重组载体质粒扩增流程[苍松书屋]

1、重组载体质粒扩增的实验步骤：、感受态细菌的制备（CaCl2化学转化法） 准备：LB液体培养基、LB固体平板（含抗生素和未含抗生素）、0.1mol/L氯化钙溶液（预冷）、细菌冻存液（0.1Mol/L CaCl2+7%/10%的DMSO或15%的甘油）、高压过的EP管等1、将适合的冻存菌（ stbl3）挑取一点（枪头沾取一点）加入盛有1ml LB液体培养基的15ml离心管中；37，220rpm，摇菌培养1个小时（复苏)。2、取10l以下刚复苏的stbl3涂布于非抗性的LB固体培养基上37过夜培养（纯化）。3、挑取20多个前一天培养的细菌菌落加入3ml LB液体培养基里37，220rpm，摇菌培养1

2、2个小时（扩增，需使细菌老化，因为下一步摇出的菌才可处于对数生长期）。4、以1：100的比例将3ml培养物转接于300ml LB培养基中，在37 220rpm摇床上剧烈振荡培养约1.5-2小时（使细菌处于对数生长期，易于转化，可每半小时测一下OD600值，使其0.3-0.5）；5、制冰。 以下步骤开始注意无菌操作：6将所有培养好的菌液分装移至离心管中，在冰上冷却10分钟； 74下3000g冷冻离心10分钟； 8弃去上清，加入 30ml预冷0.1Mol/L CaCl2 溶液，轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟； 94下3000g冷冻离心10分钟； 10 弃去上清，加入 5ml预冷

3、0.1Mol/L CaCl2 溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细菌重新悬浮；11 4下3000g冷冻离心10分钟；12. 弃去上清，加6ml 0.1Mol/L CaCl2+7%/10%的DMSO或15%的甘油混匀后，分装成100l或200ul/EP管（4预冷），-80冷冻贮存备用。【练手实验中扩增摇菌时中途摇床关闭了一段时间（具体不详），后续接着摇菌过夜。离心时用的6000rpm，第二次离心时很快溶解，遂进行了第三次离心获取沉淀。配制冻存液忽视了甘油对氯化钙的稀释，用1.8ml 50%的甘油加入4.2ml 0.1mol/L的氯化钙，即氯化钙的浓度没有达到0.1mol/L 。分装时每个EP管含

4、有300l的感受态细菌。】、重组载体质粒转化细菌及转化成功细菌（即转化子）的筛选 准备：含筛选抗生素的固体培养基、冰、42水浴锅、37预热的培养基1、 取100l感受态细菌在冰上解冻，每管加质粒载体（体积10l，DNA50ng），轻弹以混匀内容物，在冰中放置30min。2、 将EP管放到预加温到42的循环水浴中的浮板上，放置90s2min，不要摇动EP管。3、 快速将EP管转移到冰浴上中，使细菌冷却12min 4、 每离心管加400l LB培养基，事先用水浴将培养基加温到37，然后将管转移到37摇床上，温育45min至1H使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。5、 将适当体积（10

5、l?）已转化的感受态细菌涂布到含相应抗生素抗性（100g/ml的终浓度）的LB固体培养基上旋转均匀涂布直至有发涩的感觉，即使平板干燥，然后倒置平皿，于37培养，1216h后可出现菌落（或者将质粒涂布均匀后在37孵箱里先正放培养30min左右，再倒放培养）。【练手实验中转化VSVG质粒的平板长了2个菌落，而8.2质粒的平板貌似没有菌落形成。分析原因排除了平板氨苄青霉素浓度（100g/ml）太高,可能有两个原因：1、复苏的细菌浓度低，操作时将100l感受态细菌加入了800l的培养基摇菌，并且只摇菌40min；2、涂板时量太少，只加了20l的复苏菌涂布。总的来说可能种在平板上的细菌太少。】、转化细菌

6、的扩增：准备：LB培养基1、 挑取以上培养的转化细菌的单菌落（1至数个）于2.5ml 有氨苄抗生素的LB液体培养基里37 220rpm摇菌12H（扩增细菌）2、 将上一步摇的2.5ml细菌加入250ml抗性LB液体培养基（氨苄青霉素）里，37 220rpm摇菌24H（扩增质粒）注：扩增的质粒不能立即提取时可将所有菌液转移至离心瓶里6000rpm离心收集细菌沉淀，然后-20保存。【此次提质粒的细菌连同LB培养基一起冻存了，应把离心弃去培养基后仅冻存沉淀】、重组载体质粒提取及纯化（详见试剂盒质粒提取步骤）1 用15 ml离心管收集1-5 ml菌液。12,000 rpm离心1min，弃上清。 根据所

7、培养菌体的浓度与质粒的拷贝数，确定收集的菌液量。2 加入250 l溶液/RNase A混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。室温静置1- 2min。3 加入250 l溶液，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2 min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。 不可剧烈混和，否则会使染色体DNA 断裂。 此步骤不宜超过5 min。4 加入350 l溶液，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。5 12,000 rpm 室温离心10 min，收集上清。6 将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2 min。 如果收集的上清液过多，超过DNA 纯化柱容积（800 l），可将上清分

8、次加入DNA 纯化柱中。7 12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。 此时质粒DNA 被吸附于DNA 纯化柱的硅胶膜上。8 加入500 l 溶液PB，12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。 此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。9 加入500 l溶液W，12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。 溶液W 初次使用前用无水乙醇按1: 1.5 稀释，即含60%乙醇。10 加入500 l溶液W，12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。11 12,000 rpm 离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。12 将DNA纯化柱置于新的离心管中

9、。向纯化柱中央处，悬空滴加50-100 l 溶液Eluent，室温放置2 min。 12,000 rpm离心1 min， 管底即为高纯度质粒DNA。质粒DNA 于-20保存 溶液 Eluent 可用无菌双蒸水代替，但其pH 需为8.0-8.5。溶液Eluent 的加入体积视质粒拷贝数多少、依质粒浓度要求而定。、重组载体质粒的浓度及纯度测定（紫外分光光度法）： 测OD260、OD280（先将DNA50倍稀释即2lDNA加入98l溶液Eluent 中，然后加入比色皿检测）质粒浓度=50OD260n （50为每OD260值代表50g/ml的双链DNA；OD260为260nm的吸光光度值；n为稀释倍数

10、）质粒纯度=OD260/OD280（比值在1.8-2.0比较纯）【此次提的质粒稀释50倍后OD260为0.121、OD280为0.123；所以浓度为302.5ng/ul；质粒纯度OD260/OD280为0.983，考虑蛋白参入太多】、重组载体质粒的鉴定：方法1：双酶切电泳(插入片段在2Kb以上时)；直接DNA电泳可判断整个重组载体质粒是否正确。方法2：PCR（插入片段在2Kb以下时）电泳方法3：送公司测序附：LB培养基将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨10g酵母提取物5g氯化钠10g再补足水至1L。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。氨苄青霉素（ampicil

11、lin）（100mg/ml）溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml，浓度为100mg/ml。分装成小份于-20贮存。常以25ug/ml50ug/ml（还是100g？）的终浓度添加于生长培养基。重组载体质粒转化细菌方法2：电转化、电感受态细胞的制备第一天： 1. 将适合的冻存菌（ DH5）挑取一点加入盛有1ml LB液体培养基的15ml离心管中；37，220rpm，摇菌培养1个小时（复苏）。2、取10l以下刚复苏的DH5涂布于非抗性的LB固体培养基上37过夜培养。3. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用 4. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中

12、以备第二天重悬浮细胞用 第二天： 5、挑取单个前一天培养的细菌菌落加入3ml LB液体培养基里37，220rpm，摇菌培养12个小时。6. 以1：100的比例取1ml菌液加入盛有100ml LB液体培养基的250ml摇瓶中37C，220rpm，振摇2-3小时，定时监控OD.600值（培养1小时后每半小时测定一次）7. 当O.D.600值达到0.3-0.4时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却15min至30min8.将100ml培养基转移至离心瓶中，4C 2500rpm下离心10min，弃上清液。9. 加入几毫升灭菌冰水用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞，然后加水至离心管的2/3体积稀释。 10. 400

13、0rpm离心10分钟（还是2500rpm 10min？），小心弃去上清液 11. 同步骤9用灭菌的冰水重悬浮细胞 12. 4000rpm离心10分钟，弃上清液 13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 4000rpm离心10分钟，小心弃去上清液（甘油稀释的细菌离心后沉淀更松散，需小心弃液） 15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按100l或200ul/管等份装入微量离心管，于-80C保存。 【可同时取100l感受态细菌加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。次日观察转化子生长情况】、细胞转化1、事先用无水乙醇清洗浸泡在无水乙醇中的电击杯，于超净台吹干，将载体质粒（名称？）、800ul无抗生素LB和0.1CM的电击杯一起置于冰上预冷。2. 在冰上解冻一管100l的电感受态细胞，添加1-10l载体质粒（体积？） ，冰上培育约5分钟。 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中，混匀后转入电击杯中.轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部.4. 加载P1000（移液器），准备好800l