qPCR实验操作流程

1、Q-PCR实验流程一、实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄 膜手套，RNA抽提需带口罩。取EP管/枪头时需用镊子，不可以 用使用过的手套直接取用。取完 EP管/枪头后，袋子及时封好。橡 胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移 液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不 要在超净台前讲话。二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净， 加入 1ml Trizol （Invi

2、trogen）溶液，吹打混匀，并吸至 RNase free EP 管中使细胞充分裂解，室温静置 5min ；组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀， 室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200卩氯仿，剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触，室温 静置3-5min:（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序 也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3） 4C下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移 至另一个新的 RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清 时，

3、枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4） 沉淀RNA :加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不 应用振荡器混匀），室温静置10min；5）4C下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见 EP管 底部有沉淀，应将 EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在 4C下，14,000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清：6）用75%乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠 倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不 能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。7）视沉淀量加入适量DEPC水（至少15

4、ul）溶解沉淀。三、去基因组使用RNase-free的DNase ?（Promega），按以下体系配置反应液，37C 消化 30min，65C 灭活 10min。RNA30卩1DNase ?20卩110 x buffer10卩1H2O(RNase free)卩1RNasi n卩1总体积100卩1然后按以下步骤操作：1）加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm， 离心15mi n,取上清。2）加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm,离心15min， 取上清。3）加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8 次） , -20C静置15min

5、;4）4C下，14,000g离心15min，收集RNA沉淀，去上清；5）用75%乙醇洗涤两次（12,000g离心5min），超净台风干；6）加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。四、总RNA纯度和完整性检测1） 纯度检测：取1卩l RNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定 OD值， OD260/OD280的比值大于，说明制备的 RNA较纯，无蛋白质污染。2） 总RNA完整性检测：取RNA样品1门1 %琼脂糖凝胶电泳80VX20min, EB 染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总 RNA的5s rRNA，18s rRNA 和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总 RN

6、A抽提比较完整。五、逆转录1. mRNA :1）在RNase free的PCR管中配置下列溶液.Total RNApgH2O卩1总体积12pi2）将上述溶液吹打均匀，置85C保温5min,使RNA变性。随后立即冰上致冷, 以防止RNA复性；3）在该PCR管中加入下列试剂（Promegaoligo (dT)plRan dom primerpl10mM dNTPplRNase in hibitorpl5 x bufferplM-MLVpl总体积pl4）将上述20卩反应溶液30C保温10min;5）42 T 保温 50min；6）85 T 保温 10min；7）-20 C 保存。2. microRN

7、A :使用茎环逆转录法，原理如下图:Step 2: Real-time PCRReverse primer1）在去RNase的PCR管中配置以下溶液total RNAX个miR逆转录引物H2O*XPg卩1总体积pl2） 将上述溶液混匀，85C孵育5min，以打开RNA二级结构。随后立即置于冰 上，以防止RNA复性再次恢复二级结构；3）在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：10mM dNTP (promega)plRNase in hibitor (promega)plU6逆转录引物pl5x bufferplM-MLV (promega)pl总体积pl4）将3）溶液加入到1）溶液中，混匀后

8、30C保温10min；5）42C 孵育 50min;6）85E孵育10min灭活逆转录酶。四、定量PCR检测1引物测试：根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率， 具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性， 选择标准为：单峰且峰形 偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。 若设计的多对引物熔解曲线均显示 特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。2 确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。（1） 一个样 品的加样尽可能安排在同一行（2）如正式实验中

9、三次重复不能安排在同一板上， 则需把三次重复中的实验分开，但同一次重复的实验不能分开两板3 正式实验：体系配制：H204ulSYBR Green PCR Master Mix10ul（TOYOBO）（使用前需振荡均匀）上游引物（10uM）下游弓丨物（10uM）总体积15ul计算好实验中需用多少份体系，则按具体量配置。体系分装会有损失，一般多配份-1份体系。总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul每管分装至8连管中。3. cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为 1:20稀释，如遇到基因表达低的 样品，则适当降低稀释比例至1:10或1:5。cDNA按一定顺序排好后，即可加至

10、 刚配好的反应体系中。加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标 记好1-12的顺序（不可将标记写在反应管的盖子上，八连管盖避免裸手触摸中 间透明的荧光采集区域，且保证每孔均盖紧，否则影响重复性或可能出现熔解曲 线峰漂移。）4. 把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。五.上机：先开电脑，进入 Windows界面。接着打开PCR仪电源开关。打开7500软件，选择“新建”，在“Template”下拉菜单中选择“ 60”或“ 65”（普通基因检测为“ 60”，MicroRNA检测为“ 65”）打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔位，剔除无反应管的孔位。点击File菜单中Save,输入要保存结果的文件名，命名为日期-上机时间-客户 名字简写，如 WL表示8月30日10点08分魏立的实验。点击 Start 键，开始运行程序。程序运行完毕后，取