DNA胶回收中常见问题和解答

1、1、如何计算提取率？1) 回收前样品中，往往含有非目的 DNA 片段、引物、 dNTP 等，所以不能用测回收前后吸光度的的方法计 算回收率；2) 可将回收前后 DNA 片段一起电泳，使用凝胶成像系统拍照后，用配套的软件进行电泳条带灰度对比；3) 注意，电泳条件及拍摄条件将对灰度对比结果造成很大影响，请仔细操作，以减小误差。2、如何简易测算提取率？取胶回收后的 DNA 溶液体积的 1/51/10 ，与等体积的回收前的 DNA 溶液的 5-10 倍稀释液一起电泳，肉眼 观察回收后的条带相对于回收前条带的亮度，粗略测算回收率(如亮度只有一半时，其回收率可粗略为50% )。3、如何看待提取得率？影响回

2、收率的因素很多，如 DNA 片段大小、点样量、凝胶种类、电泳缓冲液的缓冲能力、切胶操作、紫外灯 照射强度和时间、溶胶是否彻底等等，所以不能单凭 1-2 次的实验来判断其质量好坏，最好是多做几次实验或用几 种不同品牌的产品做平行对照实验，结果相对真实。 ?4、回收率为什么与点样量和片段大小有关？DNA 片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低； DNA 的量越少，相对损失越大，回收 率越低。5 、用胶回收试剂盒从凝胶中回收 DNA 得率低是什么原因？1 ) 胶块溶解不完全，可适当延长水浴时间和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例；2 ) 胶块体积太大，应使用枪头捣碎，还不能充分溶解

3、则先将其切为小块，分多次回收；3 ) 紫外灯下切胶时间过长，导致 DNA 部分降解，应尽量把切胶时间控制在 30s 以内；4 ) 洗涤液使用后未及时盖严瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率；5 ) TAE 或 TBE 电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致PH 值升高，降低 DNA 和膜的吸附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好；6 ) 回收前的样品量太少，加大点样量；7)洗脱前，预先65 C预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可以有效提高回收率30%以上。6 、加入溶胶液温浴后，液体仍很粘稠或后续步骤有堵柱子现象？1) 胶块溶解不充分，可再补加一些溶胶液或延长水浴时

4、间并增加上下颠倒次数帮助溶胶；2) 胶块体积过大，应尽量切除多余部分，并将其切为小碎块，分几次回收；3) 水浴温度是否达到规定温度 65 C,用温度计检测。7 、琼脂糖凝胶块不溶？1 ) 琼脂糖质量不好；2) 含目的片断的凝胶在空气中放置过久，使胶块失水干躁，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存于4 C或-20 C;3) 制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。8 、点样时发现 DNA 样品有漂出点样孔外的现象？柱子上的乙醇未完全挥发干净，延长室温下空柱静置时间以确保乙醇完全挥发干净。9、能否使用去离子水洗脱回收？可以，但是实验室所用去离子水一般PH值偏低，可用NaOH适当调高PH值，以增加回收得率。1

5、0、能否使用 TE （）洗脱？可以。11、可否使用小于30 pl的洗脱液进行洗脱？不可以。因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积。12、关于 DNA 片段大小与回收率的问题？100bp-500bp ， 30-60% ；500bp-4kb ， 80-95% ；4kb 以上， 30-50% 。13、OD值与琼脂糖凝胶中的 DNA产量不相符？从柱子上洗脱下来的痕量杂质增加了A260 的值。14 、吸光度纯度测定时应注意哪些问题？ 吸光度测量的是未知样品与调零标准之间的相对吸光度，所以请用与洗脱液体相同的液体，对测量样品进行稀释和调零。15、为什么溶胶不彻底会影响回收结果的纯度？在电泳过程中， DNA 会与大分子的多糖紧密的结合在一起