微生物遗传育种基因重组与育种

1、 重组与突变的不同点：重组与突变的不同点： 突变是指一个细胞的同一个基因组中某一突变是指一个细胞的同一个基因组中某一 点或某一点或某一DNA片段发生的变异；而重组是来自片段发生的变异；而重组是来自 两个细胞的不同基因组间遗传物质交换的结果，两个细胞的不同基因组间遗传物质交换的结果， 重组可在微生物细胞不发生突变的情况下形成重组可在微生物细胞不发生突变的情况下形成 新的基因型与表型。新的基因型与表型。 杂交（杂交（Hybridization）:是指不同基因型的亲本个体或是指不同基因型的亲本个体或 细胞（指单细胞生物）交配而产生子代的过程。细胞（指单细胞生物）交配而产生子代的过程。 重组是分子水平

2、上的概念，而杂交是细胞水平上的概念。重组是分子水平上的概念，而杂交是细胞水平上的概念。 杂交中必然含有重组，但重组则不限于杂交这一种形式。杂交中必然含有重组，但重组则不限于杂交这一种形式。 DNA （一）接合现象的发现（一）接合现象的发现 1946年，年，J. Lederberg和和 E. L. Tatum将将 来自来自E.coli K12的两种营的两种营 养缺陷型菌株养缺陷型菌株 混合培养，其混合培养，其 遗传标记如图。遗传标记如图。 结果在单独培结果在单独培 养的平板上无养的平板上无 菌落，而在混菌落，而在混 合培养的平板合培养的平板 上长出了原养上长出了原养 型菌落。型菌落。 对接合现象

3、的解释：对接合现象的解释： （1）可能是细菌接合后发生基因重组的结果；）可能是细菌接合后发生基因重组的结果； （2）细菌并没有接合，而是交换了）细菌并没有接合，而是交换了DNA（转化）；转化）； （3）细菌细胞并没有接合，而是通过培养基交换）细菌细胞并没有接合，而是通过培养基交换 了养料，即互养；了养料，即互养； （4）细菌细胞并没有接合，而是亲本细菌发生了）细菌细胞并没有接合，而是亲本细菌发生了 回复突变的结果；回复突变的结果； （5）虽经接合而未发生基因重组，只是形成异核）虽经接合而未发生基因重组，只是形成异核 体或杂合二倍体。体或杂合二倍体。 （二（二）接合作用的证明接合作用的证明 1、

4、转化作用的排除、转化作用的排除 由于在报道由于在报道 接合试验结果接合试验结果 之前转化实验之前转化实验 已经是众所周已经是众所周 知，因此有人知，因此有人 怀疑该结果是怀疑该结果是 由转化所导致由转化所导致 的。的。1950年，年， B.D.Davis设计设计 了了U形管实验否形管实验否 定了这一推测定了这一推测 （见右图）（见右图） 2、互养的排除、互养的排除 营养缺陷型细菌通过培养基交换养料而产生营养缺陷型细菌通过培养基交换养料而产生 的现象称为互养。的现象称为互养。 Lederberg 和和 Tatum将培养过一种营养缺陷型将培养过一种营养缺陷型 细菌的培养基经过灭菌、过滤，然后加入到

5、另一细菌的培养基经过灭菌、过滤，然后加入到另一 营养缺陷型菌培养物中。即使前一种菌在培养、营养缺陷型菌培养物中。即使前一种菌在培养、 灭菌、过滤之前曾发生过裂解，也不能是后一种灭菌、过滤之前曾发生过裂解，也不能是后一种 菌产生原养型。菌产生原养型。 3、回复突变的排除、回复突变的排除 若要发生两种突变的回复突变，其几率为若要发生两种突变的回复突变，其几率为10 12， ， 这是不可能的。这是不可能的。 4、异核体和杂合二倍体的排除、异核体和杂合二倍体的排除 A B AB A B AB A B 异核体异核体 杂合二倍体杂合二倍体单倍重组体单倍重组体 异核体和杂合二倍体的遗传性状不稳定，在传异核体

6、和杂合二倍体的遗传性状不稳定，在传 代过程中会发生性状分离，但事实恰恰相反，原代过程中会发生性状分离，但事实恰恰相反，原 养型菌落的基因型是稳定的，证明是单倍重组体。养型菌落的基因型是稳定的，证明是单倍重组体。 （三（三）接合的机制接合的机制 1、接合作用中两菌株性别的存在、接合作用中两菌株性别的存在 Lederberg 和和Tatum认为在两个细菌的亲本细胞认为在两个细菌的亲本细胞 在接合过程中起同等作用在接合过程中起同等作用即即E.coli 的性系统被认的性系统被认 为是同宗配合。为是同宗配合。 1952年，年，W. Hayes利用利用Lederberg 和和Tatum所做的所做的 杂交实

7、验，对（杂交实验，对（A）Met Bio（ （Sms或或Smr）（）（B） Thr LeuB1 （ （Smr或或Sms）进行研究。结果表明，进行研究。结果表明， 在杂交期间，两品系所起的作用是不同的，是一种在杂交期间，两品系所起的作用是不同的，是一种 单向异宗配合过程，两品系在获得的同时发生了性单向异宗配合过程，两品系在获得的同时发生了性 别的变化。其中，供体品系相当于雄性，而受体品别的变化。其中，供体品系相当于雄性，而受体品 系相当于雌性。系相当于雌性。 2、F因子的存在因子的存在 （1）E.coli 的某些种（如品系的某些种（如品系A）记为记为F ， ，带有一带有一 个性因子，或致育因子个

8、性因子，或致育因子F（fertility factor），），而另而另 一个不育型品系记作一个不育型品系记作F ， ，记不带有性因子；记不带有性因子； （2）杂交）杂交F F 是可育的，杂交 是可育的，杂交F F 是不育 是不育 的；的； （3）F因子可以传递，从因子可以传递，从F 到 到F 细菌，但必须通 细菌，但必须通 过细胞接触；过细胞接触； （4）F因子能够自发丧失，一旦丧失就不再恢复，因子能够自发丧失，一旦丧失就不再恢复， 除非通过另一个除非通过另一个F 细胞在传递过来。 细胞在传递过来。 F 细胞经低 细胞经低 浓度的吖啶橙处理后丧失浓度的吖啶橙处理后丧失F因子，也会偶尔自发地因子

9、，也会偶尔自发地 或经紫外线处理丧失。或经紫外线处理丧失。 3、F因子及因子及F 细胞的特性 细胞的特性 F 是一种可遗传性状，能够自我复制，类似于染色 是一种可遗传性状，能够自我复制，类似于染色 体基因，但不是染色体基因，其转移的频率可高达体基因，但不是染色体基因，其转移的频率可高达70 以上。以上。 F因子是独立于染色体外的小型环状因子是独立于染色体外的小型环状DNA分子，具有分子，具有 自体复制及转移到其他细胞中去的能力。自体复制及转移到其他细胞中去的能力。大小约是细菌大小约是细菌 基因组基因组DNA的的2，分子量为，分子量为6.3 106d、94.5kb。整个整个 基因组编码基因组编码

10、94个蛋白质，其中个蛋白质，其中13的基因与接合作用有的基因与接合作用有 关。关。 F因子基因组有三个主要的基因丛，分别负责插入、因子基因组有三个主要的基因丛，分别负责插入、 复制和转移的功能。复制和转移的功能。 A. 转移区（转移区（Transfer-region）：）：是一个操纵子，由是一个操纵子，由22 个基因组成，个基因组成，33kb，位于位于F因子结构图的因子结构图的6093kb之之 间。其中，间。其中，tra J、A、L、E、N、B、W、V、C、U、 F、H这些基因与性菌毛的合成与装配有关；这些基因与性菌毛的合成与装配有关；tra Y、Z、 M、I、G、D等基因产物与等基因产物与D

11、NA的转移有关；的转移有关；traG和和 traN的基因产物与细菌结合有关；的基因产物与细菌结合有关；traS和和traT的基因的基因 产物与表面排斥有关。产物与表面排斥有关。 B. 复制区（复制区（replication-region）：）：位于位于F因子结因子结 构图谱的构图谱的4049kb，包含一个特异的包含一个特异的复制蛋白基复制蛋白基 因因frp（F replication proteins）、）、决定不相容性决定不相容性 基因基因inc（incompatibility）和一个和一个复制起始点复制起始点 oriV（vegetative origin of replication）。）

12、。 C. 插入区（插入区（insertion region）：）：位于位于F因子结构图因子结构图 谱的谱的9317.6kb，包含四个插入序列，包含四个插入序列，IS3有直接有直接 重复的两个，另外两个是重复的两个，另外两个是IS2和和 ，它们主要与它们主要与F 因子的整合、切除、易位有关。因子的整合、切除、易位有关。 F因子的主要表现型是因子的主要表现型是细胞表面有性菌毛细胞表面有性菌毛，即，即 F 细胞表面都有性菌毛。 细胞表面都有性菌毛。F性菌毛分布在大肠杆性菌毛分布在大肠杆 菌的表面，数目与菌的表面，数目与F因子相当，长度为因子相当，长度为120um。 性菌毛的功能：性菌毛的功能：A.

13、是两性细胞接合时转移是两性细胞接合时转移 DNA的通道，又叫性纤毛桥（的通道，又叫性纤毛桥（sex pili bridge）；）； B. 又是特异又是特异phage吸附的部位。吸附的部位。 4、接合时、接合时DNA转移的机制转移的机制 接合时接合时DNA转移的机制目前不详，但可以确定转移的机制目前不详，但可以确定 的是：的是：在接合时，性菌毛的存在是必需的。在接合时，性菌毛的存在是必需的。 （四（四）F因子的三种存在形式因子的三种存在形式 1、 F ： ：F因子在细胞中以游离状态存在。因子在细胞中以游离状态存在。 2、Hfr（high frequency of recombination）:

14、F因因 子在细胞中以整合状态存在。子在细胞中以整合状态存在。 Hfr与与F 的异同： 的异同： （1） F 与 与Hfr均能与均能与F 菌株杂交； 菌株杂交； （2） F 与 与Hfr均能合成细胞表面附属物均能合成细胞表面附属物性菌毛；性菌毛； （3）Hfr菌株总是从菌株总是从F 菌株中得到，而 菌株中得到，而F 却从未在 却从未在Hfr菌株菌株 中得到过；中得到过； （4）Hfr经吖啶橙处理后性质不变，而经吖啶橙处理后性质不变，而F 经吖啶橙处理后失 经吖啶橙处理后失 去去F因子；因子； （5）Hfr与与F 杂交后， 杂交后， F 性质一般不会变；而 性质一般不会变；而F 与 与F 杂交 杂

15、交 后，后， F 变为 变为F 。 。 3、F ：携带有部分核染色体基因的携带有部分核染色体基因的F 因子，含因子，含 有有F 因子的菌株称为因子的菌株称为F 菌株。菌株。 （五（五）三种三种“雄性雄性”菌株与菌株与F 接合后的结果 接合后的结果 1、F F 2F 由性菌毛将不同接合型的的细菌连在一起，由性菌毛将不同接合型的的细菌连在一起， 并且在细胞间形成胞质桥（也称接合管）。在并且在细胞间形成胞质桥（也称接合管）。在 形成接合对以后，形成接合对以后，F 菌的 菌的F因子进行因子进行DNA滚环滚环 复制。单链转入复制。单链转入F 菌，并合成新的互补链。 菌，并合成新的互补链。 2、Hfr F

16、 Hfr F Hfr的染色体双链中的一条链在的染色体双链中的一条链在F因子处发生因子处发生 断裂，由环状变为线状，断裂，由环状变为线状，F因子则位于线状单链因子则位于线状单链 DNA的末端，整段线状染色体（单链）也以的末端，整段线状染色体（单链）也以5 末端引导，等速地转移至末端引导，等速地转移至F 细胞。 细胞。 通过接合而获得新性状的受体细胞称为接合子。通过接合而获得新性状的受体细胞称为接合子。 （conjugant） 3、F F 2F Hfr菌株的菌株的F因子的反常切除所形成的因子的反常切除所形成的F因子有两种类型：因子有两种类型： I 型：包含了染色体一个区域和不完全的型：包含了染色体

17、一个区域和不完全的F 因子。因子。 II型：带有完整的型：带有完整的F因子因子DNA和位于和位于F因子插入两端因子插入两端 的染色体基因。的染色体基因。 F 菌的共同特征菌的共同特征 （1）I 型型F 一般携带的基因是一般携带的基因是Hfr上的末端，这部分上的末端，这部分 基因在基因在Hfr F 时是低频转移的，而在 时是低频转移的，而在F F 时却 时却 是高频转移的。是高频转移的。 （2）II型型F 菌使本来转移频率差异悬殊的两部分基因菌使本来转移频率差异悬殊的两部分基因 具有相同的频率。具有相同的频率。 （3）F 菌的最大特点是能构建稳定的部分二倍体。菌的最大特点是能构建稳定的部分二倍体

18、。 F因子转导因子转导：通过：通过F 因子的转移而使受体菌改变因子的转移而使受体菌改变 它的遗传性状的现象称为它的遗传性状的现象称为F因子转导或因子转导或 或性因子转导或简称性导（或性因子转导或简称性导（F duction 或或 sex duction） 拟表型菌拟表型菌：指表型上属于：指表型上属于F 而遗传性上仍是而遗传性上仍是F 的菌，也就是说表面没有性菌毛，因而 的菌，也就是说表面没有性菌毛，因而 丧失了表面排斥性。丧失了表面排斥性。 （六（六）中断杂交实验中断杂交实验 原理：原理： 如果人为地中断正在基因转移的杂交对，然后测如果人为地中断正在基因转移的杂交对，然后测 定受体菌里遗传标记

19、重组频率，就能知道基因连锁定受体菌里遗传标记重组频率，就能知道基因连锁 情况。情况。 1957年，年，E.L.Wollman和和F.Jocob设计了中断杂交实验。设计了中断杂交实验。 供体菌供体菌Hfr，受体菌受体菌F thr leu lac gal azir tonr strr，将大约将大约10倍的倍的F 菌和 菌和Hfr对数期菌混合，轻轻振对数期菌混合，轻轻振 荡培养，在不同时间间隔取样，在组织搅拌器中剧烈荡培养，在不同时间间隔取样，在组织搅拌器中剧烈 振荡后，将培养物经适当稀释后，涂布在含链霉素且振荡后，将培养物经适当稀释后，涂布在含链霉素且 以葡萄糖作为碳源的基本培养基上进行选择。以葡

20、萄糖作为碳源的基本培养基上进行选择。 中断杂交实验中断杂交实验 中断杂交实验的结果：中断杂交实验的结果： 基因是以基因是以ori、thr、leu、azi、ton、lac、gal的的 顺序连续转移的。在这个实验中，对顺序连续转移的。在这个实验中，对Hfr菌的条件菌的条件 是，是，str基因在整个待测顺序的后端，如果基因在整个待测顺序的后端，如果strs基因基因 率先进入受体，获得的重组体将在第一次选择性率先进入受体，获得的重组体将在第一次选择性 培养基上被培养基上被str杀死。另外，杀死。另外，thr、leu选择性标记选择性标记 应位于前端，如位于后端则无法测序。应位于前端，如位于后端则无法测序

21、。 （一）放线菌基因重组的发现（一）放线菌基因重组的发现 1955年，年，Sermonti夫妇在天兰色链霉菌（夫妇在天兰色链霉菌（streptomyces coelicoler）ISS株中首次发现通过遗传性交换而产生的株中首次发现通过遗传性交换而产生的 重组，接着，重组，接着，Hopwood也用也用S.coelicoler A 3(2)发现了同样发现了同样 的重组。的重组。 （二）放线菌的性别（二）放线菌的性别 1、三种性别、三种性别 原始致育型（原始致育型（IF，initial fertility）：）：相当于相当于E.coli的的F 正常致育型（正常致育型（NF，normal fertil

22、ity）：）：相当于相当于E.coli的的Hfr 超致育型（超致育型（UF，ultra fertility）：）：相当于相当于E.coli的的F 2、认为、认为IF相当于相当于E.coli的的F 、 、UF相当于相当于E.coli的的F 的 的 理由理由 （1）IF以以0.3的频率转变为的频率转变为UF，在经在经uv处理的处理的IF群群 体中曾经得到作为受体高度可育的体中曾经得到作为受体高度可育的UF菌株，这种情况菌株，这种情况 类似于从类似于从F 菌株中得到 菌株中得到F 菌株； 菌株； （2）IFUF杂交中，杂交中，UF受体菌株全部转变为受体菌株全部转变为IF，而而 染色体基因重组频率大约

23、为染色体基因重组频率大约为10 4，两者相差万倍。这 ，两者相差万倍。这 种情况与种情况与F F 相似。 相似。 3、认为、认为NF相当于相当于Hfr的理由的理由 （1）IF和和NF都产生对于都产生对于UF菌株具有抑制作用的次甲菌株具有抑制作用的次甲 霉素，而霉素，而UF菌株则不产生这一抗菌素；菌株则不产生这一抗菌素； （2）IF UF杂交子代全部都是杂交子代全部都是IF，这种转变和染色这种转变和染色 体基因转移无关，但是体基因转移无关，但是NF UF杂交则不同，杂交则不同，UF转变转变 为为NF都伴随着染色体重组；都伴随着染色体重组； （3）NF菌株来自菌株来自IF或是或是IF的杂交子代，与

24、的杂交子代，与E.coli中的中的 一样。一样。 （三）放线菌的致育因子（三）放线菌的致育因子 经研究发现在经研究发现在S.coelicoler中存在着一种称为中存在着一种称为Scp1 的致育因子。的致育因子。 Scp1和和F因子一样也是一种质粒，具有因子一样也是一种质粒，具有 转移性，在自身转移的同时还能够带动染色体进行转移性，在自身转移的同时还能够带动染色体进行 转移。此外转移。此外Scp1还带有与产生次甲霉素有关的基因，还带有与产生次甲霉素有关的基因， Scp1属于附加体质粒。属于附加体质粒。 （四）天兰色链霉菌三种致育类型与大肠杆菌的（四）天兰色链霉菌三种致育类型与大肠杆菌的 三种致育

25、类型之间的区别三种致育类型之间的区别 1、大肠杆菌中、大肠杆菌中F F 是不育的，但在天兰色链霉菌 是不育的，但在天兰色链霉菌 中中UF UF是可育的，只是频率较低，说明还有另外是可育的，只是频率较低，说明还有另外 一种致育因子的存在；一种致育因子的存在； 2、大肠杆菌中、大肠杆菌中F F 或 或Hfr Hfr杂交的可育性很杂交的可育性很 低，除非使其中一个成为低，除非使其中一个成为 F 的拟表型，但在天兰色链 的拟表型，但在天兰色链 霉菌中霉菌中NF NF和和IF IF杂交中一部分是高度可育的；杂交中一部分是高度可育的； 3、大肠杆菌中、大肠杆菌中F F 的子代都是 的子代都是F 而 而Hf

26、r F 的 的 子代都是子代都是F ， ，但在天兰色链霉菌中但在天兰色链霉菌中IF UF的子代是的子代是 IF，NF UF的子代也是的子代也是NF。 Hfr细菌和细菌和F 细菌接触带来两个细菌细胞的接合和 细菌接触带来两个细菌细胞的接合和 染色体从染色体从Hfr细菌向细菌向F 细菌转移。因此，接合杂交是 细菌转移。因此，接合杂交是 确定特定基因的粗略位置的有效方法，也是育种的一确定特定基因的粗略位置的有效方法，也是育种的一 种手段。种手段。 一般采用液体接合培养法，在接合时注意通气和选一般采用液体接合培养法，在接合时注意通气和选 择标记。选择性标记可以用抗性标记，也可以用营养择标记。选择性标记

27、可以用抗性标记，也可以用营养 缺陷型。缺陷型。 转化（转化（transformation）：受体细胞直接吸收受体细胞直接吸收 来自供体细胞的离体来自供体细胞的离体DNA片段，并通过交换把片段，并通过交换把 它整合到自己的基因组中，从而获得了供体细它整合到自己的基因组中，从而获得了供体细 胞的某些遗传性状的现象。获得新性状的受体胞的某些遗传性状的现象。获得新性状的受体 称为转化子（称为转化子（transformant）。）。 转化不是两个细胞的直接接触，而是供体细胞的转化不是两个细胞的直接接触，而是供体细胞的 离体离体DNA与受体细胞直接接触而转移遗传物质。与受体细胞直接接触而转移遗传物质。 转

28、化包括两个基本过程转化包括两个基本过程 （1）从供体菌中提取遗传物质）从供体菌中提取遗传物质DNA并转移到受体中；并转移到受体中； （2）供体的遗传物质在受体中的作用。）供体的遗传物质在受体中的作用。 （一）转化（一）转化DNA的特点的特点 1、转化子的数目与、转化子的数目与DNA浓度的关系浓度的关系 在一定条件下转化子的数目与转化在一定条件下转化子的数目与转化DNA的浓度成正比。的浓度成正比。 细菌生长量细菌生长量 每毫升中转化子数每毫升中转化子数 104 105 103 102102 20 40 60 80 100 120 10 100 培养时间培养时间 每毫升中转化子数每毫升中转化子数

29、10 3 10 2 10 1 DNA 转化的饱和浓度转化的饱和浓度 2、DNA片段的大小与转化子数目的关系片段的大小与转化子数目的关系 对于转化作用来说，转化对于转化作用来说，转化DNA片段必须具有一定片段必须具有一定 的大小。一般认为，转化的大小。一般认为，转化DNA片段的大小没有上限，片段的大小没有上限， 但是在制备转化子过程中，往往人工打断供体但是在制备转化子过程中，往往人工打断供体DNA 分子，获得的片段约分子，获得的片段约107dal（大约大约10个基因左右）。个基因左右）。 在受体细胞摄取在受体细胞摄取DNA时，可能还会进一步断裂，所时，可能还会进一步断裂，所 以仅仅有大约以仅仅有

30、大约0.5的供体基因组能够进入受体细胞。的供体基因组能够进入受体细胞。 能发生转化作用的核苷酸链至少不低于能发生转化作用的核苷酸链至少不低于450bp。 3、单双链、单双链DNA与转化活性的关系与转化活性的关系 单链单链DNA的转化活性低，而双链的转化活性低，而双链DNA的转化活的转化活 性高。因而，性高。因而，DNA完整的双链结构对于转化活性完整的双链结构对于转化活性 来说是必要的。来说是必要的。 4、转化、转化DNA的命运的命运 大量的实验证明，在转化作用中遗传重组是由大量的实验证明，在转化作用中遗传重组是由 供体的单链序列取代了受体供体的单链序列取代了受体DNA的单链序列，使的单链序列，

31、使 受体的受体的DNA标记变成了供体的遗传标记，并恒定标记变成了供体的遗传标记，并恒定 表达，遗传给它的后代。表达，遗传给它的后代。 （二）受体细胞的特点（二）受体细胞的特点 1、受体细胞的感受态、受体细胞的感受态 （1）概念）概念 只有在某一特定条件下培养的部分细胞才有吸收只有在某一特定条件下培养的部分细胞才有吸收 DNA的能力，这种细胞称为感受态细胞。这种感受态的能力，这种细胞称为感受态细胞。这种感受态 细胞所处的状态称为感受态（细胞所处的状态称为感受态（competence）。）。 （2）感受态的特点和影响因素）感受态的特点和影响因素 特点：感受态不是一种透性特征，而是在适当的特点：感受

32、态不是一种透性特征，而是在适当的 生长条件下获得的一种生理特征生长条件下获得的一种生理特征 影响因素：影响因素： a. 受菌龄的影响：一般认为感受态出现在细菌生长受菌龄的影响：一般认为感受态出现在细菌生长 对数期的后期；对数期的后期； b. 受遗传因素的影响；受遗传因素的影响； c. 受环境条件的影响。受环境条件的影响。 2、感受态的比例、感受态的比例 不同的细菌的感受态的比例是不同的，一般为不同的细菌的感受态的比例是不同的，一般为 1020。 3、感受态可在细胞间转移、感受态可在细胞间转移 4、感受态因子（、感受态因子（CF） 1963年，年，R.Pakula 和和 W.Walczak 首次

33、从链球菌中首次从链球菌中 分离得到；分离得到；1972年，年，Leonard 和和 Cale 纯化的一种蛋白纯化的一种蛋白 质，称为质，称为CF。该蛋白质在感受态转移中起作用。该蛋白质在感受态转移中起作用。 在感受态细胞表面存在着一种特定的抗原，而非感在感受态细胞表面存在着一种特定的抗原，而非感 受态细胞则没有这种抗原。细菌细胞在特定的时期产生受态细胞则没有这种抗原。细菌细胞在特定的时期产生 一种感受态因子（一种感受态因子（CF），），CF与膜上的受体结合，刺激与膜上的受体结合，刺激 核内核内DNA产生另一个蛋白产生另一个蛋白自溶素（自溶素（Autolysin），），自自 溶素转运至细胞膜和细

34、胞壁之间的周质内作用于细胞膜，溶素转运至细胞膜和细胞壁之间的周质内作用于细胞膜， 并改变膜的成分，使细胞膜便于并改变膜的成分，使细胞膜便于DNA的吸收。的吸收。 （一）转化技术用于基因定位（一）转化技术用于基因定位 在转化过程中，两个连锁的基因可以同时转化，在转化过程中，两个连锁的基因可以同时转化， 但能够同时转化的基因却不一定是连锁的，因为包但能够同时转化的基因却不一定是连锁的，因为包 含这两个基因的含这两个基因的DNA片段可以同时被受体细菌所吸片段可以同时被受体细菌所吸 收。收。 如果如果a+和和b+是连锁的，那么当是连锁的，那么当DNA浓度下降时，浓度下降时， a+ b+转化频率的下降与

35、转化频率的下降与a+或或b+的转化频率下降相同；的转化频率下降相同； 相反，如果相反，如果a+ 和和b+并不连锁，那么并不连锁，那么a+ b+转化频率下降转化频率下降 将远远超过将远远超过a+ 或或b+的转化频率。这是因为在的转化频率。这是因为在DNA低浓低浓 度范围内，转化子的产生与度范围内，转化子的产生与DNA的浓度成正比。当的浓度成正比。当 a+ 、 b+两个基因位于同一两个基因位于同一DNA片段上是，片段上是， a+ b+转化转化 子与子与DNA浓度成正比的增加；当浓度成正比的增加；当a+ b+基因分别位于不基因分别位于不 同的同的DNA片段上是，在一定的片段上是，在一定的DNA浓度内

36、，浓度内， a+ b+转转 化子与化子与DNA浓度的平方成正比。通过这样的实验检浓度的平方成正比。通过这样的实验检 测转化基因的连锁情况可以方便的绘制出遗传图谱。测转化基因的连锁情况可以方便的绘制出遗传图谱。 以以trp+和和tyr+ DNA作为供体作为供体 q trp+ tyr trp tyr + trp+ tyr trp+ tyr +trp tyr + 共转指数：共转指数： 如将如将DNA加入到受体菌中，会产生、和三种加入到受体菌中，会产生、和三种 转化子，将型转化子在其中所占的比例称为共转化子，将型转化子在其中所占的比例称为共 转指数（转指数（cotransfer index） 共转指数

37、共转指数 a+ b+ a+ b+a b+ a+ b （二（二）转化育种转化育种 利用在转化过程中供体菌可将遗传性状传递给利用在转化过程中供体菌可将遗传性状传递给 受体菌的这种特性，育种工作者可以采用转化的方受体菌的这种特性，育种工作者可以采用转化的方 法达到育种的目的。法达到育种的目的。 通过完全缺陷或部分缺陷的噬菌体为媒介，把通过完全缺陷或部分缺陷的噬菌体为媒介，把 供体细胞的供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换片段携带到受体细胞中，通过交换 和整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，和整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象， 称为转导（称为转导（transduction）

38、。）。获得新性状的受体细获得新性状的受体细 胞就称为转导子（胞就称为转导子（transductant）。）。 转导有两种类型，即普遍转导和局限转导。转导有两种类型，即普遍转导和局限转导。 1952年，年，N.Zinder 和和 Lederberg 在研究鼠伤寒沙门在研究鼠伤寒沙门 氏菌遗传重组时，采用两种营养缺陷型菌：氏菌遗传重组时，采用两种营养缺陷型菌： LA2: phe+ trp+ met his LA22: phe trp met+ his+ 在将两者混合培养后获得了原养型。同时，再将两在将两者混合培养后获得了原养型。同时，再将两 者放入者放入Davis管中培养时仍出现重组体，这就证明在

39、两管中培养时仍出现重组体，这就证明在两 株菌之间有一种过滤性因子起作用。株菌之间有一种过滤性因子起作用。 过滤性因子是噬菌体（过滤性因子是噬菌体（phage）的证明：的证明： a. 过滤性因子不会因过滤性因子不会因 DNase 处理而失去活性，说明它处理而失去活性，说明它 不是裸露在溶液中的不是裸露在溶液中的DNA，故可以排除转化作用，故可以排除转化作用， 另外由于两个菌是隔离培养的因而也可以排除接合另外由于两个菌是隔离培养的因而也可以排除接合 作用；作用； b. 过滤性因子与从溶源性菌分离到的噬菌体过滤性因子与从溶源性菌分离到的噬菌体P22具有相具有相 同大小的质量；同大小的质量； c. 用

40、抗用抗P22的血清或加热处理，使的血清或加热处理，使P22的感染性和过滤的感染性和过滤 性因子的功能失活的速率相同；性因子的功能失活的速率相同； d. 抗抗P22的沙门氏菌菌株同时也对过滤性因子表现为抗的沙门氏菌菌株同时也对过滤性因子表现为抗 性。性。 因此可以证明：过滤性因子就是温和型噬菌体因此可以证明：过滤性因子就是温和型噬菌体P22。 通过完全缺陷的通过完全缺陷的phage 对供体菌任何对供体菌任何DNA 小片段的小片段的“误包误包”，而实现其遗传性状传递至，而实现其遗传性状传递至 受体菌的转导现象，称为普遍性转导。受体菌的转导现象，称为普遍性转导。 （一（一）完全普遍转导完全普遍转导

41、噬菌体在进行包装时，有极少数噬菌体在进行包装时，有极少数phage（10 6 10 8） ）的衣壳将与头部的衣壳将与头部DNA相仿的一小段供体相仿的一小段供体DNA 片段误包在内，形成完全不含片段误包在内，形成完全不含phage 自身自身DNA的假的假 噬菌体，这种假噬菌体称为完全缺陷噬菌体。噬菌体，这种假噬菌体称为完全缺陷噬菌体。 由完全缺陷噬菌体介导的普遍性转导称为完全普由完全缺陷噬菌体介导的普遍性转导称为完全普 遍转导。遍转导。 （二（二）流产普遍转导流产普遍转导 简称流产转导（简称流产转导（abortive transduction）。）。经转经转 导而获得了供体菌导而获得了供体菌DN

42、A片段的受体菌，如果其外源片段的受体菌，如果其外源 DNA在体内既不进行交换、整合、复制，也不迅速在体内既不进行交换、整合、复制，也不迅速 消失，而进行转录、转译及性状表达，这种现象称消失，而进行转录、转译及性状表达，这种现象称 为流产转导。为流产转导。 流产转导的受体菌可以在选择性培养基上形成微流产转导的受体菌可以在选择性培养基上形成微 小的菌落。小的菌落。 指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌 的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表 达的转导现象。达的转导现象。 特点：特点：1、只能是个别特定基因；、只能是个别特定基因；

43、 2、该特定基因由部分缺陷噬菌体携带；、该特定基因由部分缺陷噬菌体携带； 3、缺陷噬菌体是由于在其形成过程中所发生、缺陷噬菌体是由于在其形成过程中所发生 的低频率的低频率“误切误切”或由于双重溶源菌的裂解而或由于双重溶源菌的裂解而 形形 成。成。 局限转导局限转导 （一（一）低频转导（低频转导（LFT，low frequency transduction） 由于宿主染色体上进行不正常的切离的频率极由于宿主染色体上进行不正常的切离的频率极 低，因此在裂解物中所含的部分缺陷低，因此在裂解物中所含的部分缺陷phage的比例的比例 也极低。这种裂解物称为也极低。这种裂解物称为LFT裂解物。裂解物。LF

44、T裂解物裂解物 在低在低m . o . i .情况下感染宿主，可获得极少量的局情况下感染宿主，可获得极少量的局 限转导，这就是低频转导。限转导，这就是低频转导。 m . o . i . ： 称作感染复数，是指每一个敏感细胞所能吸附的称作感染复数，是指每一个敏感细胞所能吸附的 相应相应phage的数量。的数量。 （二（二）高频转导（高频转导（HFT，high frequency transduction） 双重溶源菌：双重溶源菌： 在高在高m . o . i .情况下，受体菌会同时吸附缺陷情况下，受体菌会同时吸附缺陷 型型phage和完整和完整phage，并且可以同时整合在受体并且可以同时整合在

45、受体 菌的核染色体组上，这时的受体菌称为双重溶源菌的核染色体组上，这时的受体菌称为双重溶源 菌。此时，正常的菌。此时，正常的phage称为助体称为助体phage。由双重由双重 溶源菌形成的裂解物称为溶源菌形成的裂解物称为HFT裂解物。裂解物。 高频转导：高频转导： 用低用低m . o . i .的的HFT裂解物去感染受体细胞，裂解物去感染受体细胞， 则可高频率的发生局限转导，这就是高频转导。则可高频率的发生局限转导，这就是高频转导。 普遍性转导噬菌体通常可以用于绘制供体菌遗传图谱。普遍性转导噬菌体通常可以用于绘制供体菌遗传图谱。 应用于基因定位的共转导现象：应用于基因定位的共转导现象： P1噬

46、菌体的基因组约为染色体长度的噬菌体的基因组约为染色体长度的2.4，P1噬菌体感噬菌体感 染染E.coli后可以随意包裹寄主后可以随意包裹寄主DNA片段，只要这个片段包含的片段，只要这个片段包含的 基因座位不超过基因座位不超过E.coli遗传图谱的两分钟距离，均可一起被转遗传图谱的两分钟距离，均可一起被转 导，这是一般用接合和转化作用来进行基因定位所难以实现的，导，这是一般用接合和转化作用来进行基因定位所难以实现的， 对细菌染色体小片段的精细结构十分有用。对细菌染色体小片段的精细结构十分有用。 两个邻近的基因一起被转导的现象称为两个邻近的基因一起被转导的现象称为共转导（共转导（co transd

47、uction)。 当转导的当转导的DNA片段进入受体后，与受体同源分子进行重片段进入受体后，与受体同源分子进行重 组，当另一个基因的标记被选择时，那么另一个邻近基因的发组，当另一个基因的标记被选择时，那么另一个邻近基因的发 现频率随着它们二者之间距离的减少而增大，这个频率称为现频率随着它们二者之间距离的减少而增大，这个频率称为共共 转导频率（转导频率（cotransduction frequency）。）。 用下式表示：用下式表示： F（1dL）3 d为两个基因之间的距离，为两个基因之间的距离，L是是P1基因组或转导片段长度基因组或转导片段长度 （在遗传图谱上用分钟表示）。（在遗传图谱上用分钟

48、表示）。 比如：有两个基因的共转导频率是比如：有两个基因的共转导频率是65，L为为2分钟（约分钟（约 76kb）。）。 这两个基因之间的距离为这两个基因之间的距离为0.26分钟（约分钟（约10kb）。）。 利用转导法选育目的菌，首要的任务是要利用转导法选育目的菌，首要的任务是要获得转导噬菌体获得转导噬菌体。 转导噬菌体的获得：转导噬菌体的获得： 噬菌体侵染供体菌后，在感染末期，少数噬菌体会将供体菌噬菌体侵染供体菌后，在感染末期，少数噬菌体会将供体菌 的的DNA误认为是它们自己的误认为是它们自己的DNA，并以其外壳蛋白将细菌，并以其外壳蛋白将细菌DNA 包围起来，从而形成转导噬菌体。包围起来，从

49、而形成转导噬菌体。 由于细菌由于细菌DNA的任何部分都可以被包装，因此，要获得目的任何部分都可以被包装，因此，要获得目 的转导子必须要通过那些选择性标记。的转导子必须要通过那些选择性标记。 转导育种的过程转导育种的过程 操作过程如下：操作过程如下： 先将供体菌培养至对数生长期，然后向其中加入噬菌先将供体菌培养至对数生长期，然后向其中加入噬菌 体，继续培养是一部分供体菌发生裂解反应而释放出转导体，继续培养是一部分供体菌发生裂解反应而释放出转导 噬菌体。加入氯仿以杀死仍活着的供体菌，待完全溶菌后噬菌体。加入氯仿以杀死仍活着的供体菌，待完全溶菌后 低速离心以除去菌体残渣，上清液经低速离心以除去菌体残

50、渣，上清液经Dnase处理和微孔滤处理和微孔滤 膜除菌后，即制成供体菌裂解液。膜除菌后，即制成供体菌裂解液。 将受体菌培养至对数生长期，向其中加入供体菌裂解将受体菌培养至对数生长期，向其中加入供体菌裂解 液，待转导噬菌体吸附后，低速离心收集菌体。将该菌体液，待转导噬菌体吸附后，低速离心收集菌体。将该菌体 转移到选择培养基平板上，培养即可从中获得目的转导子。转移到选择培养基平板上，培养即可从中获得目的转导子。 首先要进行噬菌体效价的测定。所谓噬菌体效价就是首先要进行噬菌体效价的测定。所谓噬菌体效价就是 1ml培养液中含有活噬菌体的数目。培养液中含有活噬菌体的数目。 所谓所谓原生质体融合原生质体融

51、合，就是将双亲株的微生物细胞分别通，就是将双亲株的微生物细胞分别通 过酶解脱壁，使之成为原生质体。然后在高渗的条件下混合，过酶解脱壁，使之成为原生质体。然后在高渗的条件下混合， 并加入物理的、化学的、生物的助融条件，使双亲株的原生并加入物理的、化学的、生物的助融条件，使双亲株的原生 质体间发生相互凝集。通过细胞质融合、核融合，而后发生质体间发生相互凝集。通过细胞质融合、核融合，而后发生 基因组间的交换、重组，进而可以在适宜的条件下再生出微基因组间的交换、重组，进而可以在适宜的条件下再生出微 生物的细胞壁来，从而获得重组子的过程。生物的细胞壁来，从而获得重组子的过程。 狭义的原生质体（狭义的原生

52、质体（protoplast）即细胞壁被彻底酶解完全）即细胞壁被彻底酶解完全 脱壁后形成的脱壁后形成的 1、原生质体、原生质体 广义的原生质体既包括狭义的原生质体也包括不完全脱广义的原生质体既包括狭义的原生质体也包括不完全脱 壁后形成的圆球体（壁后形成的圆球体（spheroplast） 物理的物理的 ：瞬时高压的交变电场或激光等：瞬时高压的交变电场或激光等 2、助融条件、助融条件 化学的：聚乙二醇、二甲亚砜、伴刀豆球蛋白化学的：聚乙二醇、二甲亚砜、伴刀豆球蛋白A、磷、磷 脂酰丝氨酸、溶血卵磷脂等脂酰丝氨酸、溶血卵磷脂等 生物的：仙台病毒、鸡新城疫病毒、等生物的：仙台病毒、鸡新城疫病毒、等 关于原

53、生质体概念的解释：关于原生质体概念的解释： 生物工程生物工程 （biotechnology） 细胞工程细胞工程 基因工程基因工程 酶工程酶工程 发酵工程发酵工程 固定化细胞固定化细胞 基因体外重组基因体外重组 染色体移植或引入染色体移植或引入 细胞器移植细胞器移植 核移植核移植 固定化酶固定化酶 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰 发酵自动化发酵自动化 产品后处理产品后处理 泛指遗传工程泛指遗传工程 组织培养组织培养 原生质体融合原生质体融合 1、原生质体融合是一种更为广泛，更为随机的基因重组方式；、原生质体融合是一种更为广泛，更为随机的基因重组方式； 2、原生质体融合方式，可以打破微生物的

54、种属界限，实现远缘菌、原生质体融合方式，可以打破微生物的种属界限，实现远缘菌 株间的基因重组；株间的基因重组； 3、原生质体融合可以使遗传物质传递更为完全，可以获得更多基、原生质体融合可以使遗传物质传递更为完全，可以获得更多基 因重组的机会，有利于提高育种速度；因重组的机会，有利于提高育种速度； 4、借助融合剂可同时将几个亲本的原生质体随即融合在一起，从、借助融合剂可同时将几个亲本的原生质体随即融合在一起，从 而获得综合几个亲本性状的重组体，加速育种进程；而获得综合几个亲本性状的重组体，加速育种进程； 5、原生质体融合可以和其它育种方法相结合，把从其它方法得到、原生质体融合可以和其它育种方法相

55、结合，把从其它方法得到 的优良性状通过原生质体融合在组合到一个单株中，提高菌株的优良性状通过原生质体融合在组合到一个单株中，提高菌株 产量的几率增大；产量的几率增大； 6、原生质体融合可以大大提高遗传重组的频率；、原生质体融合可以大大提高遗传重组的频率； 7、在生产菌种的选育中，可以应用具有较高产量性状的菌株作为、在生产菌种的选育中，可以应用具有较高产量性状的菌株作为 融合时出发菌株，以期达到理想育种的目的；融合时出发菌株，以期达到理想育种的目的； 8、可以应用灭活的原生质体进行融合，从而提高筛选效率，省去、可以应用灭活的原生质体进行融合，从而提高筛选效率，省去 育种过程中对亲株的遗传标记，省

56、去人力、物力和时间，也可育种过程中对亲株的遗传标记，省去人力、物力和时间，也可 防止因增加标记而降低出发菌株的产量；防止因增加标记而降低出发菌株的产量； 9、原生质体技术有助于建立工业微生物的转化体系，开辟新的育、原生质体技术有助于建立工业微生物的转化体系，开辟新的育 种途径；种途径； 10、对微生物制备原生质体后直接再生育种、原生质体诱变后再、对微生物制备原生质体后直接再生育种、原生质体诱变后再 生育种、原生质体转化育种、原生质体转导育种、原生质体固生育种、原生质体转化育种、原生质体转导育种、原生质体固 定化等原生质体技术在微生物育种与工业生产中近年来已日趋定化等原生质体技术在微生物育种与工

57、业生产中近年来已日趋 广泛开展；广泛开展； 11、在理论上，微生物的原生质体融合可用于研究噬菌体与寄主、在理论上，微生物的原生质体融合可用于研究噬菌体与寄主 间的关系，深入了解溶源机理及免疫因子和存在部位；研究原间的关系，深入了解溶源机理及免疫因子和存在部位；研究原 噬菌体的噬菌体的DNA在寄主染色体上的结合位点；在寄主染色体上的结合位点； 12、在细胞学研究方面，通过原生质体融合，有助于研究核质关、在细胞学研究方面，通过原生质体融合，有助于研究核质关 系及细胞质遗传问题；系及细胞质遗传问题； 13、微生物原生质体融合，可用于遗传性分析等理论研究。、微生物原生质体融合，可用于遗传性分析等理论研

58、究。 （1）标记菌株的筛选；）标记菌株的筛选； （2）原生质体的制备；）原生质体的制备； （3）原生质体的再生；）原生质体的再生； （4）原生质体的融合；）原生质体的融合； （5）融合子的选择；）融合子的选择； （6）实用型菌株的筛选。）实用型菌株的筛选。 原生质体融合一般包括如下步骤：原生质体融合一般包括如下步骤： B AA B a+b- a-b+ 菌株标记菌株标记 细胞壁细胞壁 溶菌酶溶菌酶 A B 细胞膜细胞膜 加加PEG 混合混合融融 合合 的的 原原 生生 质质 体体 转再生平皿转再生平皿 2 B A 1 3 4 筛选融合子筛选融合子 温浴温浴 稳定高产重组子稳定高产重组子 标记的标

59、记的 营养体细胞营养体细胞 原生质体原生质体 1a+b- 2a+b+ 3a-b- 4a-b+ 原生质体的形成原生质体的形成 融合融合CW再生再生 稳定稳定 正变株的筛选正变株的筛选 细胞原生质体融合程序示意图细胞原生质体融合程序示意图 （一）标记菌株的筛选（一）标记菌株的筛选 在原生质体融合过程中，为了便于筛选，通常在原生质体融合过程中，为了便于筛选，通常 对于所用的对于所用的亲株亲株都要进行一定的遗传标记。都要进行一定的遗传标记。 一般可以采用一般可以采用营养缺陷标记营养缺陷标记和和抗药性标记抗药性标记。 （二）原生质体的制备（二）原生质体的制备 在细菌和放线菌中主要采用溶菌酶在细菌和放线菌

60、中主要采用溶菌酶； 在酵母菌和霉菌中一般可用蜗牛酶和纤维在酵母菌和霉菌中一般可用蜗牛酶和纤维 素酶。素酶。 影响原生质体制备的因素影响原生质体制备的因素 1、菌体的预处理、菌体的预处理 为了使酶的作用效果更好一些，可对菌体进行为了使酶的作用效果更好一些，可对菌体进行 预处理，包括菌体培养阶段的预处理和酶解前的预处理，包括菌体培养阶段的预处理和酶解前的 预处理。预处理。 对于细菌可加入甘氨酸、青霉素和对于细菌可加入甘氨酸、青霉素和D环丝氨环丝氨 酸等，对于放线菌可以使用甘氨酸（酸等，对于放线菌可以使用甘氨酸（14）等，）等， 在酵母菌中加入在酵母菌中加入EDTA和巯基乙醇等。和巯基乙醇等。 2、