miR-203a和miR-203b基因在食管鳞状细胞癌中的表达及其甲基化状态分析-硕士毕业大论文终结版

1、No. 河 北 医 科 大 学 硕士研究生毕业论文 miR-203a 和和 miR-203b 基因在食管鳞状细胞癌中的基因在食管鳞状细胞癌中的 表达及其甲基化状态分析表达及其甲基化状态分析 研 究 生梁梁 佳佳 导师郭郭 炜炜 教教 授授 董稚明董稚明 教教 授授 专业病理学与病理生理学 二级学院河北医科大学第四医院 研究起止日期2013 年 9 月-2015 年 3 月 交稿日期2015 年 3 月 目目 录录 中文摘要1 英文摘要5 英文缩写9 研究论文 miR-203a 和 miR-203b 基因在食管鳞状细胞癌中的表达及其甲基 化状态分析 前言10 材料与方法12 结果22 附图24

2、附表28 讨论35 结论39 参考文献40 综述 miR-203a 在肿瘤中的研究进展43 致谢55 个人简历56 miR-203amiR-203a 和和 miR-203bmiR-203b 基因在食管鳞状细胞癌中的表达及其甲基基因在食管鳞状细胞癌中的表达及其甲基 化状态分析化状态分析 摘摘 要要 目的目的：食管癌是发生在食管粘膜上皮的恶性肿瘤，根据食管癌的组织 学特点可分为五种类型，其中食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）在食管癌中所占比例最多，大约占 90%，食管腺癌 （esophageal adenocarcinoma, EA）

3、次之，占 7%左右，其他几种类型均少见。 我国是世界上食管癌发生率和病死率均较高的国家之一，同时食管癌预后 特别差，晚期患者生存率极低。然而到目前为止，食管癌的发病机制尚不 清楚。 近年来对食管癌的发病机制已进行广泛研究，其中对表观遗传学的改 变特别是 miRNAs 启动子区高甲基化已成为研究的热点，本研究通过检测 miR-203a 和 miR-203b 基因在食管癌细胞和食管鳞癌组织中的表达及其甲 基化状态，探讨 miR-203a 和 miR-203b 基因甲基化与食管癌发生、发展的 关系，从而为食管癌发病的分子机制、治疗方案及其评估预后等方面提供 新的理论依据。 方法方法： 1 应用实时定

4、量 RT-PCR（Quantitative real-time RT-PCR, qRT-PCR） 方法检测应用 DNA 甲基化转移酶抑制剂 5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-aza-2- deoxycitydine, 5-aza-dC）处理前后的食管癌细胞系（TE1、TE13、YES- 2、Ec109 和 T.TN）和 54 例食管鳞癌组织及其相应的癌旁组织中 miR-203a 和 miR-203b 基因的表达。 2 应用甲基化特异性 PCR（methylation specific polymerase chain reaction, MSP）方法检测应用 5-aza-dC 处理前后的食管癌细胞系

5、和 83 例食 管鳞癌组织及其相应的癌旁组织中 miR-203a 和 miR-203b 基因的甲基化状 态。 3 运用统计软件 SPSS19.0 对数据进行统计学分析。 结果结果： 1 miR-203a 基因在食管癌中的表达及甲基化 1.1 食管癌细胞系中 miR-203a 基因的表达及甲基化状态 未经 5-aza-dC 处理，五种食管癌细胞中 miR-203a 基因的表达均相对较 低，且呈高甲基化状态；5-aza-dC 处理后，miR-203a 基因的表达均显著升 高（均 P0.05），YES-2 细胞中 miR-203 基因甲基化程度显著降低，其余 4 种食管癌细胞系中 miR-203a

6、基因为非甲基化状态。 1.2 食管癌组织中 miR-203a 基因的表达 miR-203a 基因在食管癌和其相应的癌旁组织的表达量分别为 0.2530.099 和 0.4810.189，食管癌组织 miR-203a 基因的表达量明显低于 其相应的癌旁组织，两者的差异有统计学意义（t=-14.137，P=0.000）。在 食管鳞癌患者中, miR-203a 的表达与肿瘤组织的肿瘤分期和分化程度有关 （P0.05）。 1.3 食管癌组织中 miR-203a 基因甲基化状态的研究 miR-203a 基因启动子区在食管鳞癌组织和其相应的癌旁组织的甲基化 率分别 62.7%（52/83）和 7.2%（6

7、/83）。食管鳞癌组织中 miR-203a 基因启 动子区甲基化发生率明显高于其相应的癌旁组织（2=3.918，P=0.048）。 miR-203a 基因在低分化鳞癌组中甲基化发生率 75.0%（33/44）明显高于中 高分化鳞癌组甲基化发生率 48.7%（19/39）（2=6.103，P=0.013）；期 和期 miR-203a 基因启动子区的甲基化发生率 94.1%（16/17）明显高于 期和期 54.5%（36/66）（2=9.047，P=0.003）；miR-203a 基因启动子区 甲基化发生率与患者的年龄、性别和淋巴结转移无关（P0.05）。 1.4 食管癌组织中 miR-203a

8、基因的表达、甲基化状态及其与临床病理资料 之间的关系 在 miR-203a 基因启动子区发生甲基化的食管鳞癌组织中，其平均相对 表达量为 0.2320.818，未发生甲基化的食管鳞癌组织中平均相对表达量为 0.3130.120，两者差异有统计学意义（P=0.006）。 2 miR-203b 基因在食管癌中的表达及甲基化 2.1 食管癌细胞系中 miR-203b 基因的表达及甲基化状态 未经 5-aza-dC 处理的 5 种食管癌细胞系中 miR-203b 基因的表达均相对 较低，同时表现为高甲基化状态；而应用 5-aza-dC 处理后，miR-203b 在 YES-2 和 T.TN 细胞中的甲

9、基化程度降低，非甲基化程度增加，其余 3 种食 管癌细胞系中 miR-203b 基因均表现为非甲基化状态。 2.2 食管癌组织中 miR-203b 基因的表达 miR-203b 基因在食管癌和其相应的癌旁组织的表达量分别为 0.0260.021 和 0.0490.041，食管癌组织 miR-203b 基因的表达明显低于其 相应的癌旁组织，两者的差异有统计学意义（t=7.810，P=0.000）。在食管 鳞癌患者中，miR-203b 的表达与肿瘤组织的分化程度有关（P0.05）。 2.3 食管癌组织中 miR-203b 基因甲基化状态的研究 miR-203b 基因启动子区在食管鳞癌组织和其相应的

10、癌旁组织中的甲基 化率分别 57.8%（48/83）和 12.0%（10/83）。食管鳞癌组织中 miR-203b 基 因启动子区甲基化发生率明显高于其相应的癌旁组织 （2=6.673，P=0.010）。miR-203b 基因在低分化鳞癌组甲基化发生率 68.2%（30/44 明显高于中高分化鳞癌组甲基化发生率 46.2%（18/39） （2=4.114，P=0.043）；miR-203b 基因启动子区甲基化发生率与年龄、性 别、淋巴结转移和肿瘤组织分期无关（P0.05）。 2.4 食管癌组织中 miR-203b 基因的表达、甲基化状态及其与临床病理资料 之间的关系 在 miR-203b 基因

11、启动子区发生甲基化的食管鳞癌组织中，其平均相对 表达量是 0.0170.013，未发生甲基化的食管鳞癌组织中平均相对表达量是 0.0360.025，两者差异有统计学意义（P=0.001）。 结论结论： 1 miR-203a 和 miR-203b 在食管癌细胞系中表达较低，且呈现为高甲基 化状态，5-aza-dC 能逆转 miR-203a 和 miR-203b 基因的甲基化，使 miR- 203a 和 miR-203b 恢复表达，提示 miR-203a 和 miR-203b 基因启动子区异 常甲基化有可能是导致它们在食管癌细胞中表达缺失的重要机制之一。 2 miR-203a 和 miR-203b

12、 基因在食管鳞癌组织中的表达明显低于其相应 的癌旁组织，提示 miR-203a 和 miR-203b 基因在食管鳞癌中可能主要起抑 癌基因的作用。 3 食管鳞癌组织中 miR-203a 和 miR-203b 基因启动子区甲基化情况明 显高于其相应的癌旁组织，提示 miR-203a 和 miR-203b 基因甲基化可能是 食管鳞癌发生的机制之一。 4 miR-203a 和 miR-203b 启动子区甲基化情况与患者年龄，性别等因素 无关，与分化程度等生物学行为有关，提示 miR-203a 和 miR-203b 基因启 动子区甲基化与食管鳞癌的预后可能有关。 关键词关键词：食管鳞癌，甲基化，表达，

13、miR-203a，miR-203b The expression and methylation status of miR-203a gene and miR-203b gene in esophageal squamous cell carcinoma ABSTRACT Objective: Esophageal cancer is occurred in esophageal mucosa epithelial malignant tumors, According to the histological features of esophageal cancer can be divi

14、ded into five types, of which the most common esophageal squamous cell carcinoma, accounting for about 90 percent, followed by esophageal adenocarcinoma, accounting for about 7 percent, other types are rare. China is a country with high incidence and mortality regions of esophageal cancer, and the a

15、verage annual incidence and mortality were 20.14/10 ten thousand and 16.7/10 ten thousand. The prognosis of esophageal cancers is poor, The 5-year survival rate is about 10% in middle or advanced stages patients. So far, the pathogenesis of esophageal cancer is still unclear. In the etiology of esop

16、hageal cancer, epigenetic changes, especially aberrant DNA methylation of the promoter region is the current research focus. In this study, the expression and methylation status of miR-203a and miR-203b were detected in esophageal cancer cell lines and esophageal squamous cell carcinoma to explore t

17、he relationship between gene methylation and development and occurrence of ESCC. Thus we provide a new theory and experimental evidence for pathogenesy, therapeutic schedule and clinical prognosis of ESCC. Methods: 1 Quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCP) method was used to detect the expression mi

18、R-203a and miR-203b gene in esophageal cancer cell lines (TE1, TE13, Yes-2, Ec109, T.TN) and the cell lines treated with 5-aza-dC, 54 ESCC tumor tissues and corresponding normal tissues. 2 Methylation specific PCR (MSP)method was used to examine the methylation status of miR-203a and miR-203b gene i

19、n esophageal cancer cell lines and the cell lines treated with 5-aza-dC, 83 ESCC tumor tissues and corresponding normal tissues. 3 SPSS19.0 was applied to analyze the results of experiments. Results: 1 The expression and methylation of miR-203a gene in ESCC 1.1 The expression and methylation status

20、of miR-203a in esophageal cancer cell lines Relative low expression and hypermethylation of miR-203a was detected in the five esophageal cancer cell lines untreated with 5-aza-dC. After treatment with 5-aza-dC, the expression of miR-203a was enhanced, the methylation level of miR-203a in YES-2 cell

21、line was decreased, and complete unmethylation of miR-203a was detected in TE1, TE13, EC109, and T.TN cell lines. 1.2 The expression of miR-203a in ESCC The expression of miR-203a in tumor tissues (0.2530.099) was significantly lower than that in corresponding normal tissues (0.4810.189) (P0.05). 1.

22、3 The methylation status of miR-203a in ESCC The promoter methylation frequency of in tumor specimens 62.7%（52/83）was significantly higher than that in corresponding normal tissues 7.2%（6/83）(2=3.918, P=0.048). Methylation frequencies of miR-203a gene in poor differentiation group 75.0%（33/44）was mu

23、ch higher than that in moderate and high differentiation group 48.7%（19/39）(2=6.103，P=0.013). Methylation frequencies of miR-203a in stage and stage 94.1%（16/17） was significantly higher than that in stage and stage 54.5%（36/66） (2=9.047，P=0.003). Methylation status of miR-203a gene was not associat

24、ed with lymph node metastasis, age, and gender (P0.05). 1.4 Relationship between methylation status of miR-203a and its expression The expression of miR-203a in tumor tissues with promoter methylation of the gene (0.2320.818) was significantly lower than that in tumor tissues with unmethylation of t

25、he gene (0.3130.120) (P=0.006). 2The expression and methylation of miR-203b gene in ESCC 2.1The expression and methylation status of miR-203b in esophageal cancer cell lines Relatively low expression and hypermethylation of miR-203b was detected in the five esophageal cancer cell lines untreated wit

26、h 5-aza-dC. After treatment with 5-aza-dC, the expression of miR-203b was enhanced, and the methylation status of miR-203b was reversed in esophageal cancer cell lines. Complete unmethylation of miR-203b was detected in TE1, TE13, and EC109 cell lines. 2.2 The expression of miR-203b in ESCC Th expre

27、ssion of miR-203b in tumor tissues (0.0260.021) was significantly lower than that in corresponding normal tissues (0.0490.041) (t=7.810 P=0.000). The expression of miR-203b was correlated with status of differentiation of ESCC patients (P 0.05). 2.3 The methylation status of miR-203b in ESCC The pro

28、moter methylation frequency of in tumor specimens 57.8%（48/83）was significantly higher than that in corresponding normal tissues 12.0%（10/83） (2=6.673，P=0.010). Methylation frequencies of miR- 203b gene in poor differentiation group 68.2%（30/44）was much higher than that in moderate and high differen

29、tiation group 46.2%（18/39） (2=4.114，P=0.043). Methylation status of miR-203b gene was not associated with age, gender, lymph node metastasis and TNM stage (P0.05). 2.4 Relationship between methylation status of miR-203b and its expression The expression of miR-203b in tumor tissues with promoter met

30、hylation of the gene (0.0170.013) was significantly lower than that in tumor tissues with unmethylation of the gene (0.0360.025) (P=0.001). Conclusions: 1 The relatively low expression and the hypermethylation of miR-203a and miR-203b gene were detected in the esophageal cancer cell lines. 5-aza-dC

31、can reverse the methylation status of miR-203a and miR-203b and restore its expression in esophageal cancer cell lines, indicating that promoter exception hypermethylation of miR-203a and miR-203b gene may be an important mechanism for its inactivation in ESCC. 2 The expression of miR-203a and miR-2

32、03b in ESCC tissues was significantly lower than that in the corresponding normal tissues, indicating that miR-203a and miR-203b gene may play a major tumor suppressor gene of the role in ESCC. 3 The promoter methylation frequency of miR-203a and miR-203b in tumor specimens was significantly higher

33、than that in corresponding normal tissues, indicating that promoter methylation of miR-203a and miR-203b may be associated with the occurrence of ESCC. 4 The methylation status of miR-203a and miR-203b promoter was not correlated with age, gender of patients. However, it was significantly related to

34、 differentiations, indicating that promoter methylation of miR-203a and miR-203b may be associated with tumor prognosis. Key words: Esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）, expression, methylation, miR-203a, miR-203b 英文缩写英文缩写 ESCCesophageal squamous cell carcinoma 食管鳞癌 EAesophageal adenocarcinoma食管

35、腺癌 qRT-PCRQuantitative real-time RT-PCR 实时定量 RT-PCR MSPmethylation specific polymerase chain reaction, 甲基化特异性 PCR 5-aza-dC5-aza-2-deoxycitydine 5-氮杂-2-脱氧胞苷 miRNAsmicroRNAs微小 RNA PI3K/Aktphosphatidylinositol-3-kinases/ protein-serine-threonine kinase 磷脂酰肌醇-3-激酶/ 蛋白质丝氨酸苏氨酸 激酶 miR-203a 和和 miR-203b 基因在食

36、管鳞状细胞癌中的表达及其甲基基因在食管鳞状细胞癌中的表达及其甲基 化状态分析化状态分析 前前 言言 食管癌是发生在食管粘膜上皮的恶性肿瘤，超过 90%的食管癌主要是 食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）和食管腺癌 （esophageal adenocarcinoma，EA） ，在亚洲主要是 ESCC1。我国亦是世界 上食管癌发生率和病死率较高的国家之一，年平均发病率和病死率分别为 20.14/10 万和 16.7/10 万2。然而食管癌的发生机制至今尚未明确。目前认 为，恶性肿瘤的发生主要有两种机制：分别是遗传学机制和表观遗传学机

37、制。这两种机制起着不同的作用，遗传学机制是指 DNA 序列和染色体水平 的结构和数目的改变，其中包括各类基因突变、基因缺失和基因过度扩增 等，以及染色体缺失、染色体重复、染色体易位和染色体非整倍体等改变， 表观遗传学是指 DNA 序列不变的前提下，全基因组的基因表达调控所决定 的表观遗传3。表观遗传在调节基因表达起着重要的作用，调控的丧失可显 著促进癌症的发生，发展和进展。近年来随着对肿瘤研究的不断深入，认 为表观遗传学机制对基因的表达调控比遗传学机制更为多见4。同时研究显 示，表观遗传学改变特别是 DNA 甲基化已经成为研究的热点。 miRNAs是一类大约含1825个核苷酸的非编码、内源性小

38、分子单链 RNA，广泛存在于动植物中5。已有研究证实，miRNAs可以作为癌基因或 抑癌基因，调控肿瘤增殖、侵袭和转移，维持血管生成和抑制细胞凋亡， 并且发现miRNAs启动子区CpG岛高甲基化是肿瘤中miRNAs表达沉默的机 制之一6-8。 miR-203a和miR-203b基因均定位于人染色体 14q32，具有高度同源性， 这个区域也是染色体上的不稳定区域，约12%已发现的miRNAs基因位于此 区域。miR-203a和miR-203b基因是由不同启动子转录的，miR-203a转录方 向是从基因组DNA主链即正义链5端起始，则其启动子区可能位于基因组 DNA主链即正义链5端前的碱基中，mi

39、R-203b转录方向是从基因组DNA从 链即反义链5端起始，则其启动子区可能位于基因组DNA从链即反义链5 端起始前的碱基中。当前对miR-203a的研究较多，如Feber9等通过miRNAs 芯片分析发现，miR-203a在食管癌组织中表达下调2倍以上；Furuta等10进 一步发现，在肝细胞癌中，由于miR-203a基因启动子区高甲基化导致miR- 203a基因沉默。但miR-203a基因在食管鳞癌中的表达及甲基化状态研究较 少，miR-203b基因在食管鳞癌中的表达及甲基化状态的研究在国内外尚未 见报道。 本研究采用实时定量 RT-PCR（Quantitative real-time R

40、T-PCR, qRT- PCP）方法和甲基化特异性 PCR（methylation specific polymerase chain reaction, MSP）方法检测食管癌细胞系及食管鳞癌和癌旁正常组织中 miR- 203a 和 miR-203b 基因的表达水平和启动子区甲基化状态并结合临床资料分 析其与临床病理资料之间的关系，探讨 miR-203a 和 miR-203b 甲基化与食 管鳞癌发生的关系，为确定 miR-203a 和 miR-203b 基因在食管鳞癌发生及 发展中的作用提供实验依据。 材料与方法材料与方法 1 研究对象 1.1 食管癌细胞系 人食管癌细胞系TE1、TE13、

41、YES-2、Eca109、T.TN由河北医科大学 第四医院肿瘤研究所病理室保存。 1.2 组织标本 研究对象取自河北医科大学第四医院2008-2011年间收治的ESCC手术 患者，共83例。其中男性61例，女性22例，年龄3774岁，中位年龄60岁。 每例患者均取ESCC原发灶及癌旁组织，全部病人术前均没有进行放、化疗。 手术切除标本一部分放入液氮保存，用以提取DNA和RNA，一部分标本用 4中性甲醛溶液固定，常规制作蜡块保存。依据有无淋巴结转移分组：淋 巴结转移组35例，无淋巴结转移组48例；按照国际抗癌联盟（UICC）标准 进行TNM分期：83例肿瘤患者中期3例、期63例、期16例、期1例

42、。 按照WHO肿瘤的病理学分级：83例肿瘤患者中高分化19例、中等分化20例、 低分化44例。在全部83例 ESCC 组织及其相应癌旁组织中检测了miR-203a 和miR-203b基因甲基化状态，但仅在54例ESCC 组织及其相应癌旁组织中 检测了miR-203a和miR-203b表达水平。在这54例患者中，男性40例，女性 14例，年龄3774岁，中位年龄61岁；按照 WHO 的肿瘤病理学分级：54 例患者中高分化16例，中等分化6例，低分化32例；按淋巴结转移情况分组： 有淋巴结转移组27例，无淋巴结转移组27例；按照UICC标准进行TNM分期： 期2例，期43例，期8例，期1例（Tab

43、le 3）本研究经河北医科大学 第四医院医学伦理委员会审查后批准，并获得全部患者的知情同意。 2 主要仪器及试剂 2.1 主要实验仪器 仪器名称型号生产厂家 数显电热保温箱303-4A上海阳光实验仪器有限公司 实时定量PCR扩增仪德国 eppendorf 公司 Qcapture图像采集系统加拿大QIMAGING公司 离心机LXJ-64-01北京医疗仪器修理厂 台式离心机PQ-1600A上海培清科技有限公司 恒温磁力搅拌器HJ-3江苏金坛医疗仪器厂 微型混合器H-1上海彭氏实业有限公司 电子天平PB3002-SMETTLER 公司 PCR扩增仪Mastercycler5333德国 eppendo

44、rf 公司 稳压稳流电泳仪DYY-2北京市六一仪器厂 电泳槽DYY-31D北京市六一仪器厂 医用微波炉ZD-b上海中达医学应用研究 紫外分光光度计北京市新技术应用研究所 Eppendorf Research移液器德国eppendorf公司 凝胶成像系统FOTODYNE美国Image公司 超净工作台XD-10-1北京市西城半导体设备一厂 制冰机SIM-F124日本三洋集团 台式低温超速离心机JY-16-6德国 低温冰箱日本三洋集团 电热恒温水浴箱DK-98-天津市泰斯特仪器有限公司 5%CO2培养箱日本三洋集团 生物安全柜BSC-1500A济南鑫贝西 2.2 主要试剂 试剂名称生产厂商 qRT-

45、PCR主要试剂 TRIzol美国SBS公司 总RNA提取试剂美国Promega公司 逆转录 PCR 试剂盒美国Promega公司 qRT-PCR 体系试剂盒美国Promega公司 氯仿、异丙醇上海化学试剂总厂 DEPC美国invitrogen公司 MSP主要试剂 Wizard DNA试剂盒美国Promega公司 亚硫酸氢盐Sig-aldrich 对苯二酚Sig-aldrich 乙酸钠天津博迪化工 无水乙醇、异丙醇上海永大 蛋白酶K美国Sigma公司 琼脂糖西班牙进口分装 5-氮杂-2-脱氧胞苷美国Sigma公司 DNA Marker北京Solarbio技术有限公司 PCR引物北京赛百盛基因技术

46、有限公司 蓝色体系美国 Foments 公司 EB 北京鼎国生物技术有限公司 3 实验方法 3.1 食管癌细胞系的培养及处理 TE1、TE13、YES-2、Eca109、T.TN用含10%胎牛血清、100U/mL青霉 素、100g/ml链霉素、8%NaHCO3的RPMI 1640培养液，在37、CO2体积 分数为5%的条件下培养，细胞接种、传代和收集方法如下：取生长状态良 好，几乎接近汇合成片（80%汇合率）密度的，对数生长期的细胞，倒掉 旧的培养液；在每个培养瓶中加入2ml左右的PBS，洗涤3次，每瓶中加入2- 3ml的0.25%的胰酶，充分消化3-5分钟；然后加入等体积的的含10%FBS的

47、 1640培养液，离心，倒掉上层清液，在每个离心管内加1ml左右培养液，然 后将各管内的细胞悬液移至另一个离心管内后离心，去除上层清液，加入 适量培养液，混匀，稀释成三份，分别移至新的培养瓶内，混匀细胞，将 细胞悬液均匀铺在培养瓶内表面，将传代的细胞在于37、CO2体积分数 为5% 的条件下培养。次日观察，更换培养液。倒置显微镜观察细胞数量， 有无细胞融合。常规培养同时应用去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞（5-Aza-2- deoxycytidine，5-aza-dC）（浓度10mol/L）作用于TE1、TE13、YES- 2、Eca109、T.TN五株细胞系，24h更换一次培养液，抑制剂培养2

48、d后，第 3d换全血清培养液，24h后收集细胞，用于后续检测。 3.2 qRT-PCR方法检测miR-203a和miR-203b基因的表达 3.2.1 提取细胞/组织总RNA 取适量组织放入加好1ml Trizol研磨器中充分研磨用细胞刮子将培养瓶 中细胞全部刮下，移入EP管中PBS洗3遍后加入1ml Trizol 反复吹打混匀 （整个过程冰上操作，研磨器预冷） 加入200l的氯仿，震荡，冰上静置5min 12000rpm 4离心，15min 将上清至另一EP管中，加等体积异丙醇， 充分混匀后冰上静置10min 12000rpm/min 4离心15min 弃上清，加入400l 的75%乙醇 4

49、离心5min 弃上清，去除残留乙醇，在吸纸上晾干 加入适量0.1% DEPC溶解沉淀（即为提取的总RNA） ，-80保存备用 （整个操作过程需保持低温，避免RNA酶的污染） 3.2.2 RNA完整性的鉴定 提取的总RNA与上样缓冲液（0.25%溴酚兰，0.25二甲苯青FF，30%甘 油）按1: 5混匀，在1.5%琼脂糖凝胶（用电泳缓冲液配置，含0.5l/ml溴乙 锭）中电泳（电压120V电流60mA），电泳缓冲液为1TAE。待上样缓冲液 中的溴酚兰迁出一定距离后，停止电泳。将凝胶移至紫外透射仪下观察， RNA的电泳条带28s、18s、5s应清晰无降解。 3.2.3 mRNA的反转录 （1）按反

50、转录试剂盒配置12l反应体系 RNA3g 特异性茎环反转录引物1.0l 无菌水补到12l，于PCR 反应仪中70孵育5min。 （操作在冰上） ； 置冰上加 Nuclease-Free Water1.6l 5Reaction Buffer 4.0l MgCl2（25mM）2.0l 10mM dNTP Mix4.0l RNase Inhibitor(20g/l)1.0l ReverseTranscriptase(200g/l)1.0l (2) 反应条件：置于冰上加入以上试剂后，42 60min，25 5min，70 5min，4保存。 (3)取出反应产物cDNA，-20保存备用。 3.2.4 c

51、DNA的qRT-PCR扩增（引物序列见Table 4） (1) 反应体系 cDNA 2l qRT-PCR mix 10l 目的基因/U6上下游引物 各0.5l CXR0.2l 加去离子水补足20l (2) qRT-PCR反应条件：95预变性10 min；95变性15 s，55退火30 s，72延伸30 s，40个循环；72延伸7 min。每个样本设3个复孔。 3.2.5 miRNAs表达水平的结果判定 根据每孔荧光信号达到阈值时经历的循环数作为 Ct 值，以 U6 为内参， miRNAs 表达水平使用相对定量法，以 2Ct表 miRNAs 的相对表达量，其 中 Ct=CtmiR-203a 或

52、miR-203b CtU6。 3.3 甲基化特异性 PCR（MSP）方法检测 miR-203a 和 miR-203b 基因启动 子区甲基化状态 3.3.1 食管癌细胞系中 DNA 的提取 (1)常规培养五种细胞系，生长至 90%左右后，用 PBS 洗 5min3 次，加入 1 mlPBS 后，用细胞刮除器将细胞从培养瓶中分离，收集到 EP 管中， 12000rpm 离心 10min。 (2)倒掉上清，用PBS洗5min3次 (3)倒掉上清，加0.5ml DNA提取液，30l 10% SDS充分混匀，再加入12.5l 蛋白酶K溶液（终浓度为0.5mg/ml），置于58恒温箱内过夜。 (4)向每个

53、EP管中分别加等体积的PCI液（约0.5ml），震荡混匀后瞬时离心， 吸取上清溶液到一个新的EP管（约1ml），如有必要可重复抽取。 (5)加入1/10原始体积的乙酸钠（50l），加入2-2.5倍体积的100%乙醇，放 置在-20冰箱内，2小时以上。 (6)12000rpm离心15min，倒掉乙醇。 (7)加入70%乙醇1ml，12000rpm离心10分钟。 (8) 加合适体积的TE缓冲液小心悬浮团块，4过夜后，放入-20冰箱内保 存。 3.3.2食管癌组织中DNA的提取 (1)取合适大小新鲜组织，用剪刀剪成米粒大小后放于研磨器，加入组织消 化液 500l，置于冰上充分研磨后，倒入对应编码的大

54、 EP 管中，再在研磨 器中加入 500l 消化液，将研磨器中留的组织充分洗脱至大 EP 管，并加入 25l 蛋白酶 K 溶液（终浓度 0.5mg/ml），震荡后在 55水浴箱过夜。 (2)第二天早上 8 点和晚上六点加 25l 蛋白酶 K，颠倒混匀，然后放到水浴 箱过夜。 (3)分装后，向每个 EP 管中分别加等体积的 PCI 液（1ml），震荡混匀后瞬 时离心，吸取上清溶液到一个新的 EP 管（约 1ml）。 (4)加入 1/10 原始体积的乙酸钠（500l），加入 2-2.5 倍体积的 100%乙醇， 放置在-20冰箱内，2 小时以上。 (5)离心后，弃去乙醇。 (6)加入 70%乙醇

55、1ml，12000rpm 离心 10 分钟。 (7)加入少量的 TE 缓冲液（50100l），注意悬浮团块完全浸没在 TE 缓 冲液中，4过夜，-20保存。 (8)用紫外分光光度仪检测 DNA 光密度（D）值，计算 DNA 的浓度和纯度， 选取 A260 nm /A280 nm 的比值在 1.8-2.0 的标本进行分析。 3.3.3 DNA 甲基化修饰（亚硫酸氢盐处理） 3.3.3.1 亚硫酸氢盐处理的原理 单链 DNA 的没有发生甲基化胞嘧啶(C)可以在亚硫酸氢盐作用下脱氨 基而转变成尿嘧啶(U)，而发生了甲基化的胞嘧啶则不能转变为尿嘧啶。主 要过程：(1)磺化作用：亚硫酸氢钠使胞嘧啶发生磺

56、化。(2)脱氨基：磺化的 胞嘧啶在对苯二酚作用下脱去氨基。(3)脱磺化：在碱性条件下，磺化基团 被脱去，胞嘧啶转化成尿嘧啶。 3.3.3.2 实验步骤 DNA 亚硫酸氢盐转化 （1）使需要转化的 DNA 完全解冻，使亚硫酸氢盐溶液被完全溶解； （2）把亚硫酸氢盐反应的试剂（参照 Table 1）添加入 200l PCR 管中；顺 序依次添加反应成分； （3）合上 PCR 管，均匀混合上述反应物，室温（15-25）保存 PCR （4）使用 thermal cycler 进行亚硫酸氢盐转化参照 Table 2，设置 thermal cycler； （5）将含有亚硫酸氢盐转化的各种试剂的 PCR 管

57、放入 thermal cycler，启 动 PCR 仪。 亚硫酸氢盐转化后 DNA 的回收 （6）反应停止后，将含有反应物的 PCR 管瞬时离心，然后将反应物转移 到干净的 1.5ml EP 管中； （7）向每个样品中加入 carrier RNA 浓度 10ng/ml 新鲜配置的 Buffer BL 310l。通过涡旋震荡充分混合，简单离心； （8）向每个样品中加入 250l 乙醇（96-100）。震荡 20 秒完全混合，瞬 时离心来去除管壁上残留的液体； （9）准备必要数量的 MinElute DNA spin columns 和收集管，将步骤 8 的 混合物全部转移到 spin colum

58、n； （10）在最大转速下离心 spin columns 1 分钟后，将液体倒掉，将 spin column 再次放回到收集管； （11）向每个 spin column 中加入 500l Buffer BW(wash buffer)，12000rpm 离心 1 分钟，倒掉液体，将 spin column 放回到收集管； （12）向每个 spin column 中加入 500l Buffer BD，室温（15-25）放置 15 分钟； （13）在最大转速下离心 spin columns 1 分钟，将液体倒掉，将 spin column 重新放回到收集管； （14）向每个 spin column

59、中加入 500l Buffer BW(wash buffer)，载最大转 速下离心 1 分钟，将液体倒掉，将 spin column 再次放回到收集管； （15）重复步骤 14 一次； （16）向每个 spin column 中加入 250l 乙醇（96-100）。12000rpm 离心 1 分钟； （17）把 spin column 放到新的 2ml 收集管，12000rpm 离心 1 分钟，除去 任何残留液体； （18）把 spin column 放到干净的 1.5ml 离心管中。向每个 spin column 膜中 央直接加入 15l Buffer EB(elute buffer)小心合

60、上 column 的盖子； （19）室温下放置 spin columns 1 分钟； （20）在 12000 转速下离心 1min，将溶解的 DNA 被完全洗脱出来，放入 -20的冰箱保存，以备后用。 3.3.3.3 DNA 亚硫酸氢盐修饰完整性的判定 应用上下游引物中均不含 CG 位点的引物扩增修饰前与修饰后的同一 样品 DNA，若修饰后扩增出了目的条带而修饰前无任何目的条带扩增，则 说明亚硫酸氢盐修饰完全。 3.3.4 MSP 扩增过程 PCR 反应体系如下：（引物见 Table 4） 蓝色体系 10.0l 上游引物 1.0l 下游引物 1.0l DNA 模板 2l ddH2O 6l 反应