的分离纯化 a 重组dna技术的基本定义 1 重组dna技术与基因工程的基本概念 重组dna技术是指将一种生物体（供体）的基因与 载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受 体）内，使之按照人们的意愿稳定遗

2、传并表达出新产物 或新性状的dna体外操作程序，也称为分子克隆技术。 因此，供体、受体、载体是重组dna技术的三大基 本元件。 b 基因工程的基本定义 1 重组dna技术与基因工程的基本概念 基因工程是指重组dna技术的产业化设计与应用， 包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的 是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组dna技 术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模 培养以及基因产物的分离纯化过程。 c 重组dna技术与基因工程的基本用途 1 重组dna技术与基因工程的基本概念 分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源 大规模生产生物活性物质 设计、构建生物的新性状甚至新

3、物种 d 基因工程的基本形式 1 重组dna技术与基因工程的基本概念 第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程 第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程 第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程 d 基因工程的基本形式 1 重组dna技术与基因工程的基本概念 c 重组dna技术与基因工程的基本用途 b 基因工程的基本定义 a 重组dna技术的基本定义 a 重组dna技术的理论基础 2 重组dna技术与基因工程的基本原理 19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学 20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因

4、基因学 1944年 艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质dna 1973年 伯格-杰克森-考恩-鲍耶 dna分子体外拼接 分子遗传学 1953年 沃森-克瑞克 dna双螺旋结构 分子生物学 基因工程 b 基因的分子生物学 2 重组dna技术与基因工程的基本原理 c 基因工程的基本原理 2 重组dna技术与基因工程的基本原理 提高外源基因的剂量分子遗传学原理 筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：启动子、 增强子、操作子、终止子、上游调控序列等 列、mrna非编码区、密码子等 分子生物学原理 修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：sd序 基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产 生化工

5、程学原理 分子生物学原理 d 基因工程的支撑技术 2 重组dna技术与基因工程的基本原理 核酸凝胶电泳技术 核酸分子杂交技术 细菌转化转染技术 dna序列分析技术 寡核苷酸合成技术 基因定点突变技术 聚合酶链反应（pcr）技术 a 用于核酸操作的工具酶 3 重组dna技术所需的基本条件 限制性核酸内切酶 dna连接酶 dna聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能 识别双链dna分子中的特定序列，并切割dna双链 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来dna的入侵 细菌的限制与修饰作用 hsd r：编码限制性核酸内切酶 hsd m：编码限制性甲基化酶 h

6、sd s：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 1968年，smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出 hind ii和hind iii 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的类型 主要特性 i 型 ii 型 iii 型 限制修饰多功能单功能双功能 蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体 辅助因子atp mg2+ samatp mg2+ sammg2+ 识别序列tgan8tgct旋转对称序列gagcc aacn6gtgccagcag 切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近 距识别序列下游 随机性切割特异性切割24-26bp处 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的命名 属名 种名 株名 h i

7、n d iii h i n d iii haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 ii 型限制性核酸内切酶的基本特性 识别双链dna分子中4 - 8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 5 g c t g a a t t c g a g 3 3 c g a c t t a a g c t c 5 ecor i的识别序列ecor i的切割位点 ecori等产生的5粘性末 端 5 g-c-t-g-a-a-t-t-c-g-a-g 3 3 c-g-a-c-

8、t-t-a-a-g-c-t-c 5 ecori 37 5 g-c-t-g-oh p-a-a-t-t-c-g-a-g 3 3 c-g-a-c-t-t-a-a-p oh-g-c-t-c 5 退火 4-7 5 g-c-t-g a-a-t-t-c-g-a-g 3 3 c-g-a-c-t-t-a-a g-c-t-c 5 oh p ohp psti等产生的3粘性末端 5 g-c-t-c-t-g-c-a-g-g-a-g 3 3 c-g-a-g-a-c-g-t-c-c-t-c 5 psti 37 5 g-c-t-c-t-g-c-a-oh p-g-g-a-g 3 3 c-g-a-g-p oh-a-c-g-t-c

9、-c-t-c 5 退火 4-7 5 g-c-t-c-t-g-c-a g-g-a-g 3 3 c-g-a-g a-c-g-t-c-c-t-c 5 oh p ohp pvuii等产生的平头末端 5 g-c-t-c-a-g-c-t-g-g-a-g 3 3 c-g-a-g-t-c-g-a-c-c-t-c 5 pvuii 37 5 g-c-t-c-a-g-oh p-c-t-g-g-a-g 3 3 c-g-a-g-t-c-p oh-g-a-c-c-t-c 5 限制性核酸内切酶 ii 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 大部分ii 型核酸内切酶需要相似的反应条件： tris-hcl50 mm ph 7.5 m

10、gcl210 mm nacl0 - 150 mm dtt1 mm 0 - 50 mm 低盐酶 100 mm 中盐酶 150 mm 高盐酶 volume20 - 100 ml t t37 1 - 1.5 hr 1 u 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全 水解 1 mg 标准dna所需的酶量 ii 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 ii 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 0.1倍体积的 5 m naac ph 5.

11、4 2.5倍体积的冰冷乙醇 冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切。 dna连接酶 dna连接酶的基本性质 修复双链dna上切口处的磷酸二酯键 dna连接酶 5 g-c-t-c-t-g-c-a g-g-a-g 3 3 c-g-a-g a-c-g-t-c-c-t-c 5 oh p ohp 5 g-c-t-c-t-g-c-a-g-g-a-g 3 3 c-g-a-g-a-c-g-t-c-c-t-c 5 nick nick dna连接酶 dna连接酶的基本性质 修复与rna链结合的dna链上切口处的磷酸二酯键 t4-dna连接酶 5 g-c-u-c-u-g

12、-c-c-g-g-a-g 3 3 c-g-a-g a-c-g-g-c-c-t-c 5 ohp nick 5 g-c-u-c-u-g-c-c-g-g-a-g 3 3 c-g-a-g-a-c-g-g-c-c-t-c 5 dna连接酶 dna连接酶的基本性质 连接多个平头双链dna分子： 5 g-c-t-c-a-g-c-t-g-g-a-g 3 3 c-g-a-g-t-c-g-a-c-c-t-c 5 5 g-c-t-c-a-g-oh p-c-t-g-g-a-g 3 3 c-g-a-g-t-c-p oh-g-a-c-c-t-c 5 t4-dna连接酶 dna连接酶 dna连接酶的反应条件 tris-hc

13、l50 - 100 mm ph 7.5 mgcl210 mm atp0.5 - 1 mm dtt5 mm volume10 - 20 ml t t4 - 15 4 - 16 hr 1 u dna连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时， 完全连接 1 mg l-dna（hind iii片段）所需的酶量 dna连接酶 平头双链dna片段的连接操作 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的 连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连 接，因此后者反应速度要慢得多 提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物

14、的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% peg8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（nacl），最终浓度150-200 mm dna聚合酶 大肠杆菌dna聚合酶 i（ dna pol i ） 5353的dna聚合酶活 性5353的核酸外切酶 活性3535的核酸外切酶活 性 大肠杆菌dna聚合酶 i的基本性质： 3 g-c-t-c-a-g-c-t-g-g-a-g-a 5 5 c-g-a-g-t-oh 5 ppp dn mg2+ 3 g-c-t-c-a-g-c-t-g-g-a-g-a 5 5 c-g-a-g-t-c-g-a-c-c-oh dna pol i dna聚合酶 大肠杆菌dn

15、a聚合酶 i 大片段（ klenow ） klenow酶的基本性质： 大肠杆菌dna聚合酶i经枯草杆菌蛋白酶处理，获得n端 三分之二的大肽段，即为klenow酶 klenow酶仍拥有5353的dna聚合酶活性和3535 的核 核酸外切酶活性，但失去了5353的核酸外切酶活性 dna聚合酶 大肠杆菌dna聚合酶 i 大片段（ klenow ） klenow酶的基本用途： 补平由核酸内切酶产生的5粘性末端 dna片段的同位素末端标记 cdna第二链的合成 双脱氧末端终止法测定dna序列 dna聚合酶 大肠杆菌dna聚合酶 i 大片段（ klenow ） klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产

16、生的5粘性末端 5 g-c-t-g-oh p-a-a-t-t-c-g-a-g 3 3 c-g-a-c-t-t-a-a-p oh-g-c-t-c 5 klenowdatp dttp 5 g-c-t-g-a-a-t-t-oh p-a-a-t-t-c-g-a-g 3 3 c-g-a-c-t-t-a-a-p oh-t-t-a-a-g-c-t-c 5 dna聚合酶 大肠杆菌dna聚合酶 i 大片段（ klenow ） klenow酶的基本用途： dna片段的同位素末端标记 5 g-c-t-g-oh p-a-a-t-t-c-g-a-g 3 3 c-g-a-c-t-t-a-a-p oh-g-c-t-c 5

17、klenowa-32p-pppda dttp 5 g-c-t-g-a-a-t-t-oh p-a-a-t-t-c-g-a-g 3 3 c-g-a-c-t-t-a-a-p oh-t-t-a-a-g-c-t-c 5 dna聚合酶 t4-dna聚合酶 t4-dna酶的基本特性： 在无dntp时，可以从任何3-oh端外切 在只有一种dntp时，外切至互补核苷酸暴露时停止 在四种dntp均存在时，聚合活性占主导地位 5353的dna聚合酶活性和3535的核酸外切 酶活性 dna聚合酶 t4-dna聚合酶 t4-dna聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3粘性末端 5 g-c-t-c-t-g-c-a-o

18、h p-g-g-a-g 3 3 c-g-a-g-p ho-a-c-g-t-c-c-t-c 5 t4-dna聚合酶 5 g-c-t-c- oh p-g-g-a-g 3 3 c-g-a-g-p ho -c-c-t-c 5 注意：该酶也能降解双链dna，只是其活性比单链降解活性低很多 dna聚合酶 t4-dna聚合酶 t4-dna聚合酶的基本用途： dna片段的同位素末端标记 5 g-c-t-c-a-g-c-t-g-g-a-g-t 3 3 c-g-a-g-t-c-g-a-c-c-t-c-a 5 mg2+ 5 ppp dn 5 ppp da（a-32p- datp） 5 g-c-t-c a-g-c-t

19、-g-oh ho-t-c-g-a-c-c-t-c-a 5 t4-dna pol t4-dna pol 5 g-c-t-c-a-g-c-t-g-g-a-g-t 3 3 c-g-a-g-t-c-g-a-c-c-t-c-a 5 dna聚合酶 依赖于rna的dna聚合酶（反转录酶） 反转录酶的基本特性：以rna为模板聚合cdna链 3aaaaaaaaaaaaaa5mrna 反转录酶mg2+ dntp 5tttttttttttt oligo (dt) 12-18 3aaaaaaaaaaaaaa5mrna 5tttttttttttttt3cdna dna聚合酶 依赖于rna的dna聚合酶（反转录酶） 反转

20、录酶的基本特性：双向外切dna-rna杂合链中的rna链 反转录酶 3 rna 5 dna3 5 3 rna 5 dna3 5 反转录酶 5 dna3 核酸酶 单链核酸外切酶：核酸外切酶vii（exovii） 大肠杆菌的核酸外切酶vii不需要mg2+ exovii 3 53 5 3 53 5 核酸酶 双链核酸外切酶：核酸外切酶 iii（exoiii） exovii 3 53 5 mg2+ 3 53 5 大肠杆菌的核酸外切酶 iii 特异性地从3 端外切 核酸酶 双链核酸外切酶：l 核酸外切酶（ lexo） lexo 3 53 5 mg2+ l核酸外切酶特异性地从5 端外切 3 53 5 核酸酶

21、 单链核酸内切酶：s1核酸酶 s1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（aspergillus oryzae） zn2+必需 最适ph范围为4.0 - 4.3 需要nacl 10 - 300 mm 降解单链dna的速度比降解双链dna快75000倍 降解单链dna的速度比降解单链rna快7倍 核酸酶 单链核酸内切酶：s1核酸酶 s1核酸酶的基本反应：内切单链dna或rna 5 g-c-t-c-a-g-c-t-c-t-t-g-a-g-g-a-g-t 3s1zn2+ 5 g-c-t-c-a-g-c-t-c t-t-g-a-g-g-a-g-t 3 5 g-c-t-c a-g-c-t-c t-t-g-a-

22、g g-a-g-t 3 5 dnmps 或 5 nmps 核酸酶 单链核酸内切酶：s1核酸酶 s1核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链dna或rna 5 g-c-t-c-a-g c-t-g-g-a-g-t 3 3 c-g-a-g-t-c-g-a-c-c-t-c-a 5 5 g-c-t-c-a-g-c-t-g-g-a-g-t 3 3 c-g-a-g-t-c a-c-c-t-c-a 5 nick gap s1 zn2+ 5 g-c-t-c-a- g 3 c-g-a-g-t- c t-g-g-a-g-t 3 a-c-c-t-c-a 5 核酸修饰酶 末端脱氧核苷酰转移酶（tdt） tdt的基本特性

23、：来自小牛胸腺 不需要模板的dna聚合酶，随机掺入dntps 5 p 3 ho oh 3 p 5 tdtmg2+ datp 5 p 3 ho aaaaaaaaaaaa oh 3 p 5 tdt的基本特性： 5 p 3 ho oh 3 p 5 tdtco2+ datp 5 p 3 ho aaaaaaaaaaa aaaaaaaaaa oh 3 p 5 5 p 3 ho oh 3 p 5 tdtco2+ datp 5 p 3 ho aaaaaaaaaaaaaa oh 3 p 5 aaaaaaaaaaa b 用于基因克隆的载体 3 重组dna技术所需的基本条件 质粒（plasmid） 噬菌体或病毒dn

24、a 考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 人造染色体载体 载体的功能及特征 载体的功能及特征 载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 载体的功能及特征 载体应具备的条件 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 具有合适的筛选标记 具有较高的外源dna的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 质 粒 质粒的基本特征 质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并 被稳定遗传的一类核酸分子 质粒常见于原核细菌和真菌中 绝大多数的质粒是dna型的 绝大多数的天然

25、dna质粒具有共价、封闭、环状的分子结构， 即cccdna 质粒dna的分子量范围：1 - 300 kb 质 粒 质粒的基本特征 质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的dna复制系统进行自主复制 质粒dna上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为 两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 relaxed plasmid 质 粒 质粒的基本特征 质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性

26、，不相容性的质 以大肠杆菌的质粒为例： cole1、pmb1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 psc101、f、rp4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15a及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 粒组成不相容性群 质粒 质粒的基本特征 质粒的不相容性：分子机制 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种 拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同， 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的 拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定， 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一 细胞内 其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优

27、势 质 粒 质粒的基本特征 质粒的可转移性 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如f、col、r质粒等 如col、r的其它成员 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用 值得注意的是，某些非接合型质粒（cole1）在接合型质粒 的存在和协助下，也能发生dna转移，这个过程由 bom 和 mob 基因决定 质 粒 质粒的基本特征 携带特殊的遗传标记 野生型的质粒dna上往往携带一个或多个遗传标记基因，这 使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成 抗生

28、素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对dna重组分子的筛选具有重要意义 质粒 质粒的构建 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点 少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往 往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构 建的： psc101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 tcr cole1 6.5 kb 拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因 e1 rsf2124 cole1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 apr 质粒 质粒的分类 人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷

29、贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因 低拷贝质粒 来自psc101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因 温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质 测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker 整合质粒 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合 穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆 表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件 探针质粒 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选 质 粒 重要的大肠杆菌质粒载体 松弛型复制 pbr322 4363 bp origin of replication rop roi sa

30、l i bamh i tcr pvu i pst i pst i ecor i cla i hind iii hind ii bal i apr pbr322： 氯霉素可扩增 拷贝数 50 - 100 / cell 用于基因克隆 质粒 重要的大肠杆菌质粒载体 puc18 / 19： 拷贝数 2000 - 3000 / cell 用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（mcs） 正选择颜色标记 lacz bamhi puc18 2686 bp apr lacz ori gaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagctt 396452 e

31、corisstikpnismaixbaisalipstisphihindiii 质粒 质粒dna的分离纯化 实验室一般使用下列三种方法制备质粒dna： 氯化铯密度梯度离心法 质粒dna纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染 碱溶法 质粒dna纯度底、快速、操作简便 沸水浴法 质粒dna纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间 质粒 质粒dna的分离纯化 氯化铯密度梯度离心法： 用含有edta的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加cscl和溴乙锭 超速离心过夜 在紫外灯下吸取cccdna 稀释沉淀cccdna proteins ocdna l-dna cccdna rnas 质粒 质粒dna

32、的分离纯化 碱溶法： 用含有edta的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加naoh和sds的混合溶液，去膜释放内含物 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染 色体dna及大部分蛋白质 离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质 乙醇或异丙醇沉淀水相质粒dna 用无dnase的rnase去除残余的rna cccdna l-dna ocdna d-dna t-dna 质粒 质粒dna的分离纯化 沸水浴法： 用含有edta和triton x-100的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴40秒钟 离心，用无菌牙签挑去沉淀物 乙醇或异丙醇沉淀质粒dna 噬菌体或病毒dna 噬菌体

33、或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染 宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏 起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。 噬菌体或病毒的上述特性使得它们的dna能被开发成为基因工 程的有用载体，因为： 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的 l 噬菌体dna l 噬菌体的生物学特性： 生物结构 l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体 l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-dna组成 l-dna全长48502个核苷酸 l-dna上至少有61个基因 l 噬菌体生物学特性： 生物结构 5 tc

34、cagcggcgggg3 3cccgccgctgga 5 cos cos cos 头部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 dna合成控制基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重组基因 删除与整合基因 l l - dna 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的 l 噬菌体dna l 噬菌体生物学特性： 感染周期 e.coli 吸附lamb受体 注入复制 包装 裂解 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的 l 噬菌体dna l 噬菌体生物学特性： 感染周期 体内包装 100个左右的拷贝 包装范围为原dna的75 - 105% 即 36 - 51 kb d a 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的 l

35、噬菌体dna l 噬菌体生物学特性： 溶原状态 l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其 dna直接整合到宿主细胞的染色体dna上，并不产生子代噬菌 体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-dna上的ci和int 两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿 主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-dna或宿主细胞 的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态 dna重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的 l 噬菌体dna l-dna载体的构建：缩短长度 野生型l-dna包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有 当插入的外源dn

36、a片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染 力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-dna的长度，可以提高装 载量。其实野生型l-dna上约有40-50%的片段是复制和裂解 所非必需的。根据切除的多少，可将l-dna分成两大类载体： 插入型载体 取代型载体 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的 l 噬菌体dna l-dna载体的构建：缩短长度 插入型载体 体外包装插入位点 体外包装插入片段 载体长度 37 kb 插入片段大小： 0 - 14 kb （51 37） 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的 l 噬菌体dna l-dna载体的构建：缩短长度 取代型载体 体外包装 体外包装插入片段 最小装载长度 10

37、kb （51 26） 载体长度 26 kb 插入片段 最大装载长度 25 kb （36 26） 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的 l 噬菌体dna l-dna载体的构建：删除重复的酶切位点 野生型的l-dna链上有5个ecori位点和7个hindiii位点，不 利于重组操作，必须删除至1 - 2个 同时，为了便于各种来源的dna片段的克隆，还需要增加一 些单一的酶切位点 除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶 位点 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的 l 噬菌体dna l-dna载体的构建：加装选择标记 与质粒不同，野生型l-dna上缺少合适的选择标记，因此 加装选择标记是l-dna克

38、隆载体构建的重要内容 l-dna克隆载体上的选择标记主要有下列两类： 免疫功能类标记 颜色反应类标记 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的 l 噬菌体dna l-dna载体的构建：加装选择标记 imm434 imm434基因编码一种阻止l-噬菌体 进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记 基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶 原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑； 当外源dna插入到标记基因中，基因灭 活， l-重组分子便进入溶菌循环，形成 透明斑 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的 l 噬菌体dna l-dna载体的构建：加装选择标记 lacz lacz基因编码b-半乳糖苷酶，能催化 无色的x-gal生成蓝色化

39、合物。当外源基 因插入到lacz基因中，基因灭活，不能 合成蓝色化合物；而空载体l-dna则产 生蓝色透明斑 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的 l 噬菌体dna l-dna载体的主要类型： 插入灭活型载体charon2、charon6、lgt11 取代型载体lembl4、lgtlc、lnm762、charon40 正选择型载体lembl1、ll47、l1059 野生型的l噬菌体不能在p2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（spi+）， 这种生长抑制表型受l-dna上的red和gam两个基因控制。若将外 源dna取代red和gam，重组噬菌体便拥有spi-表型，能在p2噬菌 体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，

40、并形成透明斑 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的 l 噬菌体dna l-dna重组分子的体外包装： l-dna重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗 粒，方可高效导入受体细胞 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提 取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分： 一部分缺少e组份，另一部分则缺少d组份。包装时，当且仅当 这两部分包装蛋白与重组l-dna分子混合后，包装才能有效进 行，任何一种蛋白包装液被重组l-dna污染后，均不能被包装 成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的 l 噬菌体dna l-dna及其重组分子的分离

41、纯化： 将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时 用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒 密度已达1013 -1014 / l，大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放l-dna 乙醇或异丙醇沉淀l-dna 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的 l 噬菌体dna l-dna作为载体的优点： l-dna可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l-dna载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组l-dna分子的筛选较为方便 重组l-dna分子的提取较为简便 l-dna载体适合克隆和扩增外源

42、dna片段，但不适合表达 外源基因 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的m13单链噬菌体dna m13噬菌体的生物学特性： 生物结构 m13噬菌体的外型呈丝状 m13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链dna组成 m13 dna全长6407个核苷酸 m13 dna上至少有10个基因 2700个外壳蛋白分子 m13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的m13单链噬菌体dna m13噬菌体的生物学特性： 感染周期 + dna （+）dna rfdnarfdna rfdna- dna ii v 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的m13单链噬菌体dna m13 dna载体的构建： iii

43、vi i iv ii x v vii ix viii 野生型m13rf-dna iii vi i iv ii x v vii ix viii m13mp系列载体 laczpolylinker 噬菌体或病毒dna 大肠杆菌的m13单链噬菌体dna m13 dna载体的特点： 使克隆的dna片段以特定单链的形式输出受体细胞外 这在dna定向突变中非常有用 m13重组分子筛选简便 被m13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混 浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊 斑的混浊度亦越大 但m13-dna载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb 噬菌体或病毒dna 与动植物受体细胞相适应的载体一般选

44、择相应动植物的病 毒基因组dna。 动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病 毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类： 单链dna病毒双链dna病毒 单链rna病毒双链rna病毒 rna病毒在自我复制时大多存在相应的dna中间反应物， 这些中间体可作为载体进行常规的dna重组。 考斯质粒与噬菌粒 l-dna载体和m13-dna载体的装载量最大分别为25 kb和 1.5 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源dna片段， 考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体dna 的装载量。 在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体dna的长度， 就能同步增加载体的装载能力

45、。将噬菌体dna与包装有关的序 列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时 又能保证重组dna分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这 便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒 和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组dna分子在细胞内 不能形成噬菌体颗粒。 考斯质粒与噬菌粒 考斯质粒（cosmid） 考斯质粒载体的构建： 考斯质粒是一类人工构建的含有 1978年collins和hohn发明构建 phc79 6400 bp tcr l fragment cos ori apr psti bamhi sali l-dna cos序列和质粒复制子的 特殊类型的载体 cos s

46、ite - carrying plasmid 1.8 kb的l-dna片段 + pbr322片段 装载范围为31 - 45 kb 考斯质粒与噬菌粒 考斯质粒（cosmid） 考斯质粒载体的特点： 能像l-dna那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围 能像质粒那样在受体细胞中自主复制 重组操作简便，筛选容易 不能体内包装，不裂解受体细胞 考斯质粒与噬菌粒 噬菌粒（phagemid or phasmid） 噬菌粒载体的特点： 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子 以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体 能像m13-dna那样体外包装，并高效转染受体细胞 装载量比常规的m13mp系列要大很多（10 kb） 能像质粒那样在受体细胞中自主复制 重组操作简便，筛选容易 通过克隆双链dna能获得同等长度的单一单链dna 考斯质