PCR-SSCP的发展现状

1、PCR技术(十二)：PCR-SSCP的发展现状 随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现. 尤其是PCR技术问 世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进 一步推动了基因研究的发展如不对称PCR产物的直接测序、核糖核 酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage, RNAase)、限制性片段长度多态 性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)等等已成 为基因分析的有力工具但这些方法操作比较繁琐，局限性较大，或 要求实验条件 高，不适合一般临床实验室使用.1989年问世的PCR- SSCP下 文称SSCP作为

2、检测基因 突变的方法，经不断地改进和完 善，更为简便、快速、灵敏，不但用于检测基因点突变和短序列的 缺失和插入，而且还被用于DNA定量分析，监测PCR诊断实验中的 交叉污 染情况，以及传染源的调查等由于SSCP的突出的优点，近 几年被大量地应用. 一、SSCP的原理及特点 日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象， 这种立体结构主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持 的，当有一个碱基发生 改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使 构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰 胺凝 胶中受排阻大小不同因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)， 可以非

3、常敏锐地将构象上有差异的分子分离开作者称该方法为单 链构象多态性（Single-Strand Conformation Polymorphism, SSCP分 析.在随后的研究中，作者又 将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因 突变，从而建立了 PCR-SSCP技术，进一步提高了 检测突变方法的 简便性和灵敏性.其基本过程是：PCR扩增靶DNA;将特异的PCR 扩增 产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链 DNA分子;将适量的单 链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳； 最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果.若发现单 链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判

4、定该链构 象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变该方法简便、快速、 灵敏，不需要特 殊的仪器，适合临床实验的需要但它也有不足之处. 例如，只能作为一种突变检测方 法，要最后确定突变的位置和类型， 还需进一步测序；电泳条件要求较严格；另外，由于SSCP是依据点突 变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可 能会出现当某些位置的点突变对单链 DNA分子立体构象的改变不 起作用或作用很小 时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶 电泳无法分辨造成漏检尽管如此该方法和其他方法相比仍有较高 的检测率.首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱 基突变.Ta kao,经实验证明小

5、于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被 SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法 检测出来另外，SSCP方 法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移 率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步 提纯用这种方法可以 最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段. 二、SSCP的不断改进 SSCP技术自创立以来，经历了自身发展和完善的过程，刚建立 时是将同位素掺入PCR扩增物中，通过放射自显影来显示结果这给 该技术的推广造成一定的困难，随着DNA银染方法与PCR-SSCP结 合，尤其是直接溴乙锭染色方法的应用，使得该方法大大简化.最近， SSCP值得注意的改进是将 DNA-

6、SSCP分析，改为RNA-SSCP分析， 其基本原理是：RNA有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单 个碱基的突变很敏感，从而提高 了检出率，其突变检出率可达 90% 以上另外，RNA不易结合成双链，因此可以较大量 的进行电泳，有 利于用溴化乙锭染色但该方法增加了一个反转录过程；还需要一个较 长的引物，内含有启动RNA聚合酶的启动序列，从而相对地增加了 该方法的难度. 为了进一步提高SSCP的检出率，可将SSCP分析与其它突变检 测方法相结合其中与杂交双链分析(Heterocluplex analysis, Het)法 结合可以大大提高检出率.Het法是用 探针与要检测的单链DNA或R N

7、A进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互补的杂 交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开对同一靶序列分别进行 SSCP和Het分析可以使点突变的检出率接近100%，而且实验简便. 三、PCR-SSCP的实验操作 在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选 择如下: DNA片段长度（核苷酸数） 丙烯酰胺（%） 1Kb700b 3.5 700b 500b 5 500b 200b 8 200b 12 在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物（琼脂糖 电泳不能有过强的拖尾）. 1）制备聚丙烯酰胺凝胶（PAG） 按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，

8、当 胶液快到梳齿时，使 模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放 端模子以防止气泡形成，室温放置 1h使 之凝固然后拔掉梳子，顶 部加入1XTBE封闭，备用. 2）电泳 取10PCR产物，加入10山变性剂（95%甲酰胺，10mmol/LEDT A, 0.02%溴酚蓝）、30 gl石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2 min以上，然后将水相全部上样，10-15C下 电泳.开始在300V电压 下电泳5min,然后在120V电泳8h，取下凝胶，将其浸在含 0.5ug/ ml溴化锭的1XTBE缓冲液中染色30-45min，在紫外灯下观察，或 进行银染. 3）银染法 将PAG板用去离子水洗二次，浸

9、入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液 固定6min.用去离子水洗 二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min. 用去离子水洗3-5次，然后浸入1.5%NaOH和0.4%甲醛溶液中显色 7min.最后，用0.75%NaCO3终止显色. 四、SSCP的应用 自从Orita等用SSCP进行人类DNA多态性分析以来，该方法大 量地用于检测和肿瘤发生有关的基因突变，例如检测星形细胞瘤、 脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的p53基因的突变、肺癌 的ras基因突变等最近Suga no等用银染色SSCP法，成功地检测 了 c-Ki-ras2基因第12位的突变，电泳和银染色过程在 2.5小时内完成. SSC

10、P还用于检 测引起人类遗传性疾病的研究上，如在囊性纤维化中 起作用的CFTR基因、神经纤维瘤1型基因、家族性结肠息肉基因 的研究中.最近，Sharkar等用RNA-SSCP法检测了 28名B型血友病 患者的凝血因子IX的基因序列，并与DNA-SSCP和直接基因测序法 进行了比较，发现在全长2.6kbp的凝血因子IX基因组中，有20处 碱基点突变，RNA-SSCP可检测 出其中的70%，而DNA-SSCP只能 检测出35%，显示了 RNA-SSCP比DNA-SSCP有更高的灵敏 性. SSCP法除大量地用于基因突变的检测外，还用于病毒的分型、 监测PCR实验中的污染 情况、以及病原体传播途径的研

11、究中.Yap 用巢式PCR对来自不同国家和地区的HBV标品 进行了检测，并对 扩增产物进行了 SSCP分析，发现每个标本的SSCP图谱完全不同， 不 仅证明了 HBVDNA具有地区性变异，而且排除了交叉性污染的 可能性，为保证PCR诊断 结果的可靠性找到了好方法另外，Yap 等还将SSCP用于DNA定量分析上，他们将SSCP与竞争性PCR法 相结合进行乳腺癌细胞突变p53基因的定量分析，并取得了初步成功 该方法的优点在于，内标和待测 DNA只有一个碱基不同，这样使 内标和待测DNA有相同的扩增条件，从而更准确地测出DNA的量. 从以上可以看出，SSCP正在分子生物学领域 发挥着巨大的作用 五、

12、SSCP注意的事项 SSCP是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变的方法，为了使 SSCP达到最佳效果，应注意下列事项. 重复性 影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这 两个条件保持不变，SSCP图谱可保持良好的重复性一般SSCP图 谱是二条单链DNA带，但有时有的DNA片段 可能只呈现一条SSD NA带，或者三条以上，这主要是由于两条单链 DNA之间存在相似 的 立体构象.有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突 变型DNA片段共同存在的 结果. 靶DNA序列长度的影响在实验中发现 SSCP对短链DNA或R NA的点突变检出率要比长链 的高，这可能是由于长链 DNA和RN

13、 A分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小的缘故.而 有人认为在DNA链较短的（400bp以下）情况下，DNA的长度不会影 响SSCP的效果.他们仔细选择了实验条件，发现354bp的DNA中点 突变的检出率仍可达到90%以上. 电泳电压和温度的影响：为了使单链DNA保持一定的稳定立 体构象，SSCP应在较低温 度下进行（一般4C-15C之间）在电泳过程 中除环境温度外，电压过高也是引起温度升高的主要原因，因此， 在没有冷却装置的电泳槽上进行 SSCP时，开始的5min应用较 高的 电压（250V）,以后用100V左右电压进行电泳这主要是由于开始的高 电压可以使不同立体构象的单链DNA

14、初步分离，而凝胶的温度不 会升高随后的低电压电泳可以使 之进一步分离在实验中应根据具 体实验条件确定电泳电压. DNA片段中点突变的位置对SSCP的影响点突变在DNA和R NA中的位置对SSCP检测率的 影响，取决于该位置对维持立体构象 作用的大小，而不是仅仅取决于点突变在 DNA链 上的位置（有人认 为点突变在DNA链中部要比在近端部容易被 SSCP检测出来）.White 曾 设计了一组样品DNA片段，并将其中的点突变设在DNA链的中 部，而且该点又正处在发 夹结构顶端的环上，结果发现 SSCP只能 检测出9个样品中的2个（检出率为22%）,说明DNA链中任何部位 的突变，只要对其单链立体构

15、象没有影响，都有可能被漏检. SSCP的结果断定：由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是 根据单链DNA分子和带电量 的大小来分离的，而是以单链DNA片 段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因此，这种分离不能反 映出分子量的大小有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难看出 两者之间的差别因此一般要求电泳长度在16-18cm以上，以检测限 为指标来判定结果检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分 辨的电泳距离差的最小值.大于检 测限则判定链的迁移率有改变，说 明该DNA序列有变化，小于检测限则说明链之间无变化例如，一 般检测限定为3mm，那么当两带间距离在3mm以上，则说明两链之 间有 改

16、变另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假 阳性结果另外，SSCP分析中其它条件，如PCR产物的上样量，PA G的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具体实验进行选择确定总 之，SSCP分析法是一种快速、简便、灵敏的突变检测方法，适合临 床实验室的要求.它可以检测各种点突变，短核苷酸序列的缺失或插 入随着SSCP分析不断完善，它将成为基因诊断研究的一个有力工 具 /、 下面的一条带为双链，上面的两条链为单链。 sscp主要是由于snp引起的单链构象的差异，所以在这类胶中用常规的 marker不是很准确。从图中看出，你的不同样品之间似 乎没有多态，但是条带不是太清晰，不敢断定。我们做 sscp时一般用30%丙稀酰胺（29 : 1 ）,胶浓度12%18%不等，很少浓度低到 8%的，而且用的是硝酸银染色，比 EB染色清楚多了，其他条件差不多。另外，在没有多态的情况下，胶中加点甘油，可能就发现多态了 那是心与心的交汇是相视的莞 尔一笑，是一杯饮了半盏的酒，沉香在喉，甜润在心。 红尘中，我们会相遇一些人，一些事，跌跌撞撞里，逐渐懂得了这世界，懂得如何经营自己的内心，使它柔韧，更适应这风雨征途，而不会在过往的错失里纠结懊悔一生。 时光若水，趟过岁月的河，那些旧曰情怀，或温暖或痛楚，总会在心中烙下深深浅浅的痕。生命是一座时光驿站，人们在那