分子诊断学：第十一章 遗传性疾病的临床分子诊断

1、第十一章第十一章 遗传性疾病的临床分子诊断遗传性疾病的临床分子诊断 什么是遗传病（genetic disorders） n典型的遗传病指由于遗传（inheritance）了 特殊的突变型基因而致病的一类疾病。 n指完全或部分由遗传物质即DNA改变引起的 疾病。 n几乎所有的疾病都受遗传物质的影响，这些 致病基因有的直接来自父母，有的来自后天 的随机突变或者环境致变； 遗传病的分类 n单基因遗传病（monogenetic disorders）， 又称孟德尔遗传病，如镰状细胞病，多囊 性肾病； n多因子遗传病（multifactorial inheritance disorders）如糖尿病，肿瘤

2、，精神病； n染色体病（chromosome disorders）如21 三体 n线粒体遗传病（mitochondrial disorders）， 母系遗传 遗传病分子诊断的主要内容及意义 n分析患者的核酸（DNA或RNA）、蛋白质、染 色体和某些代谢产物来揭示与该遗传病发生相 关的致病基因、基因型、基因突变、染色体核 型等； n对已知致病基因结构与功能分析，对未知致病 基因的定位。 n有利于对遗传病进行早预防、早诊断和早治疗， 从而达到减少或控制某些遗传病的发病、减轻 症状和改善预后的目的； 遗传病的分子诊断策略 n直接诊断策略 (direct diagnosis) 直接揭示导致遗传病发生的

3、各种遗传缺陷，包括DNA中碱基的 点突变、缺失、插入、倒位、重复或重排等结构变化，或者由 于结构变化与转录异常导致的基因表达量的改变等。 n间接诊断策略 (indirect diagnosis) 通过对遗传标记的多态性判断染色体单倍型是否与致病基因连锁，从 而判断被检者患病的风险以及是否为致病基因携带者。 n直 接 诊 n断 突变的DNA在向子代传递 的过程中进一步发生改变， 主要以重复序列拷贝数的 增加为主。 静态突变 (stationary mutation) 动态突变 (dynamic mutation) 突变的DNA分子能够 稳定地遗传，使子代 保持突变DNA的稳定性 点突变 缺失 位

4、点确定：PCR-ASO/ASP-PCR/PCR- RFLP/gene chip/PCR-ELISA 位点不明：PCR-SSCP/DGGE/DNA Sequencing/ 小片段的变化可借鉴点突变检测方法 大片段异常：Southern blot/多重-PCR 根据DNA异常情况可直接检测 利用PCR/Southernblot检测DNA, RT-PCR/Northern blot检测mRNA, ELISA/Western blot/IH/p-Chip检测蛋白 n间 接 诊 断 连锁分析 linkage analysis 关联分析 relation analysis 通过覆盖密度适当的遗传标记在患病

5、家系中进行 连锁分析，以此找到与某一遗传标记紧密连锁的 致病基因座位，从而确定该基因在染色体上的粗 略位置。 在可能的候选致病基因附近选择遗传标记，并在 患者和正常个体间比较，从而得到该遗传标记与 致病基因关联的相对危险度。 第一节 单基因遗传病的分子诊断 n单基因遗传病：一对等位基因控制，符 合孟德尔遗传规律，从亲代向子代垂直 传递的疾病。 n目前已发现有6500种，其中超过1000种 可以进行基因分子诊断； nOMIM: Online Mendelian lnheritance in Man 单 基 因 遗 传 病 常染色体遗传 X连锁遗传 Y连锁遗传 常染色体显性遗传 常染色体隐性遗传

6、X连锁隐性遗传 X连锁显性遗传 n一、家系分析 一、家系分析中的注意事项 n1、无家族史的先证者不一定就是隐形遗 传病患者，有可能来自自发突变； n2、外显不全影响家系分析结果； n3、遗传异质性导致不同种类的遗传病被 认为是同一种遗传病； n4、选用的遗传标志不同，有可能得出不 同的遗传方式的结论。 二、候选基因筛查 n1、功能克隆（functional cloning） n2、定位克隆（positional cloning） n3、候选基因克隆（candidate gene cloning） 1、功能克隆（functional cloning） n利用疾病的已知遗传突变引起的某一生化功能改

7、变来 定位基因，进而将其克隆； n从表型异常出发，找出导致出现异常表型的异常功能 蛋白质，根据蛋白质的氨基酸序列推导出编码的核苷 酸序列，以此作为探针，在基因组文库或cDNA文库中 去筛选目的基因或目的cDNA，最后克隆和定位这种异 常蛋白质的编码基因。 2、定位克隆（positional cloning） n特点：用疾病表型代替致病基因来观察疾病与遗传标记之间的连锁分离 关系，无需预先知道基因的DNA 顺序和其表达产物的有关信息； n过程 n1、首先通过家系连锁分析将目标基因基因定位在染色体的特定位置； 找到与目标基因紧密连锁的遗传标记； n2、构建含有大插入片段的基因组文库(BAC 库或Y

8、AC) ； n3、以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库； n4、用获得的阳性克隆构建含目的基因区域的跨叠群(contig)； n5、通过染色体步移等技术获得含有目标基因的大片段克隆； n6、通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆； n7、通过遗传转化和功能互补验证，最终确定目标基因的碱基序列。 三、地中海贫血 n血红蛋白病 （hemoglobinopathy）： n常见的遗传性溶血性疾 病，由于编码血红蛋白 的基因异常而发生的一 类遗传性贫血。 n由4条肽链（珠蛋白） 和4分子的血红素分子 （卟啉亚铁离子 ） 血红蛋白病的分类 n1.异常血红蛋白病：由于珠蛋白结构异 常所致，如镰状细

9、胞贫血、不稳定血红 蛋白病、氧亲和力异常血红蛋白病、血 红蛋白M病； n2.珠蛋白生成障碍性贫血（地中海贫 血）：由于珠蛋白多肽链的合成速率不 平衡引起，分为/型。 珠蛋白基因簇结构模式图 1 31（117bp）32 99（140bp）100 141 1 30（117bp） 31 104 （850bp） 105 146 珠蛋白基因结构珠蛋白基因结构 珠蛋白基因结构珠蛋白基因结构 珠蛋白基因表达珠蛋白基因表达 E1 E2 E3 5 -3 Transcription Processing 5-Cap- -polyAAAAA mRNA Translation 异常血红蛋白病镰状细胞病 （sickle

10、mia） n第一个被揭示的“分子 病”； n属于常染色体隐性遗传病 （AR）; n珠蛋白基因的第6位密码 子突变，由GAGGTG,导 致珠蛋白第6位氨基酸残 基由Glu Val 镰状细胞病的分子生物学检验 n常用方法：限制性片段长度多态性 （RFLP）、等位基因特异性寡核苷酸 （ASO ）探针杂交、等位基因特异性引 物PCR (ASP-PCR) nRFLP: 设计特异性引物（包括珠蛋白基 因的第5、6、7位密码子） PCR 经 Mst酶切电泳分析/Southern杂交 RFLP n限制性内切酶Mst 的识别序列是 n CCT NAG G, 正常： CCT GAG GAG 编码 Pro Glu

11、Glu 镰状： CCT GTG GAG 编码 Pro Val Glu 注意：注意：酶切要彻底，防止将正常型误认为携带者，设置正常/ 携带者对照 PCR-RDB交 n1.分别设计正常探针和 突变探针； n2. PCR扩增含突变点区 域的序列； n3.将PCR产物点在杂技膜 上并经变性处理； n4.分别用探针与变性的 PCR产物杂交； n5.显影后观察判断结果； 珠蛋白生成障碍性贫血（地中 海贫血）的检测 n珠蛋白基因缺失/突变导致某种珠蛋白链 合成障碍造成链和链合成数量不平衡， 引起的溶血性贫血称为地中海贫血。 地中海贫血由于珠蛋白基因的缺失或突变使链 的合成受到抑制而引起的溶血性贫血，多由缺失

12、引起。 地中海贫血由于珠蛋白基因的缺失或突变使链 的合成受到抑制而引起的溶血性贫血，多由突变引起。 地中海贫血的分类 n地中海贫血主要由基因缺失引起，目前全球已鉴定的缺失 超过20种，我国常见的类型是（-SEA/）、（-3.7/）、（- 4.2/）； n目前发现的珠蛋白基因突变至少有68种，其中46种位于 2基因，17种位于1基因，5种位于2和1基因之外， 我国目前报道的有12种，主要以（ws/） 、 （cs/） 、 （qs/）三种为主； n突变多数发生在一个基因上，故一般定义为+-地中海贫血 ，记为（ T /）或（ T / ） 地中海贫血的分类 珠蛋白生成障碍的分子机制 n基因缺失型：不等位

13、交换引起；主要原因 珠蛋白生成障碍的分子机制 n基因非缺失（突变）型： n错义突变 是由于单个核苷酸的改变导致由特定三联体密码子编码的氨基酸的改变，导致蛋 白链不稳定；如Hb QS 突变 n移码突变 在正常密码子中插入或缺失一个或几个碱基,导致该位点后面编码的氨基酸种类顺 序改变，如 CD49（-GC） n无义突变 原密码子终止密码肽链合成提前终止 nmRNA加工突变 转录的mRNA无法正常剪接或添加polyA尾信号，如IVS-I-117（GA） n终止密码子突变 终止密码编码氨基酸的密码，导致肽链异常延长，如Hb CS突变。 分子生物学检测 n1. gap-PCR：裂口/跨越断点PCR 分别

14、设计针对缺失区域和正常区域序列的引物 （针对缺失型）； n2. PCR-RDB n3. Southern杂交：不同类型的内切酶切后，用 珠蛋白特异性探针杂交后，根据片段长度大 小判断结构； n4. ASP-PCR：分别设计正常引物和突变引物； n5. SSCP:单链构象多态性 n6. DNA sequencing 缺失型-地贫的基因检测 突变型-地贫的基因检测 地中海贫血的分类 n地中海贫血绝大多数是由于珠蛋白基因不 同类型的点突变所致。这些点突变分别导致 转录受阻，mRNA前体剪接加工错误，翻译无 效，或合成不稳定的珠蛋白链而阻碍-二聚 体形成，使珠蛋白链不平衡等。 地中海贫血的分类 n目前

15、全世界已发现珠蛋白基因突变类型200多种， 我国已报道48种，其中17种突变约占我国南方地中 海贫血人群的99%； nCD41-42(-CTTT)、IVS-654(CT) 、-28(AG)、 CD71-72 (+A)、CD17 (AAGTAG)、CD26 (GAGAAG)、CD31(-C)、CD27/28(+C)、IVS-1 (GT)、CD43 (GAGTAG)、-32 (CA)、-29(AG) 、-30 (TC)、CD14-15 (+G)、Cap+40-43(-AAAC) 、Int (ATGAGG)、 IVS-5 (GC) 分子生物学检验 n1.PCR-RDB(PCR-reverse dot

16、 blot); n2.PCR-ASO(PCR-allele specific oligonucleotide) n3.AS(allele specific)-PCR:多对引物多重 PCR n4.基因芯片 n5.突变寡核苷酸延伸扩增（MOEA） n6. DNA sequencing 突变型-地贫的基因检测 3.血友病的分子生物学检验 n血友病：由于凝血因子缺陷所致的凝血 机制异常而引起的遗传性出血性疾病。 n主要分为A、B两型，均为X连锁隐性遗传 n血友病A又称血友病甲、因子缺乏症， 主要是由于血浆中缺乏F引起； n血友病B又称血友病乙、凝血因子缺乏 症，主要是由于缺乏凝血第9因子； 血友病A（

17、HA） nF位于X染色体长臂末端，包括26个外显子和 25个内含子，全长186kb，其中外显子总长9kb。 n遗传缺陷由基因缺失和突变组成； n基因缺失主要由第22号内含子倒位引起，约占 HA的50，引起重型血友病 n目前已检测到的突变有近600种，其中点突变 占64（无义突变引起重型HA,错义突变引起 中性和轻型），缺失突变占31（重型），插 入突变占5（重型）； n人F基因结构及基因倒位 HA的分子检测 n1.直接诊断策略 n长距离PCR(LD-PCR)：针对缺失型 n分别涉及针对内含子22中A1基因和其同 源基因A2/A3的引物对，进行PCR扩增并 根据扩增带型鉴定。 n2.间接诊断策略

18、 n突变型中点突变占大多数(64),且突变位点分 散,无高频突变位点，利用F基因与特定的多 态性遗传标记紧密连锁的特点，通过连锁分析 来诊断家系成员或开展产前诊断。 nPCR-RFLP nPCR-STR nPCR-VNTR nPCR-SSCP 血友病B（HB） nF基因位于X染色体长臂2627区，全长 33.5kb，含8个外显子，内含子占整个基因的 95，编码461个氨基酸残基肽链； n基因突变种类繁多，目前已发现约有700多种， 包括点突变、碱基缺失和插入，突变涉及整个 基因的每个位置，其中点突变占80左右，但 是大片段的缺失和基因重排较为少见； HB的分子检测 n直接诊断： n包括southern杂交、DNA测序、基因芯片、 毛细管电泳、 n间接诊断： n包括RFLP（XmnI、EcoRI、TaqI）、 V